КОМПЛЕКСНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ АЛЛЕРГЕНОВ ПЫЛЬЦЫ БЕРЕЗЫ И МУРАМИЛПЕПТИДОВ Российский патент 2014 года по МПК A61K39/36 A61K39/39 A61P37/08 

Изобретение относится к области медицины.

На сегодняшний день аллергическими заболеваниями в той или иной степени страдают до 20% населения планеты. Общее число страдающих аллергическими заболеваниями по РФ составляет примерно 20 млн человек, в том числе пыльцевой аллергией 8 млн человек. Проблема адекватной терапии аллергии стоит как никогда остро.

Антигистаминные препараты, столь широко рекламируемые в средствах массовой информации, купируя клинические проявления в данный момент времени, не устраняют причину заболевания. Аллергоспецифическая иммунотерапия (АСИТ) позволяет искоренить причину патологии. Введение по определенной схеме повышающихся доз аллергена приводит к выработке против него значительного количества антител IgG-класса, которые связывают поступающий в организм аллерген, не допуская, таким образом, связывания его с IgE и запуска каскада аллергопатологических реакций. Происходит так называемое «переключение» иммунной системы организма с IgE ответа на IgG ответ. В настоящее время для АСИТ используются, в основном, аллергены, полученные водно-солевой экстракцией.

Аллергоид представляет собой химически модифицированный аллерген и имеет преимущества перед последним, т.к. при химической модификации наблюдается снижение аллергенности и риска наведения анафилактического шока. Превращение аллергена в аллергоид путем химической модификации в присутствии формальдегида, приводящее к взаимодействию высоко- и низкомолекулярных компонентов, способствует сохранению свойств аллергоида индуцировать синтез антител. Это действие усиливается и за счет жесткой, стабильной структуры молекулы аллергоида, устойчивой к влиянию денатурирующих агентов, в отличие от исходного аллергена, а также способствует пролонгированию действия аллергоида, так как разрушение его в организме больного будет происходить медленнее.

Снижение аллергенности в полимеризованных аллергенах связано, с одной стороны, с уменьшением числа антигенных детерминант в результате их реакции с альдегидными группами, а с другой стороны - недоступностью для реагинов остальных детерминант, скрытых внутри высокомолекулярного полимера. Положительное влияние на иммуногенность оказывает увеличение молекулярной массы и создание более жестких внутримолекулярных связей.

В этой связи, перспективным может оказаться комбинирование модифицированного аллергена с мурамилпептидами. Комбинирование аллергоида с мурамилпептидами дает возможность значительно усилить иммунный ответ, стимулировать высокий уровень выработки специфических IgG-антител, обеспечивающих защиту больного при попадании аллергена в его организм.

Препараты мурамилпептидного ряда существуют лишь с 1974 г., а разрешение на медицинское применение имеют только 2 препарата: ромуртид в Японии и ликопид в России. Последний в настоящее время проходит клинические испытания в США, Англии, Австралии и Дании. Нет данных об использовании мурамилпептидов при аллергопатологии. Изготавливаемый комплексный препарат на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов не имеет аналогов в России и за рубежом.

Главной мишенью в организме для иммуномодуляторов микробного происхождения, в том числе и мурамилпептидного ряда, являются фагоцитарные клетки. Под влиянием этих иммуномодуляторов происходит усиление функциональных свойств фагоцитов: повышается интенсивность фагоцитоза и внутриклеточного киллинга поглощенных бактерий, а также продукции провоспалительных цитокинов, необходимых для инициации гуморального и клеточного иммунитета.

Использование комбинации аллергоида и иммуномодулятора позволяет сократить курс лечения (с 45 инъекций до 15), что уменьшает возможность осложнений (анафилактических реакций) при проведении курса лечения.

Таким образом, высокая эффективность, безопасность и невысокая себестоимость комплексного препарата на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов делает его крайне перспективным и конкурентоспособным на рынке антиаллергических препаратов.

Аналогов предлагаемого изобретения не выявлено.

Задачей данного изобретения является создание комплексного препарата на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов для лечения поллинозов.

Технический результат заявленного изобретения заключается в значительном усилении иммунного ответа и стимулировании высокого уровня выработки специфических IgG-антител, обеспечивающих защиту больного при попадании аллергена в его организм.

Для решения данной задачи был разработан комплексный инъекционный препарат на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов для лечения поллинозов методом АСИТ, при этом комплексный препарат получали путем простого смешивания аллергоида и полученного мурамилпептида без проведения химической конъюгации составляющих. На дозу в 1000 PNU аллергоида добавляли 2 мг мурамилпептида.

Препарат предназначен для лечения поллинозов методом АСИТ. Введение по определенной схеме повышающихся доз препарата приводит к выработке против него значительного количества антител IgG-класса, которые связывают поступающий в организм аллерген, не допуская, таким образом, связывания его с IgE и запуска каскада аллергопатологических реакций. Происходит так называемое «переключение» иммунной системы организма с IgE-ответа на IgG-ответ.

Предлагаемое изобретение поясняется следующими графическими материалами.

В таблице 1 представлены результаты определения иммуногенности комплексного препарата на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов.

В таблице 2 представлены результаты оценки гипосенсибилизирующей активности аллергоида пыльцы березы и комплексного препарата на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов в ходе проведения эксперимента.

На рисунке 1 представлены значения ОП в ИФА при нейтрализации IgE-антител для аллергена, аллергоида и комплексного препарата на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов.

Композиция комплексного инъекционного препарата на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов, получаемого путем простого смешивания аллергоида и мурамилпептида без проведения химической конъюгации составляющих, где на дозу в 1000 PNU аллергоида добавляют 2 мг мурамилпептида, была подобрана опытным путем с проведением исследований на лабораторных животных. На первом этапе были использованы 5 доз препарата мурамилпептида - 0,5 мг, 1 мг, 2 мг, 5 мг, 10 мг. Дозы пересчитывались для мышей (гибриды (СВА×С57 В1/6) F₁ весом 19-21 грамм) из расчета, что планируемая разовая терапевтическая доза предназначена для человека массой 70 кг. Иммуномодулирующую активность оценивали по влиянию полученного препарата мурамилпептида на способность вырабатывать антителообразующие клетки (АОК) в ответ на введение тимусзависимого антигена эритроцитов барана (ЭБ). Результаты оценивали по сумме двух серий экспериментов, каждый из которых проводили на 5 опытных группах мышей и группе контроля (по 10 мышей в группе).

Установлено, что курсовое введение мышам препарата мурамилпептида в дозах 1, 2 и 5 мг приводит к 2-кратному увеличению числа АОК в селезенках иммунизированных мышей. Для доз 0,5 мг и 10 мг отмечено увеличение числа АОК в 1,5 раза. Полученный эффект реализуется не за счет увеличения числа ядросодержащих клеток (ЯСК) в селезенках, а за счет увеличения числа активных антителопродуцентов. Для второго этапа исследования были подготовлены 3 варианта комплексного препарата, где на 1000 PNU аллергоида добавляли выбранные дозы мурамилпептида (1 мг, 2 мг, 5 мг).

На втором этапе оценивали влияние препаратов на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов на цитокинопродукцию лимфоцитов человека, с использованием коммерческих тест-систем Bender Medsystems. Исследовали содержание ИЛ-4 в супернатантах лимфоцитов, стимулированных аллергеном, аллергоидом или комплексным препаратом на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов (после предварительной инкубации в течение 18 часов). Препараты, содержащие 1 и 2 мг мурамилпептида, не оказывали влияние на продукцию ИЛ-4 как у здоровых доноров, так и у пациентов с аллергическим ринитом. Для препарата, содержащего 5 мг мурамилпептида, отмечено незначительное увеличение содержания ИЛ-4 в супернатантах. Оптимальными оказались дозы 1 мг и 2 мг мурамилпептида на 1000 PNU аллергоида.

По результатам исследований предпочтение было отдано препарату, содержащему больше иммуномодулятора - 2 мг мурамилпептида на 1000 PNU аллергоида.

Поскольку разрабатываемый препарат предназначен для лечения аллергопатологии, то добавление мурамилпептидов не должно изменить аллергенные свойства препарата в сравнении с исходным аллергоидом.

Сравнивали иммуногенность и остаточную аллергенность. Причем, иммуногенность должна быть не ниже, а остаточная аллергенность не выше, чем соответствующие значения для исходного аллергоида.

Определение иммуногенности и остаточной аллергенности препаратов проводили в иммуноферментном анализе. На полистироловые планшеты наносили соответственно:

- аллергоид (серия Саб9-11-1), изготовленный из аллергена пыльцы березы (серия Сб4-11-1), полученный в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, в качестве контроля, как исходный препарат;

- комплексный инъекционный препарат на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов, полученный путем простого смешивания аллергоида и мурамилпептида, без проведения химической конъюгации составляющих, где на дозу в 1000 PNU аллергоида добавляли 2 мг мурамилпептида.

Иммуногенность препарата определяется по способности взаимодействовать со специфическим к нему IgG из сывороток крови больных. В качестве положительного контроля использовали пулированную сыворотку с высоким содержанием специфических IgG-антител. Сыворотки для нее, содержащие не менее 10 mgA/l, были отобраны с использованием коммерческих флюороиммуноферментных наборов, на приборе ImmunoCAP (Pharmacia biotech). Результаты определения иммуногенности препарата представлены в таблице 1.

Видно, что оптические плотности полученного препарата и контролей очень близки, различие недостоверно (p>0,05). Таким образом, показано, что иммуногенность изготовленного препарата не изменилась по сравнению с исходным аллергоидом из пыльцы березы.

Как и исходный аллергоид, изготовленный препарат должен обладать сниженной специфической активностью по сравнению с очищенным аллергеном пыльцы березы, из которого приготовлен препарат - аллергенная активность исходного аллергена должна превышать аллергенную активность аллергоида или препарата не менее чем на 40%.

Определение проводили методом ингибиции ИФА. В качестве положительного контроля использовали пулированную сыворотку с высоким содержанием специфических IgE антител. Сыворотки для нее, содержащие не менее 85 kUA/l, были отобраны с использованием коммерческих флюороиммуноферментных наборов на приборе ImmunoCAP (Pharmacia biotech).

Результаты представлены на рисунке 1. Результаты реакции оценивали на графике по разнице ОП сравниваемых образцов в 2 точках линейного участка калибровочных кривых, причем разница должна быть не менее 40%. Из рис.1 видно, что связывание аллергена со специфическим IgE контрольной сыворотки выше, т.к. значения ОП в ИФА при нейтрализации антител существенно ниже, чем для соответствующих концентраций аллергоида и препарата, что свидетельствует о лучшем связывании со специфическим IgE контрольной сыворотки. В двух точках линейного участка калибровочной кривой разница ОП для аллергена и аллергоида, вместе с изготовленным на его основе препаратом превысила 40%. Таким образом, полученный нами препарат, как и исходный аллергоид пыльцы березы, обладают меньшей аллергенностью, по сравнению с аллергеном.

Проводили сравнительную оценку иммуногенных свойств аллергоида пыльцы березы и комплексного инъекционного препарата на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов по способности стимулировать синтез блокирующих IgG-антител в процессе гипосенсибилизации лабораторных животных.

Сенсибилизацию аллергеном березы проводили путем внутрибрюшинного введения, 10 мкг/мышь в объеме 0,2 мл с адъювантом Фрейнда, троекратно, с интервалом в 7 дней.

В качестве доноров использовали мышей-гибридов (самки весом 20 г) из питомника «Столбовая» ГУНЦБТ РАМН. Исследования проводили на 30 сенсибилизированных мышах.

Проводили курс гипосенсибилизации 20 сенсибилизированным животным: 1-й группе (10 животных) - аллергоидом пыльцы березы, 2-й группе (10 животных) - комплексным инъекционным препаратом на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов, 10 сенсибилизированных животных составили группу контроля.

Курс гипосенсибилизации проводили по следующей схеме:

Инъекция 0,01 мкг/мышь

Инъекция 0,05 мкг/мышь

Инъекция 0,1 мкг/мышь

Инъекция 0,1 мкг/мышь

Инъекция 0,1 мкг/мышь

Инъекция 0,5 мкг/мышь

Инъекция 0,5 мкг/мышь

Инъекция 1,0 мкг/мышь

Инъекция 1,0 мкг/мышь

Инъекция 2,0 мкг/мышь

Инъекция 2,0 мкг/мышь

11 инъекций препарата оказалось достаточно для получения интенсивной стимуляции IgG-ответа. Через 3 суток после завершения гипосенсибилизации животных декапитировали, собирали кровь в пробирки, центрифугировали и отделяли сыворотку, которую затем использовали для определения в ИФА специфических IgG-антител. Результаты приведены в таблице 2.

Уровень IgG-блок-антител у мышей после проведения гипосенсибилизации аллергоидом по сравнению с сенсибилизированными тем же аллергеном животными увеличился на 60%, а после гипосенсибилизации комплексным препаратом - на 150%.

Показано увеличение иммуногенности заявляемого комплексного инъекционного препарата по сравнению с исходным аллергоидом.

Изобретение относится к комплексному инъекционному препарату для лечения поллинозов методом АСИТ. Указанный препарат получают путем простого смешивания аллергоида пыльцы березы и мурамилпептида без проведения химической конъюгации составляющих, причем на дозу в 1000 PNU аллергоида добавляют 2 мг мурамилпептида. Заявленное изобретение обеспечивает значительное усиление иммунного ответа и стимулирует высокий уровень выработки специфических IgG-антител, а также позволяет сократить курс лечения поллинозов, что уменьшает возможность осложнений. 1 ил., 2 табл.

Комплексный инъекционный препарат на основе аллергенов пыльцы березы и мурамилпептидов для лечения поллинозов методом АСИТ, получаемый путем простого смешивания аллергоида и мурамилпептида, без проведения химической конъюгации составляющих, причем на дозу в 1000 PNU аллергоида добавляют 2 мг мурамилпептида.