СПОСОБ СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ, В ТОМ ЧИСЛЕ БЕТА-ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ, ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ВАРИАНТА ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ Российский патент 2015 года по МПК C12P35/04 C12N9/84 

Пенициллинацилаза (Penicillin G acylase) из E.coli относится к ферментам класса амидогидролаз. Способность пенициллинацилазы катализировать синтез пептидной связи в водной среде уже много лет используется в фармацевтической промышленности для получения полусинтетических β-лактамных антибиотиков [1], тем не менее интерес к повышению эффективности этого процесса не уменьшается. Не прекращается поиск новых и улучшение существующих катализаторов на основе пенициллинацилазы, поскольку их использование может дать существенный экономический эффект. Одним из основных направлений улучшения эффективности процесса является получение мутантных форм пенициллинацилазы методами генной инженерии путем замены одной или нескольких аминокислот, приводящей к улучшению каталитических свойств фермента.

Полноразмерная аминокислотная последовательность пенициллинацилазы из E.coli включает в себя сигнальный пептид (аминокислоты 1-26), альфа-субъединицу (аминокислоты 27-235), спейсерный пептид (аминокислоты 236-289) и бета-субъединицу (аминокислоты 290-846):

В работах, связанных с получением вариантов пенициллинацилазы, субъединицы фермента, как правило, нумеруют отдельно, и в дальнейшем изложении будет использована именно эта нумерация (на полноразмерной аминокислотной последовательности она показана как α1-209 и β1-557).

Известно несколько научных работ по получению мутантных форм фермента из E.coli по положениям αR145 и αF146 с улучшенной способностью катализировать реакции образования пептидной связи в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина методом ацильного переноса [2, 3], что приводит к увеличению выхода в реакции синтеза ампициллина с 15% до 24% для низкоконцентрированных и с 51% до 77% для высококонцентрированных систем. Наибольший эффект характерен для мутантов αR145G/S/L. Для мутантов по позиции αF146 наблюдается существенное падение каталитической активности.

В работе [4] авторы получали рекомбинантные гибриды в семействе ПА. Среди случайных мутаций были обнаружены замены αD148G и βG385S, включив которые в состав ПА E.Coli, можно добиться улучшения выхода в реакции синтеза ампициллина на 20%

При использовании мутации βF24A можно добиться увеличения выходов в реакции синтеза ампициллина, амоксициллина, цефалексина и цефадроксила при использовании сложных эфиров в качестве ацильного донора. [5] Использование же амидов не приводит к улучшению выхода. Данный эффект связан с общим ослаблением каталитических способностей фермента.

Патентная литература по улучшению эффективности реакций синтеза пептидов посредством улучшения свойств пенициллинацилазы ограничивается несколькими патентами, относящимися, в основном, к использованию мутантных пенициллинацилаз для синтеза β-лактамных антибиотиков.

В патентах [WO9605318, 22-02-1996 и US6033823, 07-03-2000], принадлежащих одной группе авторов, заявлено изменение субстратной специфичности и активности пенициллинацилазы из прокариот мутацией аминокислотных остатков по значительному числу сайтов альфа-цепи (α139-152) и бета-цепи (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), хотя патенты основаны лишь на нескольких примерах влияния мутаций по отдельным положениям αM143, αF147, βL56, βA67, βI177 в пенициллинацилазе из Alcaligenes faecalis на способность фермента катализировать гидролиз природных пенициллинов G и V, а также синтез ампициллина.

В патентах [WO9820120, 14-05-1998; US6403356, 11-06-2002] круг вариантов пенициллинацилазы из Е.coli существенно сужен и ограничен мутациями по сайтам αМ142, αF146, βF24, βV56, βI177. Приоритетные права данных патентов ограничиваются способом получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способом получения β-лактамных антибиотиков ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот. Наибольший эффект дала мутация по сайту β24 заменой L-фенилаланина на L-аланин, позволившая увеличить выход в синтезе пенициллинов и цефалоспоринов при использовании сложных эфиров в качестве ацильного донора.

В патенте [US2005124029, 09-06-2005] авторы заменяли в пенициллинацилазе из E.coli аминокислотный остаток αR145 на L, К или С. Для мутанта αR145L выход антибиотика в синтезе цефалексина увеличился с 70 до 81% в слабощелочных условиях, однако при этом наблюдалась существенная (более 10 раз) потеря каталитической активности. Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа получения пептидов, в том числе полусинтетических β-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связью в боковой цепи, путем применения препарата пенициллинацилазы с улучшенными свойствами.

Техническим результатом изобретения является создание улучшенного способа получения пептидов, в том числе полусинтетических β-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связь в боковой цепи, характеризующегося более высоким выходом и скоростью образования целевого продукта.

Указанный технический результат достигается путем использования препарата пенициллинацилазы из E.coli с измененной структурой, а именно, содержащей замену остатка аспарагиновой кислоты бета цепи фермента по положению β484, на другой аминокислотный остаток, в частности на остаток аспарагина. Наиболее близкими аналогами настоящего изобретения являются описанные выше патенты [WO9820120, 14-05-1998; US6403356, 11-06-2002, US2005124029, 09-06-2005].

В научной и патентной литературе не известны примеры улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы в реакциях синтеза пептидов, не относящихся к β-лактамным антибиотикам, а полученное увеличение эффективности синтеза пептидов, в том числе относящихся к β-лактамным антибиотикам, с использованием мутанта пенициллинацилазы βD484N не вытекает с очевидностью из известной структуры пенициллинацилазы и ее функций.

Настоящее изобретение относится к области инженерной энзимологии и биотехнологии, а именно к применению пенициллинацилазы из E.coli, полученной из предшественника фермента посредством замены аминокислотного остатка в позиции 484 бета-цепи фермента любыми доступными методами генной инженерии, направленной к эволюции или селекции.

В качестве ацильных доноров в ферментативных реакциях синтеза пептидов, в том числе β-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи с ядром, могут быть использованы сложные эфиры и амиды аминокислот, их замещенных производных в α-положении и в ароматическом кольце, предпочтительно амиды и эфиры R, S-фенилглицина.

Пенициллинацилаза по изобретению может быть получена и использована в виде гомогенного препарата, раствора с содержанием других химических соединений или белков, мицелл, агрегатов, или в твердом состоянии в виде кристаллов, агрегатов или иммобилизированных в геле, на различных подложках и носителях препаратов, или применяется в виде культуры клеток, иммобилизованных клеток, комбинированных препаратов фермента с клетками, иммобилизованными клетками или ферментами. Заявленный способ реализуется приведением в контакт препарата пенициллинацилазы и реакционной смеси. В качестве реакционной среды может быть использована вода, однофазные и многофазные водно-органичесике смеси, растворы с содержанием органических и неорганических соединений, в частности солей, кислот, оснований. В качестве реакционной среды более предпочтительным является использование воды или водных растворов с содержанием не более 40% (по объему) органических растворителей. Некоторые примеры выполнения заявленного способа приведены ниже. Варианты пенициллинацилазы из E.coli получали путем конструирования мутантного гена методом сайт-специфического мутагенеза по методикам, описанным в литературе [6]. После процедур клонирования, культивирования, выделения и очистки были получены препараты мутантов пенициллинацилазы.

Пример 1. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза цефалексина.

Реакцию ферментативного синтеза цефалексина переносом ацильной группы на ядро антибиотика 7-аминодезацетоксицефалоспорановую кислоту проводили, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. При использовании варианта пенициллинацилазы βD484N наблюдается увеличение выхода продукта реакции от 1,5 до 1,9 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа.

Таблица 1
Выход продукта реакции ферментативного синтеза цефалексина [7-ADCA]/[D-PGA], mM Выход цефалексина, % Дикий тип βD484N 200/200 40 60 200/400 39 73

Пример 2. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина.

Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина переносом ацильной группы на глицин проводили в водной среде, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. Оказалось, что в случае варианта пенициллинацилазы βD484N выход продукта реакции увеличивается приблизительно в 4,7 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (Табл.2).

Таблица 2
Выход продукта в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина Вариант пенициллинацилазы Выход D-фенилглицил-глицина, % Дикий тип 17 βD484N 80

Описание экспериментальной части

Определение ферментативной активности. Активность вариантов пенициллинацилазы определяли спектрофотометрически по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамидо)бензойной кислоты при 400 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 (Япония). Реакцию проводили при 25°C в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,5, 0,1 М KCl.

Определение концентрации активных центров. Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом по методике [7]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата, как описано выше.

ВЭЖХ анализ. Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series (США); колонка Kromasil Eternity C18 (AkzoNobel, США), 250×4.6 мм, размер частиц 5 µм; подвижная фаза CH₃CN/вода 30:70, 0,68 г/л КН₂РO4, 0,1 г/л додецилсульфата натрия, рН 3,0; скорость потока 0,7 мл/мин; объем вкола 10 мкл; УФ детектирование при 210 нм.

Проведение реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина. Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке рН-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, рН 9,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200 мМ D-фенилглицина, 200 мМ глицина, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.

Проведение реакции ферментативного синтеза цефалексина. Реакцию ферментативного синтеза цефалексина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке рН-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, рН 8,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200-400 мМ D-фенилглицина и 200 мМ 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.

Список литературы

1. Bruggink, A., Roos, E.C., de Vroom, E. Penicillin acylase in the industrial production of b-lactam antibiotics. Org. Proc. Res. Dev. (1998) 2, 128-33.

2. Alkema, W.B.L., Prins, A.K., de Vries, E. & Janssen, D.B. Role of a Arg 145 and b Arg 263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. (2002) 365, 303-309.

3. Jager, S.A.W., Shapovalova, I.V., Jekel, P.A., Alkema, W.B.L., Svedas, V.K., Janssen, D.B. Saturation mutagenesis reveals the importance of residues alphaR145 and alphaF146 of penicillin acylase in the synthesis of beta-lactam antibiotics. J. Biotechnol. (2008) 133, 18-26.

4. Jager, S.A.W., Jekel, P.A. and Janssen, D.B. Hybrid penicillin acylases with improved properties for synthesis of β-lactam antibiotics. Enzyme and Microb.l Technol (2007) 40, 1335-1344.

5. Alkema, W.B.L., Dijkhuis, A.-J., de Vries, E. & Janssen, D.B. The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. (2002) 269, 2093-2100.

6. Dominy, C.N., Andrews, D.W. in Methods in Molecular Biology. Vol.235 (E.coli Plasmid Vectors) (Eds.: N. Casali, A. Preston), Humana, Totowa, NJ, 209-223 (2003).

7. Швядас, В.К., Марголин, А.Л., Шерстюк. С.Ф., Березин. И.В. Инактивация растворимой и иммобилизованной пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонилфторида: кинетический анализ и титрование активных центров. Биоорг. Химия (1977) 3, 546-554.

Полноразмерная аминокислотная последовательность пенициллинацилазы из E.coli с двумя типами нумерации: сквозная нумерация и нумерация субъединиц в отдельности, использованная для описания изобретения.

Изобретение относится к инженерной энзимологии, молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к повышению эффективности биокаталитических превращений посредством применения мутантных форм ферментов с улучшенными каталитическими свойствами. В настоящем изобретении повышение эффективности ферментативного синтеза пептидной связи достигается при использовании варианта пенициллинацилазы из E.coli, содержащего замену аминокислотного остатка бета-цепи фермента в положении 484. Использование данного мутанта пенициллинацилазы позволяет увеличить выход и скорость накопления целевого продукта в реакциях синтеза пептидов, в том числе бета-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связь в боковой цепи с ядром. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ получения пептидов, в том числе β-лактамных антибиотиков, содержащих пептидную связь в боковой цепи с ядром, ферментативным переносом ацильной части на нуклеофил, отличающийся тем, что в качестве катализатора используется вариант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из Е.coli, содержащий замену аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты по положению 484 бета-цепи (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина.

2. Способ по п.1, где пептидом является цефалексин.

3. Способ по п.1, где пептидом является D-фенилглицил-глицин.