СРЕДСТВО ПРОФИЛАКТИКИ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ФОРМЫ ОСТРОЙ ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/4965 A61P39/06 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к медицинской радиологии, и может быть использовано для профилактики церебральной формы острой лучевой болезни (ОЛБ).

Широкое внедрение ядерных технологий во все сферы деятельности человека (промышленное производство, энергетика, наука, медицина и другие) приводит к увеличению общего числа радиационно-опасных объектов и неуклонному повышению вероятности возникновения радиационных аварий. В связи с этим надежная противорадиационная защита, в том числе фармакологическая, является необходимым условием для обеспечения деятельности многих специалистов, особенно входящих в группы риска (космонавты, персонал АЭС, полигонов, институтов ядерной физики, ядерных энергетических и исследовательских установок, личный состав спасательных служб, военнослужащие и т.п.), в аварийных и других экстремальных ситуациях. Кроме того, имеются достаточно веские основания полагать, что одну из реальных угроз в современном мире представляет возможность применения оружия, основным поражающим фактором которого являются ионизирующие излучения (ИИ) высоких энергий.

Учитывая разнообразие возможных вариантов воздействия радиации на человека, следует отметить, что число лиц, профессионально подвергающихся риску воздействия ИИ в сверхвысоких дозах (порядка десятков и сотен грей), будет постоянно возрастать, а проблема защиты их от радиационных поражений на протяжении многих десятилетий будет оставаться актуальной.

Опасность воздействия на человека радиации в сверхвысоких дозах связана с тем, что во время или сразу после облучения наблюдается развитие резко выраженных нарушений функций центральной нервной системы (ЦНС), приводящих к быстрой потере дееспособности. Подобные нарушения сопряжены с развитием комплекса характерных синдромов, таких как судорожно-паралитический, неврологический, сосудистый, поведенческие нарушения и других, объединенных в так называемый церебральный лучевой синдром (ЦЛС) [1, 2]. Для ЦЛС характерно фазное течение, когда вслед за периодом возбуждения следует глубокая адинамия, на фоне которой возможны приступы гиперкинезов и судорог, длящихся в течение нескольких часов до наступления терминального (коматозного) состояния.

В связи с этим изыскание лекарственных средств, предназначенных для профилактики нарушений функций ЦНС в условиях воздействия на человека ИИ в сверхвысоких дозах, является одной из актуальных задач современной медицинской радиологии. Фармакологическая коррекция нарушений при ЦЛС является необходимым условием обеспечения нормальной деятельности лиц, профессионально связанных с риском облучения организма в аварийных и других экстремальных ситуациях [3].

Для профилактики нарушений функций ЦНС, возникающих в результате воздействия ИИ в сверхвысоких дозах, используют фармакологические средства - «церебральные» радиопротекторы, обеспечивающие временное сохранение работоспособности организма в подобных ситуациях. Из числа известных средств, проявляющих в экспериментах на животных свойства «церебральных» радиопротекторов, определенный интерес представляют: пентобарбитал [4], бензамид [5] и некоторые его производные, например 3, N, бутириламинобензамид [6, 7], а также никотинамид [8-10].

Однако указанные препараты нельзя рассматривать полностью удовлетворяющими основным требованиям, предъявляемым к «церебральным» радиопротекторам. Так, пентобарбитал относится к снотворным средствам, что препятствует его применению в качестве средства сохранения работоспособности человека в экстремальных ситуациях, связанных с его облучением. Из доступной информации о бензамиде и его производных известно, что они проявляют свойства «церебральных» радиопротекторов. Но указанные средства находятся на стадии лабораторных испытаний и до сих пор не являются официнальными лекарственными средствами. В связи этим в настоящее время они не могут считаться доступными в качестве «церебральных» радиопротекторов.

Никотинамид относится к числу официнальных лекарственных препаратов из группы витаминов. Однако выпускается он в лекарственных формах, в которых действующее вещество содержится в дозах не более 50 мг. Этого недостаточно для обеспечения профилактики ЦЛС [8], так как известно, что расчетная разовая радиозащитная доза никотинамида для человека составляет не менее 1,0 г, что достигается в случае приема 20 таблеток по 0,05 г [10]. Данное обстоятельство существенно ограничивает возможности практического использования никотинамида в качестве «церебрального» радиопротектора. По принадлежности к числу аптечных лекарств и по достигаемому эффекту никотинамид наиболее близок к заявляемому средству и принят в качестве средства-прототипа.

Таким образом, рассмотренные препараты в настоящее время по той или иной причине не могут найти применение в качестве широко доступных средств профилактики церебральной формы ОЛБ.

Целью изобретения явилось расширение арсенала фармакологических средств профилактики ЦЛС, возникающего в условиях воздействия ионизирующих излучений в сверхвысоких дозах, за счет применения лекарственного средства, обладающего аналогичной, по сравнению со средством-прототипом, эффективностью, также являющегося официнальным лекарственным препаратом, но значительно более доступным при необходимости массового применения

Указанная цель достигается путем применения препарата пиразинамид, который является отечественным официнальным лекарственным средством и предназначен для лечения туберкулеза. Разовая доза пиразинамида для взрослых составляет 1,0-2,0 г, что соответствует расчетной радиозащитной дозе «церебральных» радиопротекторов. В аптечную сеть поступает в виде таблеток массой 0,25 г и 0,50 г [11]. В случае использования пиразинамида по новому назначению радиозащитную дозу препарата можно обеспечить путем приема внутрь 2 таблеток по 0,5 г. Сведений о применении пиразинамида в качестве «церебрального» радиопротектора в доступной литературе не обнаружено.

Возможность достижения цели изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Определение оптимальной дозы заявляемого средства по влиянию его на выраженность нарушений функций ЦНС у облученных крыс.

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Из подопытных животных были сформированы 3 группы: контрольная и две опытные. В ходе эксперимента животных подвергали общему относительно равномерному гамма-облучению в дозе 200 Гр.

Животным контрольной группы за 15-30 мин до облучения внутрибрюшинно вводили 0,9% раствор хлорида натрия в объеме 0,5 мл на крысу. Средство-прототип (никотинамид) вводили животным первой опытной группы, что делали в оптимальный срок, то есть за 15-30 мин до облучения, внутрибрюшинно в оптимальной дозе, составляющей 100 мг/кг. Животным второй опытной группы за 15-30 мин до облучения вводили заявляемое средство (пиразинамид) внутрибрюшинно в различных дозах (50, 100 и 150 мг/кг).

В ходе наблюдения за облученными животными в течение 6 ч регистрировали в каждой экспериментальной группе количество животных с признаками ранней преходящей недееспособности (РПН), а также ее продолжительность и выраженность. Статистическую обработку контролируемых показателей проводили при помощи U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p≤0,05.

Результаты проведенных экспериментов показали, что воздействие ИИ в дозе 200 Гр приводит к развитию РПН у 100% животных контрольной группы. Продолжительность недееспособности при этом составила 64±28 мин (таблица 1).

Профилактическое введение средства-прототипа в оптимальный срок и в оптимальной дозе в 100% случаев полностью предотвращало развитие нарушений функций ЦНС у подопытных облученных животных.

В случае использования заявляемого средства установлено, что профилактическое его введение в дозе 50 мг/кг предотвращало развитие РПН у 42% подопытных животных. При этом продолжительность недееспособности у оставшихся 58% крыс составила 33±13 мин. Введение же заявляемого средства в дозах 100 мг/кг и 150 мг/кг полностью предотвращало развитие РПН у облученных животных.

Экспериментально установлено, что наименьшая доза заявляемого средства, препятствующая развитию нарушений функций ЦНС, составляет 100 мг/кг. Именно в этой дозе заявляемое средство применяли в дальнейших исследованиях.

Таким образом, профилактическое применение заявляемого средства в дозе 100 мг/кг предотвращает развитие РПН у 100% животных, облученных в дозе 200 Гр.

Пример 2. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на уровень ориентировочно-исследовательской активности облученных крыс в тесте «открытое поле».

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Из подопытных животных были сформированы 4 группы: интактная, контрольная и две опытные. В ходе эксперимента животным контрольной и опытных групп вводили различные средства, как описано в примере 1, а затем подвергали их общему относительно равномерному гамма-облучению в дозе 200 Гр.

Интактных и облученных крыс (сразу после облучения) тестировали в течение 3 мин с использованием метода «открытое поле». Оценивали двигательную активность подопытных животных (по количеству пересеченных квадратов и времени неподвижности), а также исследовательскую активность (по количеству вертикальных стоек и норковых реакций) [12]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили при помощи U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p≤0,05.

Результаты экспериментов показали, что облучение приводит к выраженному угнетению поведенческой активности подопытных животных. Общая двигательная активность облученных крыс контрольной группы, оцениваемая в тесте «открытое поле», снижалась в 3,6 раза, а исследовательская - в 4,5 раза, по сравнению с уровнем данного показателя в интактной группе. Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют, что облученные в дозе 200 Гр животные пересекали 20±6 квадратов, а время их неподвижного сидения составляло 150±18 с. При этом показатели исследовательской активности, а именно количество вертикальных стоек и норковых реакций составляли 5±3 и 3±2 соответственно.

Профилактическое введение средства-прототипа способствовало тому, что после воздействия ИИ в дозе 200 Гр поведенческая активность подопытных животных по сравнению с контрольной группой существенно выше, о чем свидетельствует увеличение количества пересеченных квадратов в 2,4 раза и снижение времени неподвижного сидения крыс в 5,6 раза. При этом исследовательская активность подопытных животных также выше, чем в контрольной группе. Количества вертикальных стоек и норковых реакций выросли соответственно в 2,6 раза и 2,7 раза.

В случае профилактического введения заявляемого средства также наблюдали улучшение показателей поведенческой и исследовательской активностей у облученных животных по сравнению с контрольной группой. Об этом свидетельствует увеличение количества пересеченных квадратов в 2,3 раза и снижение времени неподвижного сидения крыс в 6,0 раз. Количества вертикальных стоек и норковых реакций выросли соответственно в 2,2 раза и 2,3 раза.

Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемое средство по эффективности профилактического воздействия на двигательную и исследовательскую активность подопытных облученных животных не уступает средству прототипу.

Пример 3. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на способность облученных крыс выполнять заученные тесты в тесте «Beam-walking».

Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Из подопытных животных были сформированы 4 группы: интактная, контрольная и две опытные.

До проведения теста «Beam-walking» крыс всех экспериментальных групп предварительно обучали в течение 3 дней пересекать перекладину шириной 2,5 см и длиной 122 см, расположенную на высоте 100 см от пола [13]. По окончании обучения подопытным животным контрольной и опытных групп вводили различные средства, как описано в примере 1, а затем подвергали их общему относительно равномерному гамма-облучению в дозе 200 Гр.

Подопытных интактных и облученных животных (сразу после облучения) тестировали на перекладине. Оценку состояния работоспособности проводили по общему времени, затраченному крысой на пересечение перекладины и по выраженности двигательных нарушений. Статистическую обработку результатов исследований проводили при помощи U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p≤0,05.

Тестирование крыс на перекладине позволило установить, что облучение приводит к существенному увеличению времени пересечения перекладины подопытными животными контрольной группы. Как видно из данных, приведенных в таблице 3, крысы, облученные в дозе 200 Гр, пересекали перекладину за 104,3±27,2 с. При этом у 75% животных наблюдали существенные нарушения в характере двигательной активности. Часть из них была не в состоянии даже остаться на перекладине (2 из 12 крыс).

Иную картину наблюдали в случае профилактического введения средства-прототипа. Среднее время пересечения перекладины облученными крысами 1 опытной группы составляло 22,6±4,8 с, а частота двигательных нарушений - 25%. В сравнении с показателями контрольной группы среднее время пересечения перекладины уменьшилось в 4,6 раза, а частота двигательных нарушений - в 3,0 раза.

Аналогичную картину наблюдали и в случае профилактического использования заявляемого средства. Введение заявляемого средства приводило к сокращению времени пересечения перекладины до 17,3±3,3 с, при этом двигательные нарушения наблюдали у 33% подопытных животных. В сравнении с показателями контрольной группы среднее время пересечения перекладины и частота двигательных нарушений снизились, соответственно, в 6,0 раз и 2,3 раза.

Таким образом, экспериментально с использованием теста «Beam-walking» установлено, что заявляемое средство по влиянию на показатели поведенческой активности крыс, облученных в дозе 200 Гр, не уступает средству-прототипу.

Пример 4. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на развитие судорожно-гиперкинетического синдрома.

Эксперименты выполнены на морских свинках массой 300-350 г. Из подопытных животных формировали 3 группы: контрольная и две опытные. В ходе эксперимента животным вводили различные средства, как описано в примере 1, а затем подвергали их общему относительно равномерному гамма-облучению в дозе 200 Гр.

Критериями эффективности профилактического действия исследуемых средств служили частота развития и интенсивность судорожно-гиперкинетического синдрома, возникшего у подопытных животных в результате их облучения. Статистическую обработку контролируемых показателей в экспериментальных группах проводили при помощи U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при p≤0,05.

Результаты проведенных исследований, представленные в таблице 4, свидетельствуют, что облучение животных контрольной группы привело к развитию судорог в 100% случаев. При этом судороги возникали спонтанно или провоцировались через 20-40 мин после окончания облучения и постепенно учащались. Через 2-5 ч на фоне эпилептического статуса развивалась децеребрационная регидность. Продолжительность жизни облученных животных не превышала 24 ч.

Применение средства-прототипа характеризовалось отсутствием генерализованных судорог у облученных животных на протяжении всего времени наблюдения (36 ч после облучения). Следует отметить, что при этом в 30% случаев наблюдался тремор мордочки и передних конечностей. Продолжительность жизни облученных животных составила 6,2±1,3 сут, то есть в сравнении с указанным показателем контрольной группы выросла в 10 раз.

При профилактическом введении в тех же условиях заявляемого средства генерализованных судорог не наблюдали, тремор обнаруживали в 25% случаев. Средняя продолжительность жизни облученных морских свинок составила 5,7±2,2 сут, то есть в сравнении с указанным показателем контрольной группы выросла в 9,5 раз.

Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемое средство по влиянию на частоту и выраженность судорожно-гиперкинетического синдрома у морских свинок не уступает средству-прототипу.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о достижении цели изобретения - расширении арсенала фармакологических средств профилактики церебрального лучевого синдрома за счет использования в качестве «церебрального» радиопротектора зарегистрированного официнального лекарственного средства пиразинамид, не уступающего по эффективности официнальному лекарственному средству никотинамид (средству-прототипу).

Заявляемое средство удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые для профилактики развития церебрального лучевого синдрома в условиях воздействия ионизирующих излучений в сверхвысоких дозах предложено использовать официнальный препарат пиразинамид, что позволяет предотвратить развитие нарушений функций ЦНС.

Заявляемое средство соответствует критерию «изобретательский уровень», так как на основании доступной информации целесообразность использования пиразинамида в качестве «церебрального» радиопротектора и возможность эффективной профилактики проявлений церебральной формы острой лучевой болезни не представляются очевидными.

Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для применения» подтверждается результатами проведенных исследований, показавших высокую эффективность препарата пиразинамид при профилактике развития церебрального лучевого синдрома в условиях воздействия ионизирующих излучений в сверхвысоких дозах. Препарат является официнальным лекарственным средством и доступен для практического применения по новому назначению в той лекарственной форме, в которой он поступает в аптечную сеть.

Источники информации

1. Легеза В.И. К вопросу о патонейрофизиологических механизмах ранней реакции на облучение в высоких дозах / В.И. Легеза, Ю.С. Турлаков // Радиобиологический съезд. Пущино. 1983. Киев 20-25.09.1993. - С.584-585.

2. Малаховский В.Н. Острые лучевые церебральные нарушения как эффект повреждения ДНК нейронов / В.Н. Малаховский // Радиобиология. - 1993. - Т.33, вып.3. - С.392-397.

3. Maalouf M. Biological Effects of Space Radiation on Human Cells: History, Advances and Outcomes / M. Maalouf, M. Durante, N. Foray // J. Radiat. Res. - 2011. - Vol.52. - P.126-146.

4. Andrews H.L. Medication of early radiation death in guinea pigs / H.L. Andrews, K.C. Brace // Am. J. Physiol. - 1956. - Vol. 187, №2. - P.378-380.

5. Ильин Л.А. Фармакологические средства профилактики церебральной формы острой лучевой болезни / Л.А. Ильин, К.С. Мартиросов, В.В. Зорин // VI съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность). Тезисы докладов. Т.1. Москва, 25-28 октября 2010 г. - M.: РУДН, 2010. - С.193.

6. RU 2229882 C2, 10.06.2004.

7. Красильников И.И. Бензамид как структурная основа новых лекарственных препаратов с широким спектром биологической активности / И.И. Красильников, О.Ф. Алферова, А.В. Степанов, Г.В. Цикаришвили // Хим. фарм. журн. - 1995. - №8. - С.19-22.

8. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - Изд. 13-е. - Харьков: Торсинг, 1997. - Т.2. - С.93.

9. Тихомиров П.В. Влияние ингибиторов поли-АДФ-рибозилирования на состояние ГАМК-ергических рецепторов при облучении в высоких дозах / П.В. Тихомиров, А.Ю. Кондаков // Российская конференция «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация». Тезисы докладов. Москва, 13-14 ноября 2012 г. - M.: РУДН, 2012. - С.60.

10. Легеза В.И. Медицинские средства противорадиационной защиты: Пособие для врачей / Под ред. В.И. Легезы и А.Н. Гребенюка. - СПб.: Изд-во «Лань», 2001. - 95 с.

11. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. - Изд. 14-е. - M.: Новая волна, 2002. - Т.2. - С.310-311.

12. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Дж. Хьюстон. - M. - 1991. - 399 с.

13. Goldstein L.B. Beam-walking in rats: studies towards developing an animal model of functional recovery after brain injury / L.B. Goldstein, J.N. Davis // J Neurosci Methods. - 1990. - Vol.31, №2. - P.101-107.

Средство профилактики церебральной формы острой лучевой болезни

Таблица 1 Влияние средства-прототипа и заявляемого средства на выраженность развития ранней преходящей недееспособности (РПН) крыс, облученных в дозе 200 Гр Группа животных Количество облученных животных Доза, мг/кг Количество животных с нарушениями спонтанной двигательной активности Средняя продолжительность РПН, мин Контрольная (получавшая 0,9% раствор хлорида натрия) 12 - 24 64±28 1 опытная (получавшая средство-прототип) 12 100 0* 0* 2 опытная (получавшая заявляемое средство) 12 50 5* 33±13 12 100 0* 0* 12 150 0* 0* Примечание. * - различия достоверны (p≤0,05) по сравнению с контрольной группой

Таблица 2 Влияние средства-прототипа и заявляемого средства на показатели поведенческой активности крыс, облученных в дозе 200 Гр, оцениваемой с использованием метода «открытое поле» (M±m, n=12 в каждой группе) Группа животных Показатели двигательной активности Показатели исследовательской активности Количество пересеченных квадратов Время неподвижного сидения, с Количество вертикальных стоек Количество норковых реакций Интактная 44±5 26±5 10±2 9±3 Контрольная (получавшая 0,9 % раствор хлорида натрия) 20±6 150±18 5±3 3±2 1 опытная (получавшая средство-прототип) 48±15* 27±13* 13±5* 8±2* 2 опытная (получавшая заявляемое средство) 45±13* 25±8* 11±4* 7±4* Примечание. * - различия достоверны (p≤0,05) по сравнению с контрольной группой

Таблица 3 Влияние средства-прототипа и заявляемого средства на показатели поведенческой активности крыс, облученных в дозе 200 Гр, оцениваемой с использованием теста «Beam-walking» (M±m, n=12 в каждой группе) Группа животных Показатели поведенческой активности Время пересечения перекладины, с Количество животных с двигательными нарушениями, % Интактная 5,2±2,9 0+8 Контрольная (получавшая 0,9% раствор хлорида натрия) 104,3±27,2 75±13 1 опытная (получавшая средство-прототип) 22,6±4,8* 25±13* 2 опытная (получавшая заявляемое средство) 17,3±3,3* 33±14* Примечание. * - различия достоверны (p≤0,05) по сравнению с контрольной группой

Средство профилактики церебральной формы острой лучевой болезни

Таблица 4 Влияние средства-прототипа и заявляемого средства на частоту развития судорожно-гиперкинетического синдрома у морских свинок, облученных в дозе 100 Гр (n=12 в каждой группе) Группа животных Показатели развития судорожно-гиперкинетического синдрома Количество животных с судорожным синдромом Средняя продолжительность жизни M±m, сут Контрольная (получавшая 0,9% раствор хлорида натрия) 12 0,6±0,4 1 опытная (получавшая средство-прототип) 0* 6,2±1,3* 2 опытная (получавшая заявляемое средство) 0* 5,7±2,2* Примечание. * - различия достоверны (p≤0,05) по сравнению с контрольной группой

Изобретение относится к медицинской радиологии и может быть использовано для профилактики церебральной формы острой лучевой болезни. Предложено использовать официнальный лекарственный препарат пиразинамид в качестве средства профилактики церебральной формы острой лучевой болезни. Ранее пиразинамид применяли для лечения туберкулеза. Технический результат состоит в предотвращении в 100 % случаев развития ранней преходящей недееспособности при облучении в дозе 200 Гр, улучшении показателей поведенческой и исследовательской активностей у облученных животных, в снижении частоты двигательных нарушений, снижении частоты и выраженности судорожно-гиперкинетического синдрома и увеличении средней продолжительности жизни облученных животных в 9,5 раз. По эффективности радиопротекторного действия пиразинамид не уступает средству-прототипу никотинамиду. 4 табл., 4 пр.

Применение пиразинамида в качестве средства профилактики церебральной формы острой лучевой болезни.