МУТАНТ ПЕНИЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ ИЗ E.coli С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2015 года по МПК C12N9/00 C12N9/84 

Пенициллинацилаза из разных источников используется в фармацевтической промышленности при получении полусинтетических β-лактамных антибиотиков [1]. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность могут дать возможность применения пенициллинацилазы в тонком органическом синтезе для получения энантиомеров α-, β-, γ-аминокислот и их элементоорганических аналогов [2] для высокоэффективного стереоселективного ацилирования аминосоединений в водной среде и получения энантиомерно чистых соединений [WO 02/20820, WO 02/20821, 3]. Высокий биокаталитический потенциал пенициллинацилазы делает ее перспективным объектом биоинженерии для создания биокатализаторов с улучшенными свойствами. Одним из основных путей улучшения свойств пенициллинацилазы является получение ее мутантных форм путем замены одной или нескольких аминокислотных остатков в структуре фермента данного типа, приводящей к улучшению каталитических свойств фермента.

В научных публикациях описаны мутации по целому ряду аминокислотных остатков прокариотических пенициллинацилаз. Основные данные изложены в обзоре [4], а также в более поздних и не вошедших в данный обзор работах [5-18]. Задачи, которые пытаются решить исследователи, вводя мутации в структуру пенициллинацилазы, - это увеличение эффективности ферментативного синтеза β-лактамных антибиотиков [9, 12, 13], улучшение специфичности и стереоспецифичности пенициллинацилазы [12, 13], увеличение стабильности пенициллинацилазы [8, 14, 16], изучение механизма процессинга пенициллинацилазы [17, 18].

Несмотря на то, что в литературе описано довольно много различных вариантов мутаций пенициллинацилазы, лишь немногие из них позволили улучшить субстратную специфичность и каталитические свойства фермента.

Показательными являются мутантные варианты пенициллинацилазы из E.coli и K.citrophila по положению βF71, с измененной специфичностью по отношению к ацильной части субстратов, впервые способные катализировать гидролиз адипил- и глутарил-L-лейцина [19, 20]. Однако «оборотной стороной» такой мутации в пенициллинацилазе является драматическое снижение активности по отношению к природным субстратам пенициллину G и V по сравнению с ферментом дикого типа.

Варианты пенициллинацилазы из E.coli по положениям αR145 и αF146 в 2-4 раза эффективнее катализируют синтез пенициллина и ампициллина методом ацильного переноса по сравнению с диким типом [6, 21, 22]. Наибольший эффект характерен для мутантов aR145G/S/L.

Представляет интерес мутация bF24A, посредством которой можно добиться увеличения выхода в реакциях синтеза ампициллина, амоксициллина, цефалексина и цефадроксила за счет увеличения соотношения скоростей синтеза и гидролиза [22]. Однако этот эффект достигается на фоне существенного снижения каталитической активности фермента (не более 1,6% каталитической активности пенициллинацилазы из E.coli дикого типа).

Патентная литература по получению мутантов пенициллинацилазы из прокариот с целью улучшения ее каталитических свойств также охватывает широкий круг мутаций. В основном, улучшение свойств направлено на увеличение эффективности синтеза β-лактамных антибиотиков.

В патентах [WO 9605318 и US 6033823], принадлежащих одной группе авторов, заявлено изменение субстратной специфичности и активности пенициллинацилазы из прокариот мутацией аминокислотных остатков по значительному числу сайтов альфа-цепи (α139-152) и бета- цепи (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), хотя патенты основаны лишь на нескольких примерах влияния мутаций по отдельным положениям αM143, αF147, βL56, βA67, βl177 в пенициллинацилазе из Alcaligenes faecalis на способность фермента катализировать гидролиз природных пенициллинов G и V, а также синтез ампициллина.

В патентах [WО 9820120, US 6403356] круг вариантов пенициллинацилазы из Е. coli существенно сужен и ограничен мутациями по сайтам αM142, αF146, βF24, βV56, βl177.

Приоритетные права данных патентов ограничиваются способом получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способом получения β-лактамных антибиотиков ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот. Наиболее значительный эффект дала мутация по сайту β24 при замене L-фенилаланина на L-аланин, позволившая увеличить выход в синтезе пенициллинов и цефалоспоринов при использовании сложных эфиров в качестве ацильного донора. Существенно, что данная улучшенная мутантная форма фермента позволяет использовать амиды в качестве ацильных доноров.

В патенте [US 2005124029] авторы заменяли в пенициллинацилазе из E.coli аминокислотный остаток αR145 на L, K, или C. Для мутанта αR145L выход антибиотика в синтезе цефалексина увеличился с 70 до 81% в слабощелочных условиях, однако при этом наблюдалась существенная (более 10 раз) потеря каталитической активности.

В патенте [WO 2010072765] заявлены мутации в положениях α3, α77, α90, α144, α192, β24, β109, β148, β313, β460, β488 пенициллинацилазы из E.coli, предпочтительно мутации αM90K, αN144S, αV192E, βF24L, βK109R, βV148L, βS313N, βF460L, βF488L, а также находящие соответствие в прокариотических ПА. Авторы патента делают акцент на многоточечных заменах, содержащих мутацию βF24L либо βF460L в сочетании с любыми из вышеперечисленных мутаций. Заявленные авторами варианты пенициллинацилазы обладают улучшенными свойствами в синтезе полусинтетических β-лактамных антибиотиков, в частности амоксициллина, ампициллина, цефалексина, цефадроксила и цефрадина, и позволяют повысить выход в синтезе амоксициллина до 90-95% относительно 6-аминопенициллановой кислоты.

В патенте [WO 2010054319] заявлены варианты пенициллинацилаз, содержащие изменения в аминокислотной последовательности в позициях 24, 28, 31, 56, 71, 74, 547, 697, 701. Полученные мутанты обладают повышенной стереоселективностью по отношению к α-положению ацильной группы метилового эфира α-гидрокси-фенилуксусной кислоты, улучшенным соотношением синтез/гидролиз в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина из сложных эфиров, а также повышенной термостабильностью и стабильностью в водно-органических средах по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа из K.Citrophila.

Технической задачей настоящего изобретения является создание пенициллинацилазы с улучшенными каталитическими свойствами, в частности с повышенной каталитической активностью, стереоселективностью, операционной стабильностью в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и эфиров, а также их применение для проведения биокаталитических превращений.

Техническим результатом изобретения является создание пенициллинацилазы с увеличенной каталитической эффективностью, стереоизбирательностью и операционной стабильностью в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и эфиров, а также их применение для проведения биокаталитических превращений, в том числе для получения функционализированных и энантиомерно чистых соединений, в частности с целью получения так называемых ядер бета-лактамных антибиотиков 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот, β-лактамных антибиотиков.

Указанный технический результат достигается путем внесения изменений в структуру пенициллинацилазы, а именно путем замены аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента, соответствующего позиции β484 пенициллинацилазы из E.coli.

Наиболее близкими аналогами настоящего изобретения являются патенты [WO 9820120, US 6403356, US 2005124029], описанными выше.

В научной и патентной литературе нет данных о получении пенициллинацилазы с улучшенными каталитическими свойствами путем замены аминокислотного остатка 484. Полученное улучшение каталитических свойств, заявленное в настоящем патенте, не вытекает с очевидностью из известной структуры пенициллинацилазы и ее функций.

Настоящее изобретение относится к области инженерной энзимологии и биотехнологии, а именно к получению и применению пенициллинацилазы из E.coli, полученной из предшественника фермента посредством замены аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента, соответствующего позиции 484, на другой аминокислотный остаток, в частности на аспарагин, любыми доступными методами генной инженерии, направленной эволюции или селекции.

Пенициллинацилаза по настоящему изобретению может применяться в качестве катализатора реакции конденсации ацильного донора и нуклеофила при получении амидов, пептидов, в частности бета-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи, или при получении энантиомерно чистых соединений.

Пенициллинацилаза по настоящему изобретению может применяться в качестве катализатора реакции гидролиза эфиров, амидов или пептидов, в частности бета-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи, при получении ценных продуктов, в частности энантиомерно чистых соединений, 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот.

В качестве ацильных доноров в ферментативных реакциях конденсации, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы карбоновые кислоты, их сложные эфиры и амиды, в частности амиды и эфиры аминокислот и их замещенных производных в α-положении и в ароматическом кольце предпочтительно амиды и эфиры R, S-фенилглицина.

В качестве нуклеофилов в ферментативных реакциях конденсации, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы амины, аминоспирты, аминокислоты, их эфиры, амиды и соответствующие элементоорганические аналоги, в частности 6-аминопенициллановая и 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислоты.

В качестве субстратов в ферментативных реакциях гидролиза, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы ацильные производные аминов, аминоспиртов, аминокислот, их эфиров и амидов, в частности природные антибиотики.

Пенициллинацилаза по изобретению может быть получена и использована в виде гомогенного препарата, раствора с содержанием других химических соединений или белков, мицелл, агрегатов, или в твердом состоянии в виде кристаллов, агрегатов или иммобилизированных в геле, на различных подложках и носителях препаратах, или применяется в виде культуры клеток.

Примеры улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы приведены ниже. Изменения в аминокислотную последовательность пенициллинацилазы из E.coli вводили путем конструирования мутантного гена методом сайт-специфического мутагенеза по методикам, описанным в литературе [6]. После процедур клонирования, культивирования, выделения и очистки были получены гомогенные препараты мутантов пенициллинацилазы.

Пример 1. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза цефалексина

Реакцию ферментативного синтеза цефалексина переносом ацильной группы на ядро антибиотика 7-аминодезацетоксицефалоспорановую кислоту проводили, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. При использовании варианта пенициллинацилазы βD484N наблюдается увеличение выхода продукта реакции от 1,5 до 1,9 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (см. табл. 1).

Таблица 1 Выход продукта реакции ферментативного синтеза цефалексина [7-ADCA]/[D-PGA], mM Выход цефалексина, % Дикий тип βD484N 200/200 40 60 200/400 39 73

Пример 2. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина

Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина переносом ацильной группы на глицин проводили в водной среде, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. Оказалось, что в случае варианта пенициллинацилазы βD484N выход продукта реакции увеличивается приблизительно в 4,7 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (табл. 2).

Таблица 2 Выход продукта в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина Вариант пенициллинацилазы Выход D-фенилглицил-глицина, % Дикий тип 17 βD484N 80

Описание экспериментальной части

Определение ферментативной активности

Активность вариантов пенициллинацилазы определяли спектрофотометрически по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамидо)бензойной кислоты при 400 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 (Япония). Реакцию проводили при 25°C в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,5, 0,1 М KCl.

Определение концентрации активных центров. Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом по методике [23]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата, как описано выше.

ВЭЖХ анализ

Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series (США); колонка Kromasil Eternity C18 (AkzoNobel, США), 250 x 4.6 мм, размер частиц 5 µм; подвижная фаза CH₃CN/вода 30:70, 0,68 г/л KH₂PO₄, 0,1 г/л додецилсульфата натрия, pH 3,0; скорость потока 0,7 мл/мин; объем вкола 10 мкл; УФ детектирование при 210 нм.

Проведение реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина

Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 9,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200 мМ D-фенилглицина, 200 мМ глицина, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.

Проведение реакции ферментативного синтеза цефалексина

Реакцию ферментативного синтеза цефалексина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 8,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200-400 мМ D-фенилглицина и 200 мМ 7-дезацетокси-цефалоспорановой кислоты, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.

Литература

1. Bruggink, A., Roos, E.G., De Vroom, E. Penicillin acylase in the industrial production of (3-lactam antibiotics. Org. Process. Res. Dev. (1998) 2, 128-133.

2. Svedas, V.K., Savchenko, M.V., Beltser, A.I., Guranda, D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N.-Y. Acad. Sci. (1996) 799, 659-669.

3. Guranda, D.T., Khimiuk, A.I., van Langen, L.M., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A., Svedas, V.K. An "easy-on, easy-off" protecting group for the enzymatic resolution of (±)-1-phenylethylamine in an aqueous medium. Tetrahedron: Asymm. (2004) 15(18), 2901-2906.

4. Rajendhran, J., Gunasekaran, P. Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases. J. Biosci. Bioeng. (2004) 97, 1-13.

5.Gabor, E.M. and Janssen, D.B. in Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17,571-579.

6. Jager, SAW., Shapovalova, I.V., Jekel, PA, Alkema, W.B.L, Svedas, V.K., Janssen, D.B. Saturation mutagenesis reveals the importance of residues a!phaR145 and alphaF146 of penicillin acylase in the synthesis of beta-lactam antibiotics. J. Biotechnol. (2008) 133, 18-26.

7. Wang, J., Zhang, Q., Huang, H., Yuan, Z., Ding, D., Yang, S., Jiang, W. Increasing synthetic performance of penicillin G acylase from Bacillus megaterium by site-directed mutagenesis. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74, 1023-1030.

8. Polizzi, K.M., phaparro-Riggers, J.F., yazquez-Figueroa, E., Bommarius, A.S. Structure-guided consensus approach to create a more thermostable penicillin G acylase. Biotechnol. J. (2006) 1(5), 531-6.

9. Chandel, A.K., Rao, L.V, Narasu, M.L., Singh, O.V., The realm of penicillin G acylase in beta-lactam antibiotics. Enzyme Microb. Technol. (2008) 42, 199-207.

10. Prieto, I., Martin, J., Arche, R., Fernandez, P., Perez-Aranda, A., Barbero, J.L. Penicillin acylase mutants with altered site-directed activity from Kluyvera citrophila. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990) 33, 553-559.

11. Shi, Y.F., Soumillion, P., Ueda, M. Effects of catalytic site mutations on active expression of phage fused penicillin acylase. J. Biotechnol. (2010) 145, 139-142.

12. Carboni, С., Kierkels, H.G., Gardossi, L, Tamiola, K., Janssen, D.B., Quaedflieg, P.J. Preparation of D-amino acids by enzymatic kinetic resolution using a mutant of penicillin-G acylase from E.coli. Tetrahedron: Asymmetry (2006) 17, 245-251.

13. Alkema, W.B., Hensgens, C.M., Snijder, H.J., Keizer, E., Dijkstra, B.W., Janssen, D.B. Structural and kinetic studies on ligand binding in wild-type and active-site mutants of penicillin acylase. Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17, 473-480.

14. Abian, 0., Grazu, V., Hermoso, J., Gonzalez, R., Garcia, J.L., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J.M. Stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli: site-directed mutagenesis of the protein surface to increase multipoint covalent attachment. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70, 1249-1251.

15. Kasche, V., Galunsky, В., Ignatova, Z. Fragments of pro-peptide activate mature penicillin amidase ofAlcaligenesfaecalis. Eur. J. Biochem. (2003) 270, 4721-4728.

16. Wang, Т., Zhu, H., Ma, X., Ма, Y., Wei, D. Structure-based stabilization of an enzyme: the case of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. Protein Pept. Lett. (2006) 13, 177-183.

17. Choi, K.S., Kim, J.A., and Kang, H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacteriol. (1992) 174, 6270-6276.

18. Lee, H., Park, O.K., and Kang, H.S. Identification of a new activ site for autocatalytic processing of penicillin acylase precursor in Escherichia coli ATCC 11105. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 272, 199-204.

19. Forney, L.J., Wong, D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. (1989) 55(10), 2550.

20. Roa, A., Garcia, J.L, Salto, F., Cortes, E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J. (1994), 303, P. 869.

21. Alkema, W.B., Hensgens, C.M., Kroezinga, E.H., de Vries, E., Floris, R., van der Laan, J.M., Dijkstra, B.W., Janssen, D.B. Characterization of the beta-lactam binding site of penicillin acylase of Escherichia coli by structural and site-directed mutagenesis studies. Protein Engineering (2000) 13(12), 857-863.

22. Alkema, W.B.L, Dijkhuis, A., de Vries, E., and Janssen, D.B. The role of hydrophobic activ-site residues in substrate specificity and acyi transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. (2002) 269, 2093-2100.

23. Швядас, В.К., Марголин, А.Л., Шерстюк, С.Ф., Березин, И.В. Инактивация пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонил фторида: кинетический анализ и титрование активных центров. Биоорган. химия (1977) 3, 546-553.

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой мутант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из E.coli, содержащий замену остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента в позиции 484 (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина. Изобретение позволяет получить пенициллинацилазу с улучшенными каталитическими свойствами. 2 табл., 2 пр.

Мутант пенициллинацилазы (Penicillin G acylase) из E.coli, содержащий замену остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента в позиции 484 (нумерация начинается с первого аминокислотного остатка бета-цепи, содержащей 557 аминокислотных остатков) остатком аспарагина.