Способ ранней диагностики вторичного иммунодефицита у детей в условиях избыточной контаминации биосред алюминием Российский патент 2025 года по МПК G01N33/68 G01N33/49 G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области профилактической медицины, экологии человека, педиатрии и может быть использовано для ранней диагностики и прогнозирования токсического действия алюминия на проявление вторичного иммунодефицита у детей. Изобретение предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия алюминия, поступающего из окружающей среды, на здоровье ребенка, проживающего на территориях с повышенным содержанием этого токсиканта в атмосферном воздухе и в питьевой воде.

Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ наблюдения и лечения, в зависимости от степени проявлений признаков вторичного иммунодефицита у ребенка, а, кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, в частности алюминия, обуславливающего формирование этого заболевания у детей.

Согласно Международной классификации болезней, под термином «вторичный иммунодефицит» понимают нарушения иммунитета, возникающие в результате соматических и других болезней, а также прочих неблагоприятных для организма факторов. Поэтому вторичный иммунодефицит не является отдельной нозологической формой. Это приобретенный клинико-иммунологический синдром.

Развитие вторичного иммунодефицита утяжеляет течение заболеваний, снижает эффективность их терапии, способствует формированию осложнений. Вторичные иммунодефициты рассматриваются как факторы риска развития хронических инфекционных заболеваний, аутоиммунной патологии, аллергических болезней и опухолевого роста (Новикова И.А. Вторичные иммунодефициты: клинико-лабораторная диагностика / Проблемы здоровья и экологии. 2009. - №1 (19). - с. 29-34).

Причины вторичных форм более обширны и включают ряд категорий, в том числе экзогенные вредные воздействия. Иммунитет ухудшается под влиянием физических факторов: ионизирующего излучения, высокой или низкой температуры, радиоактивных волн, что часто связано с местом проживания ребенка. Причиной иммунного расстройства также может послужить загрязнение окружающей среды пестицидами и промышленными выбросами.

Актуальность исследования неблагоприятного воздействия алюминия особенно обусловлена на территориях, вблизи которых размещены предприятия цветной металлургии.

В настоящее время в атмосферном воздухе промышленных центров присутствует смесь химических загрязнителей от предприятий и автотранспорта, включающая взвешенные вещества, металлы, органические и неорганические вещества.

Алюминий один из самых распространенных металлов в земной коре (около 8% от ее массы), однако он практически не усваивается живыми организмами (в т.ч. растениями, за исключением чая). В организме человека алюминия больше всего в легких (до 43 мг/кг), а его суммарное содержание составляет не более 50 мг. Долгое время считалось, что алюминий не оказывает существенного отрицательного эффекта на организм человека, однако сейчас эти представления изменились. “Алюминиевое легкое”, или алюминоз легких - профессиональное заболевание, развивающееся в результате вдыхания алюминиевого дыма или алюминиевой пыли с высокой концентрацией частиц металла диаметром менее 5 мкм. Поэтому поиск новых диагностических критериев в виде маркерных показателей конкретных заболеваний от воздействия алюминия является актуальной задачей.

Из уровня техники известно, что в настоящее время большинство способов диагностики проявлений вторичного иммунодефицита основано на использовании в качестве маркеров показателей крови, а также генетических критериях.

Патентом РФ №2137129 защищен «Способ диагностики вторичного иммунодефицита». Исследуют кровь пациента, в которой определяют содержание Т-, В-лимфоцитов и иммуноглобулинов А, М, G. Выявляют три наиболее отличающихся от нормы показателя, указывающих на направление динамики иммунологических параметров и имеющих свою характерную особенность для той или иной патологии. Совокупность этих трех показателей условно может быть названа формулой расстройств иммунной системы (ФРИС). Формула позволяет определить поврежденное звено иммунной системы, то есть диагностировать иммунодефицит. Однако его недостатки заключаются в том, что он позволяет констатировать уже состоявшиеся грубые нарушения рутинных компартментов иммунитета, а идентификацию ранних начальных изменений на уровне генетических (полиморфизмы кандидатных генов) и иммунологических (Т-регуляторные лимфоциты) регуляторных профилей, когда можно предотвратить наступление стойких и выраженных клинических проявлений, данный способ не обеспечивает.

Из патента РФ № 2504784 известен способ диагностики вторичной иммунологической недостаточности при туберкулезе легких. Согласно этому способу до назначения специфической химиотерапии проводят иммунологическое исследование периферической крови больных туберкулезом легких и определяют клеточные, гуморальные и молекулярно-генетические параметры иммунного статуса пациента. При содержании в периферической крови CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ регуляторных Т-клеток более чем 2,6%, CD4⁺CD25^-Foxp3⁺ регуляторных Т-клеток более чем 5,1%, CD3⁺CD4^-CD25⁺ регуляторных Т-клеток более чем 0,2%, CD4⁺CD25⁺Foxp3^- регуляторных Т-клеток/Т-хелперов активированных менее чем 25,5%, CD3⁺CD4⁺CD25^- Т-хелперов менее чем 35,4%, γδТ-лимфоцитов менее чем 4,9%, CD45R0⁺ Т-клеток памяти менее чем 8,9%; IL-2 менее чем 22,3 пг/мл, IL-4 более чем 40,0 пг/мл, IL-10 более чем 25,3 пг/мл, TGFβ более чем 1109,0 пг/мл одновременно с носительством аллеля G и генотипа GG T-330G гена IL2 и аллеля А и генотипа АА С-592А гена IL10, аллеля Т и генотипа ТТ С-509Т гена TGFB и аллеля Т и генотипа ТТ С-590Т гена IL4, диагностируют вторичную иммунологическую недостаточность. Изобретение позволяет своевременно диагностировать дефекты иммунной системы у больных туберкулезом легких и применять меры коррекции лечебного воздействия с использованием современных методов иммуномодулирующей терапии. Недостатками известного способа являются ограниченные функциональные возможности диагностики иммунодефицита только у больных туберкулезом легких.

Из патента РФ № 2749781 известен способ диагностики вторичного иммунодефицита у военнослужащих - участников военных конфликтов. При реализации этого способа в крови военнослужащего определяют относительное количество регуляторных Т-лимфоцитов CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺. Дополнительно определяют экспрессию Toll-подобных рецепторов на моноцитах TLR4. При одновременном выполнении условий CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺≥0,9 и TLR4≤16 диагностируют вторичный иммунодефицит.

Однако этот способ, по-видимому, не применим для детей, т.к. нет клинических испытаний на этой категории пациентов. Кроме того, он не учитывает влияние химических токсикантов, в частности алюминия, на возникновение вторичного иммунодефицита.

В патенте РФ № 2747658 описан способ прогнозирования формирования вторичного иммунодефицита у военнослужащих-участников военных конфликтов. Сущность способа заключается в том, что у военнослужащего выполняют забор венозной крови, в которой определяют, %: экспрессию Toll-подобных рецепторов на моноцитах TLR4 и относительное количество регуляторных Т-лимфоцитов (CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺). Вычисляют значение коэффициента прогнозирования по формуле K=0,29-0,05xTLR4+0,64x(CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺). При выполнении условия К>0,48 прогнозируют формирование вторичного иммунодефицита у военнослужащих-участников военного конфликта.

Однако данный способ не учитывает основной фактор, определяющий прогноз на формирование вторичного иммунодефицита с участием данных иммунологических маркеров, это полиморфное состояние генов данных рецепторов, отсюда точность прогноза и определения самого вторичного иммунодефицита будет недостаточной для установления ранних иммунологических нарушений, а также не поясняет степень влияния на формирование вторичного иммунодефицита химического поллютанта (алюминия).

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ диагностики вторичных иммунодефицитных состояний человека, связанных с химическим контаминантом (Патент РФ № 2452963). Согласно известному способу отбирают пробы биологического материала из ротоглотки или из полости носа, осуществляют выделение ДНК, проводят ПЦР с использованием одновременно трех праймеров: LMP гена Эпштейна-Барр (ЭБВ), MIE гена цитомегаловируса (ЦМВ), pol гена вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6). В качестве внутреннего контрольного образца (ВКО) используют β-глобиновый ген человека. По полученным в процессе ПЦР-амплификации данным рассчитывают количественное содержание в исследуемой пробе конкретной вирусной ДНК по формуле. Для каждой вирусной ДНК определяют индекс, в пробе крови устанавливают количественное содержание химического контаминанта, техногенно значимого на территории проживания, определяют наличие или отсутствие превышения этого контаминанта над его референтным значением, находят сумму индексов ЭБВ, ЦМВ, ВГЧ-6 и при ее значении более 1,0 и при одновременном превышении концентрации химического контаминанта в крови диагностируют вторичное иммунодефицитное состояние.

Недостатком указанного известного способа является то, что он позволяет характеризовать количественное содержание только трех вирусов герпетической группы в организме человека, что сужает информативность.

Кроме того, известный способ был реализован только для химических токсикантов: хлороформа, свинца и дихлорэтана, и нет результатов его применения при воздействии на здоровье детей соединений алюминия.

Также к недостаткам известного способа следует отнести генетический анамнез исключительно воздействующего, вызывающего вторичный иммунодефицит фактора – вирусной нагрузки, а генетические возможности иммунных компартментов способом не представлены, что снижает его информативность и точность.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в создании информативного и доказательного способа ранней диагностики развития вторичного иммунодефицита у детей в условиях избыточной контаминации биосред алюминием.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом ранней диагностики вторичного иммунодефицита у детей в условиях избыточной контаминации биосред алюминием, включающим определение токсикологических, лабораторных и генетических показателей у ребенка, по которым диагностируют наличие вторичного иммунодефицита, при этом новым является то, что в качестве токсикологических показателей определяют в моче ребенка содержание алюминия, в качестве лабораторных показателей определяют в крови уровень специфического иммуноглобулина G (IgG) к алюминию и уровень Т-регуляторных лимфоцитов CD127^-, а в качестве генетических показателей определяют полиморфизм гена рецептора клеточной гибели FAS и гена толл-подобного рецептора TLR4 при помощи метода полимеразной цепной реакции, путем исследования генотипов гена FAS C14405T (rs1159120) и генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911), и при одновременном выполнении следующих условий: при содержании алюминия в моче ребенка 0,012 мг/дм³ и более, при превышении не менее чем в 1,2 раза уровня IgG к алюминию по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е., при снижении не менее чем в 1,1 раза уровня CD127^- по сравнению с нижней границей нормы, равной 1,2%, а также при наличии дикого гомозиготного генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120) и вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911), диагностируют у ребенка развитие вторичного иммунодефицита в условиях избыточной контаминации биосред алюминием.

В качестве метода полимеразной цепной реакции используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Для задач оценки степени воздействия среды обитания на здоровье, ранней диагностики нарушений здоровья, а также для выбора эффективной профилактики и лечения, актуальным является выделение маркерных диагностических показателей конкретных заболеваний или их предвестников у человека под воздействием алюминия, которые могут использовать в качестве индикаторов нарушения гомеостаза и в качестве дополнительных диагностических критериев санитарно-эпидемиологической обстановки.

В качестве критериев раннего проявления вторичного иммунодефицита в условиях контаминации алюминием в предлагаемом способе рекомендуется использовать одновременно данные о вариантном гомозиготном генотипе гена толл-подобного рецептора TLR4 A8595G (rs1927911), отвечающего за экспрессию рецептора дендритных клеток врожденного иммунитета, и данные о диком гомозиготном генотипе гена FAS C14405T (rs1159120).

Известны результаты исследований указанных генов по отдельности. Так, например, ген FAS кодирует белок Fas-рецептор, который играет центральную роль в физиологической регуляции запрограммированной гибели клеток. Ген вовлечен в патогенез различных злокачественных новообразований и заболеваний иммунной системы [Гамисония А.М. Ген FAS: [Электронный ресурс] // ГЕНОКАРТА Генетическая энциклопедия. 2020. – URL: https://www.genokarta.ru/gene/FAS].

Мутации гена FAS вызывают нарушение апоптоза (запрограммированной клеточной гибели), что приводит к потере контроля над пролиферацией лимфоцитов. Вследствие этого активированные лимфоциты накапливаются в лимфоидных органах, что выражается в развитии лимфаденопатии и спленомегалии.

В качестве критерия возникновения иммунодефицитных состояний в условиях избыточной контаминации алюминием рекомендуется использовать СС - дикий гомозиготный генотип гена FAS C14405T (rs1159120), отвечающего за запуск процесса апоптоза (клеточной гибели), механизм которой регулирует количество иммунокомпетентных клеток, когда избыточность экспрессии рецептора клеточной смерти (FAS-рецептора) создаются условия для формирования дефицита иммуноцитов как количественного, так и качественного, а также создает условия для компенсаторной экспрессии картированного на мембране рецептора CD127+ - антагониста регуляторных Т-лимфоцитов, а выступающий в качестве адъюванта алюминий служит катализатором, ускоряющим процессы клеточной гибели, способствующим переключению (инверсии) Th1 ответа на Th2 с компенсаторным, но не эффективным в отношении противовирусного иммунитета антителообразованием.

Ген толл-подобного рецептора TLR4 отвечает за экспрессию рецептора дендритных клеток врожденного иммунитета, ассоциированных с развитием воспалительного процесса. Лабораторные исследования показали, что врожденные иммунные реакции участвуют в возрастании ее частотности. Было проведено исследование для определения того, влияют ли гены Toll-like рецептора 2 и 4 (TLR2 и TLR4) на восприимчивость к неблагоприятным последствиям загрязнения воздуха, связанного с трафиком, в отношении распространенности астмы у детей.

Полиморфизмы TLR4 были связаны с аутоиммунными заболеваниями кожи.

Другие системные заболевания, такие как болезнь Крона и язвенный колит, показали повышенную экспрессию TLR4. Те же результаты были применены и к воспалению пластинки хориона. При астме было обнаружено, что генетический анализ TLR4 rs1927914 связан с тяжестью астмы. Было также обнаружено, что полиморфизмы гена TLR4 связаны с болезнью Бехчета.

Результаты подтверждают, что врожденный иммунитет опосредованный TLR4, играет важную роль в патогенезе витилиго.

Измененный генотип гена толл-подобного рецептора 4 типа TLR4 (A8595G) (rs1927911), отменяет защитные эффекты толл-подобных рецепторов, обеспечивающих антигенную противовирусную защиту и функционирование клеточных образований врожденного иммунитета, переключая на ассоциированный с редким генотипом гена TLR4 (A8595G) (rs1927911) атопический, гиперэргический вариант иммунных реакций.

Показателем, характеризующим сам феномен негативной гаптенной активации, свидетельствующей об участии в иммунорегуляторных процессах алюминия, является содержание IgG к алюминию. Уровень IgG к алюминию характеризует сам феномен специфической сенсибилизации.

Подтверждающим фактором нарушений иммунной регуляции служит снижения содержания регуляторных кластеров клеточной дифференцировки – Т-регуляторных лимфоцитов (CD127-).

Усугубляющим и реализующим фактором процесса иммунного дисбаланса служит контаминация биосред алюминием, превышающая фоновую концентрацию (референтный уровень алюминия в моче составляет менее 0,01 мг/дм³).

Алюминий один из самых распространенных металлов в земной коре (около 8% от ее массы), однако он практически не усваивается живыми организмами (в т.ч. растениями, за исключением чая). Алюминий — тяжелый металл с известным нейротоксическим действием на нервную систему человека и животных. Алюминий, находящийся в окружающей среде и в детских вакцинах, может влиять на здоровье наших детей. Алюминий накапливается в печени, поджелудочной и щитовидной железах.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб буккального эпителия (при определении наличия генов) и мочи, а также стандартных методик изучения иммунологических и генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта – алюминия, именно в моче, обусловлено тем, что эта биосреда является средой преимущественной элиминации из организма данного элемента, имеющего реферируемые уровни в данной биологической среде.

Именно благодаря расширению информационных показателей и будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния алюминия на риск развития вторичного иммунодефицита у детей, ассоциированного с контаминацией биосред алюминием.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки) обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) проведения генотипирования полиморфизма указанных генов TLR4 и FAS.

Таким образом, для установления ранних проявлений вторичного иммунодефицита у детей, ассоциированного с содержанием алюминия в моче, рекомендуется использование методического подхода, основанного на определении генотипов кандидатных генов, и в случае вариантного гомозиготного генотипа GG гена толл-подобного рецептора TLR4 (A8595G) (rs1927911) и дикого гомозиготного генотипа СС гена рецептора клеточной гибели FAS C14405T (rs1159120), избыточном содержании алюминия в моче, превышающем фоновый уровень не менее чем в 1,2 раза, отклонения от физиологической нормы содержания IgG специфического к алюминию в виде его гиперпродукции, снижении не менее чем в 1,1 раза уровня CD127^- по сравнению с нижней границей нормы, равной 1,2%, регистрируют наличие ранних проявлений вторичного иммунодефицита у детей, ассоциированного с избыточной контаминацией биосред алюминием.

Клиническая значимость предлагаемых диагностических показателей доказана методом корреляционно-регрессионного анализа, а также доказана дополнительная информационная связь изменений указанных совокупных критериев с превышением в моче над нормой содержания алюминия, что делает предлагаемый способ точным и достоверным.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности всех операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

При реализации предлагаемого способа осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:

1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории одного из городов Пермского края, характеризующейся наличием в атмосферном воздухе повышенных концентраций алюминия (до 1,2 ПДК м.р.).

Затем проводят отбор пробы мочи для определения содержания алюминия, а также проводят отбор пробы крови для определения уровня IgG к алюминию и уровня Т-регуляторных лимфоцитов CD127-.

Указанные показатели определяют:

- содержание алюминия определяют по Методике «Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой», изложенной в МУК 4.1.1483-03, с использованием масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500cx с октопольной реакционной ячейкой (USA). Устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе крови над его референтным уровнем (менее 0,01 мг/дм³);

- уровень IgG к алюминию в моче - методом иммуноферментного анализа по методике: Зайцева Н.В., Беляев Е.Н., Долгих О.В. Способы диагностики сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям/ Методические рекомендации.- М., 2002.- С. 29. В качестве физиологического диапазона содержания IgG к алюминию был принят диапазон, равный менее 0-0,1 у.е.;

- уровень Т-регуляторных лимфоцитов CD127^- в крови определяют методом прoточной цитoметрии на прoточном цитoфлуориметрe FACSCalibur фирмы «Bеcton Dickinson» с помощью универсальной программы CеllQuestPrO.

2. Отбирают у ребенка пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5 %-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК генов TLR4 (A8595G) (rs1927911) и FAS C14405T (rs1159120). Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного ребенка готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов TLR4 (A8595G) (rs1927911) и FAS C14405T (rs1159120) (использованы наборы реагентов для определения полиморфизма генов TLR4 (A8595G) (rs1927911) и FAS C14405T (rs1159120) (ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап – активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95 °C; 2 этап – установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап – рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95 °С), отжиг праймеров (20 с при 60 °С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72 °С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC – для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM – для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние генов TLR4 и FAS в исследуемом участке ДНК гена TLR4 (A8595G) (rs1927911) и в исследуемом участке ДНК гена FAS C14405T (rs1159120) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное – в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии), и гетерозиготное – в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливаются следующие генотипы:

- для гена TLR4 (A8595G) (rs1927911): АА – дикий гомозиготный генотип, AG - гетерозиготный генотип, GG - вариантный гомозиготный генотип;

- для гена FAS C14405T (rs1159120): СС – дикий гомозиготный генотип, CT – гетерозиготный генотип, TT – вариантный гомозиготный генотип.

И при одновременном выполнении следующих условий:

- при содержании алюминия в моче ребенка 0,012 мг/дм³ и более;

- при превышении не менее чем в 1,2 раза уровня IgG к алюминию по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е.;

- при снижении не менее чем в 1,1 раза уровня CD127^- по сравнению с нижней границей нормы, равной 1,2%;

- а также при наличии дикого гомозиготного генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120) и вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911), диагностируют у ребенка развитие вторичного иммунодефицита в условиях избыточной контаминации биосред алюминием.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа были сформированы две группы детей:

- группа наблюдения – 50 детей (возраст 6-8 лет) с подтвержденным диагнозом вторичный иммунодефицит;

- группа сравнения – 47 детей (возраст 6-8 лет) без диагноза вторичный иммунодефицит.

Группы исследования были сопоставимы по возрасту, полу, этническому составу, сопутствующей патологии, социально-экономическому уровню семьи, качеству и составу питания.

На территориях проживания детей группы наблюдения отмечено превышение содержания алюминия до 2,1 ПДК м.р. Оценка риска здоровью детей показала, что при хронической экспозиции контаминантов коэффициенты опасности для алюминия составили – до 1,12. Оценка риска развития заболеваний осуществляется по стандартизованной методике в соответствии с «Руководством по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду» (Р 2.1.10.1920-04).

Заболевание «вторичный иммунодефицит» у детей группы наблюдения определяли по результатам клинического обследования и инструментального обследования длительно и часто болеющих детей, проживающих на территории Восточной Сибири.

У детей отбирали пробу мочи для химико-аналитического анализа на содержание алюминия в крови, а также пробы венозной крови для определения содержания IgG к алюминию и на содержание CD127^-; а также отбирали буккальный эпителий для генотипирования полиморфизма указанных генов на амплификаторе CFX96 методом полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени.

В результате указанных исследований были получены следующие сравнительные данные, изложенные в таблицах 1 и 2.

В таблице 1 приведены данные по содержанию алюминия в моче детей в различных группах.

Таблица 1

Группы Группа наблюдения (n=50) Группа сравнения
(n=47) р Содержание алюминия в моче, мг/ дм³ 0,0135±0,0014 0,0054±0,0009 0,0001

n – количество детей; p – достоверность.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что детей группы наблюдения значимо повышено содержание алюминия в крови в 2,5 раза относительно группы сравнения (р=0,0001).

В таблице 2 приведены данные по установлению критериев диагностики вторичного иммунодефицита у детей 6-8 лет в условиях влияния алюминия предлагаемым способом у обследованных групп детей.

Таблица 2

Пациент Содержание алюминия в моче, мг/л
(референтный уровень <0,01 мг/дм³) Генотип гена TLR4 A8595G (rs 1927911), определенного в пробе буккального эпителия Генотип гена FAS
C14405T (rs1159120), определенного в пробе буккального эпителия Уровень IgG к алюминию
у.е
(Норма 0-0,1) Содержание CD127^-, %
(Норма 1,2-1,6%) Пациенты группы наблюдения 1. (7 лет) 0,016 GG СС 0,15 0,6 2. (8 лет) 0,012 GG СС 0,14 1,0 3. (7 лет) 0,015 GG СС 0,12 0,9 4. (6 лет) 0,02 GG СС 0,17 1,1 5. (7 лет) 0,018 GG СС 0,16 1,0 6. (6 лет) 0,016 GG СС 0,15 0,9 7. (8 лет) 0,019 GG СС 0,12 0,7 Пациенты группы сравнения 8. (6 лет) 0,008 АА TT 0,075 1,3 9. (6 лет) 0,01 AG CT 0,10 1,6 10. (7 лет) 0,009 GG CT 0,09 1,2 11. (7 лет) 0,01 АА TT 0,085 1,5 12. (8 лет) 0,0085 АА CT 0,095 1,45 13. (6 лет) 0,0075 AG CС 0,075 1,55 14. (8 лет) 0,0065 GG ТT 0,065 1,35

Примечание:

1. Генотипы гена TLR4 A8595G (rs1927911): АА – дикий гомозиготный генотип, AG - гетерозиготный генотип; GG - вариантный гомозиготный генотип;

2. Генотипы гена FAS C14405T (rs1159120): СС - дикий гомозиготный генотип, CT – гетерозиготный генотип гена, TT – вариантный гомозиготный генотип;

3. Зависимость уровня IgG к алюминию и содержания CD127^- от концентрации алюминия в моче (мг/дм³) достоверна (R²= 0,75-0.92, p<0,05), где R² – коэффициент детерминации, р – вероятность.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что у пациентов, которым поставлен диагноз «вторичный иммунодефицит» (примеры 1-7), выявлены одновременно следующие обстоятельства: содержание алюминия в моче ребенка 0,012 мг/дм³ и выше, превышение в 1,2-1,7 раза уровня IgG к алюминию по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е., снижение в 1,1-2,0 раза уровня CD127^- по сравнению с нижней границей нормы, равной 1,2%, а также наличие комбинации дикого гомозиготного генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120) и вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911).

У пациентов, у которых отсутствует совокупность указанных диагностических критериев (примеры 8 - 14), не выявлено заболевание «вторичный иммунодефицит».

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам.

Пример 1. Пациент, 7 лет, русский, диагноз: Вторичный иммунодефицит. Жалобы на частые простудные состояния – более 6 раз в год. Определяется высокий уровень алюминия в моче - 0,016 мг/дм³ (референтный уровень <0,01 мг/дм³). Определяется наличие дикого гомозиготного генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120) и вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911). Значение содержания IgG к алюминию: 0,15 у.е., т.е. в 1,5 раза выше верхней границы нормы. Снижение количества Т-регуляторных кластеров клеточной дифференцировки – уровня CD127^- (0,6%), т.е. ниже нижней границы диапазона нормы (1,2-1,6%) в 2,0 раза. Таким образом установлены высокие значения уровня IgG к алюминию, пониженного уровня Т-регуляторных лимфоцитов на фоне избыточного по отношению к референтному уровню, содержания алюминия в моче, а также наличие дикого гомозиготного генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120), кодирующего рецепторы, ответственные за запуск процессов клеточной гибели на начальной фазе процедуры апоптоза, что избыточно ускоряет процессы сигналлинга мембранно-транскрипционных событий клеточной смерти, не позволяя иммуноцитам полноценно выполнять функцию экспрессии медиаторов клеточной защиты и резистентности и вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911), отменяющего защитные эффекты толл-подобных рецепторов, обеспечивающих антигенную противовирусную защиту и функционирование клеточных образований врожденного иммунитета, переключая на ассоциированный с редким генотипом гена атопический и аутоиммунный вариант иммунных реакций, а выступающий в качестве адъюванта алюминий служит катализатором, ускоряющим процессы клеточной гибели, способствующим переключению с защитного Th1-ответа, эффективного в отношении противовирусного иммунитета, на Th2 компенсаторный, но не продуктивный иммунный профиль.

Пример 2. Пациент, 6 лет, русский, здоров. Уровень алюминия в моче 0,008 мг/дм³соответствует референтному уровню – <0,01 мг/дм³. Определяется наличие вариантного гомозиготного генотипа TT гена FAS C14405T (rs1159120) и дикого гомозиготного генотипа AA гена TLR4 A8595G (rs1927911). Значение содержания IgG к алюминию: 0,075 у.е., т.е. ниже верхней границы нормы, что подтверждает отсутствие сенсибилизации к алюминию. Содержание CD127^- (1,3%), соответствует диапазону нормы (1,2-1,6%). Таким образом, отсутствие дикого гомозиготного генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120) (наличие его полиморфного ТТ генотипа) и вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911) (наличие дикой гомозиготы АА), позволяет поддерживать генетически опосредованную достаточность и физиологичность процесса клеточной гибели, что обеспечивает сбалансированный контроллинг иммунного профиля со стороны Т-регуляторных лимфоцитов с фенотипом CD127-, когда не запускается негативная адъювантная модификация гаптенами процесса апоптоза (допустимый уровень алюминия в моче и IgG к алюминию), что не формирует у данного пациента, ассоциированное с генетическим профилем и контаминацией биосред алюминием, состояние вторичного иммунодефицита.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием заявляемых диагностических критериев по содержанию алюминия в моче, превышения в 1,2 и более раза уровня IgG к алюминию по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е., снижения в 1,1 и более раз уровня CD127^- по сравнению с нижней границей нормы, равной 1,2%, а также при наличии комбинации генотипа дикого гомозиготного генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120) и вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911), обеспечивается его назначение.

Предлагаемый способ позволит установить наличие ранних проявлений заболевания «вторичный иммунодефицит» у детей, ассоциированного с контаминацией биосред алюминием, что в свою очередь позволит оптимизировать мероприятия по коррекции данного состояния у детей.

Изобретение относится к медицине, а именно к профилактической медицине, экологии человека и педиатрии, и может быть использовано для ранней диагностики вторичного иммунодефицита у детей в условиях избыточной контаминации биосред алюминием. В моче ребенка определяют содержание алюминия. В крови определяют уровень специфического иммуноглобулина G (IgG) к алюминию и уровень Т-регуляторных лимфоцитов CD127^-. При помощи метода полимеразной цепной реакции определяют полиморфизм гена рецептора клеточной гибели FAS и гена толл-подобного рецептора TLR4. При содержании алюминия в моче ребенка 0,012 мг/дм³ и более, при превышении не менее чем в 1,2 раза уровня IgG к алюминию по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е., при снижении не менее чем в 1,1 раза уровня CD127^- по сравнению с нижней границей нормы, равной 1,2%, а также при наличии генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120) и генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911) диагностируют у ребенка развитие вторичного иммунодефицита в условиях избыточной контаминации биосред алюминием. Способ обеспечивает раннюю диагностику вторичного иммунодефицита у детей в условиях избыточной контаминации биосред алюминием за счет определения токсикологических, лабораторных и генетических показателей состояния здоровья ребенка. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ ранней диагностики вторичного иммунодефицита у детей в условиях избыточной контаминации биосред алюминием, включающий определение токсикологических, лабораторных и генетических показателей у ребенка, по которым диагностируют наличие вторичного иммунодефицита, отличающийся тем, что в качестве токсикологических показателей определяют в моче ребенка содержание алюминия, в качестве лабораторных показателей определяют в крови уровень специфического иммуноглобулина G (IgG) к алюминию и уровень Т-регуляторных лимфоцитов CD127^-, а в качестве генетических показателей определяют полиморфизм гена рецептора клеточной гибели FAS и гена толл-подобного рецептора TLR4 при помощи метода полимеразной цепной реакции путем исследования генотипов гена FAS C14405T (rs1159120) и генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911) и при одновременном выполнении следующих условий: при содержании алюминия в моче ребенка 0,012 мг/дм³ и более, при превышении не менее чем в 1,2 раза уровня IgG к алюминию по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е., при снижении не менее чем в 1,1 раза уровня CD127^- по сравнению с нижней границей нормы, равной 1,2%, а также при наличии дикого гомозиготного генотипа СС гена FAS C14405T (rs1159120) и вариантного гомозиготного генотипа GG гена TLR4 A8595G (rs1927911), диагностируют у ребенка развитие вторичного иммунодефицита в условиях избыточной контаминации биосред алюминием.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве метода полимеразной цепной реакции используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.