БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1999 года по МПК C02F3/34 B09C1/10 

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов и может быть использовано, например, при ликвидации последствий нефтяных разливов.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, содержащий аэробные нефтеокисляющие бактерии Acenitobacter oleovorum, остатки питательных сред, стабилизирующие добавки, минеральные соли и различные наполнители, см. "Препарат бактериальный Биоприн - Б", технические условия ТУ - оп. 11249895- 12-22-92, М., 1992 (копия прилагается).

Недостатком этого препарата является необходимость наличия стабилизирующих добавок для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов. Кроме того, бактерии Acenitobacter oleovorum недостаточно активно утилизируют тяжелые фракции нефти.

Известен также биопрепарат для очистки объектов окружающей среды, преимущественно почвы и воды, включающий нефтеокисляющие бактерии, например, Mycobacterium, углеводородные добавки - нормальные парафины - C₁₂ - C₁₈, минеральные добавки - щавелевокислый аммоний и воду в качестве наполнителя, см. , например, патент Российской Федерации N 2053206 по кл. C 02 F 3/34 от 29.09.94 г.

Данный биопрепарат принят в качестве прототипа настоящего изобретения.

Его недостатком является узкий диапазон температуры, при которой происходит активное окисление углеводородов нефти. Биопрепарат имеет достаточную активность только при Т = 20-40^oC, что резко сужает возможность его применения в условиях северных регионов.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, имеющего более широкий диапазон температуры, при которой происходит их активное окисление.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что в биопрепарате для очистки от нефти и нефтепродуктов, включающем аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель, в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум мезофильных бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ K_o-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ K_y- 1 и консорциум психрофильных бактериальных штаммов Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-З, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8, Xantho-monas species ПИ ЛБХ-7 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Pseudomonas putida ПИ K_o-1 - 1 - 10
Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - 1 - 10
Micrococcus species ПИ K_y-1 - 1 - 10
Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3 - 1 - 10
Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8 - 1 - 10
Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7 - 1 - 10
Минеральные добавки:
Источник азота - 0,25 - 0,75
Источник фосфора - 0,15 - 0,50
Источник калия - 0,1 - 0,25
Наполнитель - Остальное
Чистые культуры микроорганизмов выделены из почв, загрязненных нефтепродуктами, на селективных питательных средах, содержащих в качестве единственного источника углеродного питания углеводороды нефтепродуктов. Штаммы зарегистрированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского института защиты растений КМЗР ВИЗР-760. Штаммы хранятся отдельно на агаризованной питательной среде (МПА или СПА) при температуре +0 - +5^oC или в лиофилизированном состоянии в ампулах.

В первом конкретном примере биопрепарат содержит бактериальные штаммы: Pseudomonas putida ПИ Ко-1 - 7 мас.%, Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - 7 мас. %, Micrococcus species ПИ K_y-1 -7 мас.%., Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3 - 7 мас.%., Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8 - 7 мас.%, Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7 - 5 мас.%.

Штамм Pseudomonas putida ПИ K_o-1 - мелкие короткие прямые подвижные одиночные палочки, имеют полярные жгутики, размеры: (0,2-0,3) х (0,5 - 0,8) мкм; грам (-); аэроб. Колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слегка приподнятые в центре, желтоватые, полупрозрачные, диаметром 4 - 6 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует флюоресцирующие пигменты, аргениндигидролазу, не разжижает желатину, не гидролизует крахмал, оксидазная реакция положительна. Использует в качестве источников роста глюкозу, 2-кетоглюконат, L-валин, β -аланин, DL-аргинин, углеводороды.

Штамм Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - мелкие короткие одиночные палочки, имеют полярные жгутики, размеры: (0,1- 0,4) х (0,6 - 0,7) мкм; грам (-), аэроб. Колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слабовыпуклые, полупрозрачные, бесцветные, диаметром 3 - 5 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует флюоресцирующие пигменты, оксидазная реакция положительна, гидролизует желатину, не гидролизует крахмал, образует аргининдигролазу. Использует в качестве источников роста глюкозу, трегалозу, 2-кетоглюконат, мезо-инозит, углеводороды, L- арабинозу, сахарозу, этиловый спирт.

Штамм Micrococcus species ПИ K_y - 1 - кокки, сферические неподвижные клетки, диаметром 0,6-1,0 мкм; образуют неправильные группы или встречаются поодиночке. Колонии штамма круглые с ровным краем, теплого цвета, непрозрачные, гладкие, блестящие, диаметром 2-5 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует желтый пигмент, не гидролизует крахмал, не образует индол, образует гидролазы. Использует в качестве источников роста глюкозу, L-валин, β -аланин, углеводороды.

Штамм Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3 - мелкие короткие одиночные палочки, имеют полярные жгутики, размеры: (0,25 - 0,35) х (0,55- 0,65) мкм; грам (-), аэроб. Колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слабовыпуклые, полупрозрачные, бесцветные, диаметром 4 - 6 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует флюоресцирующие пигменты, оксидазная реакция положительна, гидролизует желатину, не гидролизует крахмал, образует аргининдигролазу. Использует в качестве источников роста глюкозу, трегалозу, 2-кетоглюконат, мезо-инозит, углеводороды, L-арабинозу, сахарозу, этиловый спирт.

Штамм Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8 - мелкие короткие прямые подвижные одиночные палочки, имеют полярные жгутики, размеры: (0,15 - 0,25) х (0,45 - 0,75) мкм; грам (-); аэроб. Колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слегка приподнятые в центре, желтоватые, полупрозрачные, диаметром 5 - 7 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует флюоресцирующие пигменты, аргениндигидролазу, не разжижает желатину, не гидролизует крахмал, оксидазная реакция положительна. Использует в качестве источников роста глюкозу, 2-кетоглюконат, L- валин, β -аланин, DL-аргинин, углеводороды.

Штамм Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7- одиночные прямые палочки, размеры: (0,2-0,25) х (0,6 - 1,0) мкм; колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слизистой консистенции, светло-желтого цвета, диаметром 3 - 5 мм. Имеются полярные жгутики, не образуют чехлов, грам (-). Оксидазы не образует, каталазу образует. В слабо забуференной среде образуется в небольших количествах кислота. Использует различные углеводы, но не инулин, рамнозу, адонит, дульцит, салицин, инозит. В молоке с бромкрезоловым пурпурным индикатором кислота не образуется. Использует ацетат, пропионат, цитрат, малат, сукцинат. Бензоат и оксалат не использует. Гидролизует крахмал и TWEEN-80, нитраты не восстанавливает. Образует сероводород из цистина, тиосульфата, пептона. Ацетоин и индол не образует. Нуждается в метионине, глутаминовой кислоте, никотиновой кислоте. Аспарагин не использует. Строгий аэроб. Растет при температуре от +5 до +30^oC. Желатину разжижает. Толерантен к NaCI - 0,5 - 1,5%. Уреазу не образует.

Для получения посевного материала штаммы выращивали раздельно, в ферментере вели совместное культивирование микроорганизмов.

Для выращивания указанных микроорганизмов использована питательная среда следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄•7H₂O - 0,5 г/л
FeCl₃•6H₂O - 0,05 г/л
CaCl₂•2H₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 20 г/л
Вода - До 1 л
Процесс культивирования проводился в ферментерах при Т = 20^oC, pH 6,8 - 7,2 в течение 24 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использована 0,01 % сырая нефть.

В качестве минеральных добавок в первом примере использованы:
источник азота - карбамид - 0,6 мас.%
источник фосфора - суперфосфат двойной - 0,30 мас.%
источник калия - калий сернокислый для сельского хозяйства - 1,5 мас.%
Наполнителем служит стерильный торф. После внесения ассоциаций микроорганизмов в торф проводилось доращивание культур при T = 3^oC, в течение 120 часов.

Титр биопрепарата 1•10¹² жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

Препарат при испытаниях был внесен в керамические сосуды, наполненные почвой с различным pH (в пределах от 4,5 до 8,2) и содержанием мазута 11,2 - 12,6 г/кг. Количество внесенного препарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживались в термостатах в диапазоне температур от 3^oC до 40^oC в течение 90 суток. Содержание мазута в почве контролировалось 1 раз в 30 дней, опыт проведен в трех повторностях. Результаты испытаний биопрепарата приведены в табл. 1 (см. в конце описания).

В другом примере биопрепарат содержит:
Pseudomonas putida ПИ K_o-1 - 6 мас.%
Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - 10 мас.%
Micrococcus species ПИ K_y-1 - 1 мас.%
Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3 - 5 мас.%
Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8 - 8 мас.%
Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7 - 3 мас.%
Микроорганизмы выращены на той же питательной среде, что и в первом примере.

Минеральные добавки содержат:
Источник азота - сульфат аммония - 0,7 мас.%
Источник фосфора - простой суперфосфат - 0,4 мас.%
Источник калия - сульфат калия технический - 0,2 мас.%
Наполнителем служит стерильный торф. Титр препарата 5•10¹¹ жизнеспособных клеток в 1 г препарата. Почва, подлежащая очистке, содержала сырой нефти 11,5- 12,9 г/кг. Опыт проведен в трех повторностях. Результаты испытаний приведены в табл. 2 (см. в конце описания).

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность заявленного биопрепарата (до 93%), в том числе и в отношение тяжелых фракций нефти. При этом препарат эффективен в широком диапазоне pH и температуры очищаемой среды (pH 4,5 - 8,2, T = 3 - 40^oC).

Биопрепарат может быть изготовлен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых компонентов.

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум мезофильных бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ К_o-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ К_y-1 и консорциум психрофильных бактериальных штаммов Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-3, Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7, при следующем соотношении компонентов, мас.%: Pseudomonas putida ПИ К_o-1 1-10, Pseudomonas fluorescens ПИ-896 1-10, Micrococcus species ПИ К_y-1 1-10, Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3 1-10, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8 1-10, Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7 1-10, минеральные добавки: источник азота 0,25-0,75, источник фосфора 0,15-0,50, источник калия 0,1-0,25, наполнитель - остальное. Препарат эффективен в широком диапазоне температур и рН среды. 2 табл.

Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержит консорциум мезофильных бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ К₀-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ К_У-1 и консорциум психрофильных бактериальных штаммов Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8, Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Pseudomonas putida ПИ К₀-1 - 1 - 10
Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - 1 - 10
Micrococcus species ПИ К_У-1 - 1 - 10
Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3 - 1 - 10
Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8 - 1 - 10
Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7 - 1 - 10
Минеральные добавки:
Источник азота - 0,25 - 0,75
Источник фосфора - 0,15 - 0,50
Источник калия - 0,1 - 0,25
Наполнитель - Остальное