СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА У РАБОТНИКОВ ХИМИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФОРМАЛЬДЕГИДА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и иммунологии, и направлено на выявление интегрального критерия, позволяющего оценить степень (пороговое значение) неблагоприятного воздействия формальдегида на организм человека, а именно на клеточный иммунитет. В качестве интегрального показателя предлагается использовать один из параметров клеточного иммунитета, поскольку именно иммунная система является ведущей регуляторной и защитной системой организма, первой реагирующей на изменение общего гомеостаза.

В связи с широчайшим использованием химических технологий в различных производственных циклах и сферах человеческой деятельности пристальное внимание ученых и медиков привлекает проблема выявления пороговых критериев, позволяющих на ранних этапах оценить, что воздействие вредного химического вещества превышает компенсаторные возможности организма и наносит вред здоровью человека. Актуальность исследования неблагоприятного воздействия формальдегида обусловлена его широчайшим использованием в качестве сырья для производства пластмасс, красок, синтетических смол и клеев, изоляционных материалов, дубильных веществ, дезинфицирующих и лекарственных средств, текстильных вспомогательных веществ; а также в качестве протравителя в сельском хозяйстве. Исходным сырьем для получения формальдегида является метанол. Показано, что работники предприятий, использующих в технологическом цикле метанол и формальдегид, сенсибилизированы к этим ксенобиотикам, что подтверждается их обнаружением в биологических средах организма (кровь, моча). Помимо этого формальдегид является одним из приоритетных загрязняющих веществ в атмосферном воздухе на территориях интенсивного промышленного освоения и выявляется в биологических средах проживающего в этих районах населения. Все это подтверждает необходимость тщательного исследования неблагоприятных последствий воздействия формальдегида на организм человека.

Известно, что метанол и формальдегид оказывают политропное действие на организм человека: поражают нервную и сосудистую систему, обладают выраженным раздражающим действием на слизистые оболочки, поражают кожу, вызывают расстройства зрения и обладают кумулятивным эффектом, а также вызывает глубокие нарушения клеточного и гуморального иммунитета. Особенно ярко выражены эти изменения у лиц, имеющих длительный и постоянный контакт с промышленными ксенобиотиками (у работников химических производств), что усугубляет их неблагоприятное воздействие. Иммунная система, являясь основной защитной системой организма, в первую очередь реагирует на воздействие ксенобиотических факторов, поэтому целесообразно оценивать степень воздействия химических токсикантов, основываясь на изменениях со стороны иммунной системы.

Из уровня техники известен способ диагностики иммунодефицитного состояния (Патент РФ №2179316), согласно которому выполняют проведение оценки как процентного содержания Т-клеток в периферической крови относительно региональной нормы, так и иммунореактивности клеток в нагрузочном тесте розеткообразования in vitro с T-активином и определение показателя относительного содержания T-клеток (ПОТ) и показателя реактивности T-клеток (ПРТ). Техническим результатом известного способа является диагностика иммунодефицитных состояний, определение компенсированных и декомпенсированных форм.

Однако указанным известным способом невозможно достоверно и точно установить связь иммунитета населения с неблагоприятной экологической обстановкой среды проживания, т.к. этим способом устанавливается лишь факт ухудшения иммунного состояния человека без установления причины этого ухудшения. Поэтому последующие лечебные мероприятия могут оказаться безрезультатными, если не установить причину заболевания.

Также известен способ диагностики нарушения иммунного статуса у детей в условиях химической контаминации (Патент РФ №2494401), согласно которому производят отбор пробы крови у детей, проживающих в условиях химической контаминации. Затем выполняют клинико-лабораторные исследования крови на содержание вредных химических соединений. Далее у детей проводят ультразвуковое исследование селезенки для оценки ее эхо-структуры с использованием датчика частотой не менее 10 МГц. При наличии в ультразвуковом срезе селезенки гипоэхогенных однородных округлых включений размером 0,3-1,0 мм, расположенных на расстоянии 1,5-2 мм друг от друга, а также при одновременном превышении концентрации вредного химического соединения в крови по сравнению с его референтным значением диагностируют реактивные изменения специфического иммунитета у детей. Изобретение обеспечивает создание информативного, безопасного и точного способа ультразвуковой диагностики при одновременной простоте и доступности для широкого практического применения.

Однако указанный известный способ диагностики предназначен только для детей промышленного региона и не применим у взрослых, поскольку не учитываются условия химического производства. Также не проводится анализ клеточного иммунитета, а ультразвуковое исследование селезенки на периодическом медицинском осмотре всем работающим на химическом производстве не проводится в соответствии с приказом №302н от 12.04.2011 г. Поэтому использование данного способа диагностики не дает возможности оценить влияние химических веществ на состояние клеточного иммунитета в условиях контаминации химического производства.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ оценки влияния экологической обстановки на состояние иммунного статуса населения (Патент РФ №2180116). При реализации известного способа устанавливают в пробе венозной крови содержание химического вещества, обусловленного экологической средой обитания населения, выделяют из пробы лимфоциты (мононуклеарные клетки) и добавляют к ним установленное химическое вещество в концентрации, соответствующей норме, полученную смесь инкубируют при температуре, соответствующей нормальной температуре организма человека, далее методом иммунологического анализа устанавливают в пробе количество лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, обусловленных воздействием химического вещества, и при снижении количества соответствующих кластеров лимфоцитов в пробе под воздействием химического вещества не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной пробой без введенного в нее дополнительно химического вещества, при одновременном обнаружении химического вещества в пробе крови в концентрации, превышающей норму, судят об ухудшении состояния иммунитета. Недостатком указанного известного способа является определение влияния экологической обстановки, а не условий химических производства. Также не учитывается превышение концентрации химического вещества выше фоновых концентраций в крови обследуемых. Это не дает возможность достоверно оценить состояние иммунной системы работников в условиях химического производства.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в повышении информативности оценки влияния ксенобиотика - формальдегида, на нарушение клеточного иммунитета организма работников химических производств.

Указанный технический результат достигается предлагаемым способом диагностики нарушений клеточного иммунитета у работников химических производств при воздействии формальдегида, включающим отбор пробы венозной крови у работников, установление в ней концентрации формальдегида, определение в ней количества лимфоцитов - основных параметров T-клеточного иммунитета, и установление критериального показателя, по которому судят о нарушении клеточного иммунитета, ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ тем, что в качестве основных параметров T-клеточного иммунитета определяют в процентах число активированных T-лимфоцитов CD3⁺CD95⁺ и также определяют в процентах число T-регуляторных лимфоцитов CD4⁺CD25⁺CD127^-, а в качестве критериального показателя используют интегральный показатель, равный отношению установленного процента числа CD3⁺CD95⁺ - лимфоцитов к проценту числа CD4⁺CD25⁺CD127^- - лимфоцитов, и при значении этого интегрального показателя, равного и более 40, диагностируют нарушение клеточного иммунитета у работников химических производств при воздействии формальдегида.

В предлагаемом способе в качестве информативного критерия оценки нарушений клеточного иммунитета под влиянием формальдегида используется интегральный показатель, который рассчитывается как отношение процента CD3 - позитивных лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих молекулу CD95, к проценту T-регуляторных клеток. Значение этого показателя менее 40 свидетельствует о незначительном (допустимом) воздействии формальдегида, не требующем иммунокоррекции, тогда как повышение этого показателя у работников химических производств более 40 свидетельствует о превышающем адаптационные возможности иммунной системы воздействии формальдегида и о глубоких нарушениях клеточного иммунитета, требующих незамедлительной коррекции. Предлагаемый способ учитывает не только количественные (количество CD3 - лимфоцитов, T-регуляторных клеток), но и функциональные параметры T-клеточного звена иммунитета (экспрессия молекулы CD95 на T-лимфоцитах, отражающая активационный статус клетки и ее готовность вступить в апоптоз), а также предлагает удобный вариант "количественной" оценки степени воздействия формальдегида на клеточный иммунитет работников.

Указанный технический результат обеспечивается за счет следующего.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы венозной крови, а также стандартных методик изучения иммунологических параметров обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Для определения предлагаемого интегрального критерия используется отношение CD3 - позитивных лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих молекулу CD95, к проценту T-регуляторных клеток, определяемых как количество CD4 - позитивных T-лимфоцитов периферической крови, высокоэкспрессирующих активационный маркер CD25, но негативных по экспрессии CD127. Определение CD3 - позитивных лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих молекулу CD95 (CD3⁺CD95⁺, %) и количества T-регуляторных клеток (CD4⁺CD25⁺CD127^-, %) в периферической крови проводится методом иммунофлюоресценции с использованием коммерческих антител согласно методике производителя. Данные методы являются стандартными общепринятыми методами, позволяющими получить корректные высокоточные и информативные результаты.

Известно, что влияние химических токсикантов на организм человека приводит к угнетению, главным образом, клеточного звена иммунитета. Основными факторами, регулирующими степень активации/угнетения клеточных реакций, являются T-регуляторные клетки (Трег). T-регуляторные клетки позиционируются как истинные "супрессоры" иммунных реакций, угнетающие эффекторные Т-клетки. T-регуляторные клетки играют ведущую роль в контроле аутоиммунных реакций в формировании периферической толерантности при онкологических заболеваниях, беременности. Апоптоз также является ведущим механизмом регуляции степени активации клеток. Экспрессия CD95 (Fas/APO-1) - активационного маркера характеризует способность клетки вступать в апоптоз. Определение экспрессии CD95 на CD3-лимфоцитах (общая субпопуляция T-лимфоцитов) позволяет оценить общий потенциал готовности к апоптозу T-клеточного звена иммунитета.

Известно, что воздействие формальдегида приводит к угнетению субпопуляции T-регуляторных клеток (снижает их генерацию), что приводит к недостаточности контроля апоптоза эффекторных субпопуляций T-лимфоцитов и компенсаторно вызывает повышение экспрессии CD95 на поверхности CD3-лимфоцитов периферической крови. Поэтому для оценки степени негативного влияния формальдегида на клеточное звено иммунитета предлагается в заявляемом способе использовать отношение процента CD3⁺CD95⁺ к проценту T-регуляторных клеток (CD4⁺CD25⁺CD127^-) периферической крови.

Для определения диагностической значимости предлагаемого интегрального показателя проанализировано содержание T-регуляторных клеток и экспрессия CD95 на поверхности CD3-лимфоцитов периферической крови у работников химического производства, непосредственно контактировавших с метанолом и формальдегидом. Критерием включения в обследуемую группу был возраст от 46 до 48 лет и стаж работы на вредном производстве от 18 до 22 лет. У работников также было проанализировано содержание формальдегида и его предшественника метанола в сыворотке крови. Все данные подвергнуты статистической обработке с помощью программы «Statistika-6.0» и «StatPlus 2009 Professional 5.8.4». Данные представлены в виде средней статистической величины и стандартной ошибки (M±m). Достоверность определялась непараметрическими методами, при сравнении двух независимых выборок использовался критерий Манна-Уитни. При сравнении двух групп нулевая гипотеза отклонялась при значении альфа-ошибки менее 0,05.

Установлено, что у тех работников, у которых содержание формальдегида в сыворотке крови не превышало допустимой нормы (менее 0,006 мг/дм³) (это фоновая концентрация формальдегида), значение интегрального показателя не превышало 40. Тогда как у тех работников химического производства, у которых содержание формальдегида было выше допустимой нормы (более 0,006 мг/дм³) значение интегрального показателя было выше 40, что свидетельствует о глубоких нарушениях клеточного иммунитета.

Таким образом, установлено численное значение интегрального показателя, что позволяет количественно оценивать степень негативного воздействия формальдегида на клеточное звено иммунитета.

Предложенный интегральный показатель позволяет определить величину эффекта неблагоприятного воздействия формальдегида на клеточный иммунитет как на индивидуальном, так и на популяционном уровнях, а также позволяет на ранних этапах процесса дезадаптации принимать решения о коррекционных и профилактических мероприятиях по снижению экзогенной контаминации формальдегидом.

Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. Производят забор периферической венозной крови утром натощак в пробирку, содержащую гепарин.

2. Осуществляют выделение суспензии лейкоцитов из венозной гепаринизированной крови, используя буфера для лизиса эритроцитов (название, фирма, страна), согласно инструкции производителя.

3. Фенотипирование лимфоцитов проводится методом проточной цитометрии на цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» («BD», USA) с использованием программы CellQuest-PrO («BD», USA). Определяют субпопуляции CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов, CD4⁺CD25⁺CD127^--лимфоцитов (T-регуляторные клетки) с использованием панелей меченых моноклональных антител (МКАТ) к мембранным CD-рецепторам («BD», USA). Для исследования кровь с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) разводили в два раза раствором хлорида натрия (9 г/л, pH 7,2), наслаивали на 3 мл градиента плотности фиколла-урографина (концентрация фиколла составляла 9%, плотность градиента - 1,077 г/мл) и центрифугировали 30 мин при 1500 об/мин.

Образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеарных клеток отбирали пипеткой, полученную клеточную взвесь дважды отмывали раствором хлорида натрия (9 г/л, pH 7,2).

Полученную взвесь мононуклеаров ресуспендировали в рабочем растворе (объемное соотношение концентрированный буфер: дистиллированная вода как 1:9) фосфатно-солевого буфера (PBS) для окрашивания до концентрации 1×10⁶ клеток/мл. Причем в состав фосфатно-солевого буфера PBS входила смесь солей: хлорида натрия, гидроортофосфата натрия, дигидроортофосфата натрия и азида натрия, с pH 7,2.

4. Рассчитывали интегральный показатель как отношение процента CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов к проценту CD4⁺CD25⁺CD127^--лимфоцитов.

5. У тех обследуемых работников, у кого значение интегрального показателя превышало 40, прогнозировали нарушение клеточного иммунитета за счет повышенной активности воздействия формальдегида на уровень T-регуляторных клеток. Используя эту информацию, в дальнейшем осуществляли в отношении этих работников элиминационные и корректирующие иммунитет программы.

Для доказательства адекватности выбранного значения интегрального показателя и характеристики степени влияния формальдегида на клеточный иммунитет было обследовано 52 работника химического производства. Из указанных работников 24 человека не имеют в пробах крови превышения фоновых уровней формальдегида, а 28 человек имеют превышение фоновых уровней формальдегида. У всех обследуемых была взята венозная кровь, исследование которой проводилось по вышеуказанной схеме. Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблицах 1 и 2.

В таблице 1 приведены основные параметры T-клеточного иммунитета работников химического производства, уровень контаминации формальдегидом пробы крови которых не превышает фоновых концентраций. У этих работников рассчитаны значения интегрального показателя (отношение процента CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов к проценту CD4⁺CD25⁺CD127^--лимфоцитов).

В таблице 2 приведены основные параметры T-клеточного иммунитета работников химического производства, уровень контаминации формальдегидом пробы крови которых превышает фоновые значения. Также рассчитаны значения вышеприведенного интегрального показателя.

Данные исследований показали, что во второй группе работников с превышением уровня контаминации формальдегидом процент как CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов, так и CD4⁺D25⁺CD127^- - лимфоцитов достоверно отличались (p<0,05) от аналогичных показателей в группе работников (первая группа), имеющих уровень формальдегида в крови, не превышающий фоновые, что свидетельствует о глубоких нарушениях клеточного иммунитета под влиянием высоких концентраций формальдегида. Это подтверждается и высокими значениями интегрального показателя (более 40) у работников этой группы.

Для обоснования минимального порогового значения интегрального показателя (равного 40) по соотношению CD3⁺CD95⁺ %/CD4⁺CD25⁺CD127^- %, которое бы характеризовало нарушения клеточного иммунитета, исходили из следующего принципа.

Рассчитывали среднее арифметическое значение интегрального критерия по показателям первой группы (равное 32,43; таблица 1), к которому прибавляли среднее арифметическое отклонение, рассчитанное также по показателям у работников первой группы (равное 6,51 таблица 1), что в сумме составляет величину, близкую к 40 (принимая при этом во внимание математическую погрешность). Такой подход позволяет характеризовать границу влияния (нижнее пороговое значение) химического фактора, когда действие химического фактора переходит через границу компенсаторных возможностей организма, что приводит к нарушениям клеточного иммунитета у работников химического производства.

Таким образом, рекомендуемый к определению интегральный показатель (равный и более 40) позволяет диагностировать наличие, степень и направленность нарушений здоровья при экспозиции формальдегида по изменению самой чувствительной из систем - иммунной, и, в свою очередь, по изменению самых чувствительных показателей T-клеточного звена иммунитета.

Установленные значения интегрального показателя позволят не только определить степень выраженности интоксикации и нарушений клеточного иммунитета, но и вовремя провести лечебные и профилактические мероприятия как на индивидуальном (программа по детоксикации и иммуномодуляции), так и в целом на предприятии (мероприятия на источниках и реабилитационные мероприятия).

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и пола из группы работников с повышенным содержанием формальдегида в крови и работников с содержанием формальдегида в пределах фоновой концентрации.

Пример 1

Мужчина 46 лет, стаж работы на производстве 27 лет. Определяется уровень формальдегида в крови выше фоновых уровней - 0,008 мг/дм³. Иммунологические показатели крови имели следующие значения: CD3⁺-лимфоциты 65%, 2,08×10⁹/дм³; CD3⁺CD4⁺-лимфоциты 44%, 1,41×10⁹/дм³; CD3⁺CD8⁺-лимфоциты 19%, 0,61×10⁹/дм³; CD19⁺-лимфоциты 12%, 0,38×10⁹/дм³; CD16⁺56⁺ 11%, 0,35×10⁹/дм³, CD3⁺CD25⁺-лимфоциты 9%, 0,29×10⁹/дм³, CD3⁺CD95⁺-лимфоциты 39%, 1,02×10⁹/дм³, CD4⁺CD8⁺ 2,32; CD4⁺CD25⁺CD127 - 0,43%, 0,022×10⁹/дм³; Абсолютный фагоцитоз 2,07, фагоцитарное число 0,69, фагоцитарный индекс 1,53, IgG - 12, IgA - 2,01, IgM - 1,02. Значение интегрального показателя - 90,7 (т.е. выше 40). При анализе показателей иммунологического обследования выявлены нарушения клеточного иммунитета, обусловленные действием формальдегида, а именно, при снижении экспрессии маркера CD4⁺CD25⁺CD127^- повышаются риски развития аутоиммунных патологий и аллергических заболеваний.

Пример 2

Мужчина 50 лет, стаж работы на производстве 26 лет. Определяется уровень формальдегида в крови в пределах фоновых уровней - 0,004 мг/дм. Иммунологические показатели крови имели следующие значения: CD3⁺-лимфоциты 65%, 2,08×10⁹/дм³; CD3⁺CD4⁺-лимфоциты 43%, 1,23×10⁹/дм³; CD3⁺CD8⁺-лимфоциты 24%, 0,68×10⁹/дм³; CD19⁺-лимфоциты 7%, 0,2×10⁹/дм³; CD16⁺56⁺ 11%, 0,31×10⁹/дм³, CD3⁺CD25⁺-лимфоциты 13%, 0,37×10⁹/дм³, CD3⁺CD95⁺-лимфоциты 51%, 1,31×10⁹/дм³, CD4⁺CD8⁺ 1,79; CD4⁺CD25⁺CD127 - 2,69%, 0,187×10⁹/дм³; Абсолютный фагоцитоз 2,79, фагоцитарное число 0,68, фагоцитарный индекс 1,55, IgG - 13,11, IgA - 2,35, IgM - 1,1. Значение интегрального показателя - 18,96. При анализе данных иммунологического обследования нарушений клеточного иммунитета, обусловленных действием формальдегида, выявлено не было. Это доказывается тем, что уровень экспрессии маркеров CD3⁺CD95⁺ и CD4⁺CD25⁺CD127^- находятся в пределах нормы. А риски развития аутоиммунных и аллергических заболеваний от воздействия формальдегида минимизируются.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа обеспечивается его назначение и обеспечивается достоверность диагностики.

Изобретение относится к области медицины и иммунологии, и направлено на выявление неблагоприятного воздействия формальдегида на организм человека, а именно на клеточный иммунитет. Сущность способа: производят отбор пробы венозной крови у работников, устанавливают в ней концентрацию формальдегида, определяют количество лимфоцитов - основных параметров T-клеточного иммунитета, затем устанавливают критериальный показатель, по которому судят о нарушении клеточного иммунитета. В качестве основных параметров T-клеточного иммунитета определяют в процентах число активированных T-лимфоцитов CD3⁺CD95⁺ и также определяют в процентах число T-регуляторных лимфоцитов CD4⁺CD25⁺CD127^-, а в качестве критериального показателя используют интегральный показатель, равный отношению установленного процента числа CD3⁺CD95⁺ - лимфоцитов к проценту числа CD4⁺CD25⁺CD127^- - лимфоцитов. При значении этого интегрального показателя, равного и более 40, диагностируют нарушение клеточного иммунитета у работников химических производств при воздействии формальдегида. Использование изобретения обеспечивает повышение информативности оценки влияния ксенобиотика - формальдегида, на нарушение клеточного иммунитета организма работников химических производств. 2 табл., 2 пр.

Способ диагностики нарушений клеточного иммунитета у работников химических производств при воздействии формальдегида, включающий отбор пробы венозной крови у работников, установление в ней концентрации формальдегида, определение в ней количества лимфоцитов - основных параметров Т-клеточного иммунитета, и установление критериального показателя, по которому судят о нарушении клеточного иммунитета, отличающийся тем, что в качестве основных параметров Т-клеточного иммунитета определяют в процентах число активированных Т-лимфоцитов CD3⁺CD95⁺ и также определяют в процентах число Т-регуляторных лимфоцитов CD4⁺CD25⁺CD127^-, а в качестве критериального показателя используют интегральный показатель, равный отношению установленного процента числа CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов к проценту числа CD4⁺CD25⁺CD127^--лимфоцитов, и при значении этого интегрального показателя, равного и более 40, диагностируют нарушение клеточного иммунитета у работников химических производств при воздействии формальдегида.