СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОБСТАНОВКИ НА СОСТОЯНИЕ ИММУННОГО СТАТУСА НАСЕЛЕНИЯ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, преимущественно к области медицинской экологии, и предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия химических факторов среды обитания на здоровье населения, в частности для установления степени вероятности возникновения изменений иммунного статуса населения в условиях неблагоприятной экологической обстановки, которая будет учитываться при проведении мероприятий социально-гигиенического мониторинга.

Известен способ оценки напряженности иммунитета, согласно которому определяют в крови фагоцитарную активность лейкоцитов (ФАЛ), концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и концентрацию иммуноглобулинов класса G(IgG) и по их соотношению диагностируют напряженность иммунитета (см. Патент РФ 2058552, кл. G 01 N 33/53, от 1992 г.).

Также известен способ определения супрессорного звена иммунного статуса человека, включающий сбор периферической крови, получение суспензии мононуклеарных клеток (МНК), деление их на две равные части, культивирование МНК первой из частей без активатора супрессоров, а второй - с активатором супрессоров, отмывание МНК от среды культивирования, блокировку пролиферации, добавление в каждую из частей МНК свежевыделенных МНК здорового донора, стимулированных фитогемагглютинином в равных соотношениях для получения тест-культур, культивирование их, последующую оценку пролиферации тест-культур и определение величины супрессии по соотношению уровней пролиферации в тест-культурах, при этом в качестве активатора супрессоров используют трофобластический бета-1-гликопротеин (см. Патент РФ 2058553, кл. G 01 N 33/53, от 1994 г.).

Однако указанными известными способами невозможно достоверно и точно установить связь иммунного статуса населения с неблагоприятной экологической обстановкой среды проживания, т.к. этими способами устанавливается лишь факт ухудшения иммунного состояния человека без установления причины этого ухудшения. Поэтому последующие лечебные мероприятия могут оказаться безрезультатными, если не установить причину заболевания.

Из уровня техники также известен способ гигиенической оценки влияния содержащихся в воздухе вредных веществ на организм человека, согласно которому производят клинико-инструментальное обследование населения посредством определения кратности превышения среднерабочей величины максимальной нормируемой интенсивности легочной вентиляции над предельно-допустимой концентрацией в воздухе, по которой судят об ухудшении состояния здоровья человека под воздействием экологической обстановки (см. Патент РФ 2111700, кл. А 61 В 5/08, от 1995 г.).

Однако указанный известный способ позволяет установить ухудшение здоровья человека в целом лишь от экологически вредных веществ, находящихся в воздухе, и не применим для определения состояния иммунного статуса населения в зависимости от химических токсикантов, попадающих в организм человека другими путями.

Еще одним известным способом является способ определения лимфотоксичности лекарственных препаратов в реакции спонтанного Е-розеткообразования, согласно которому после 90 минут инкубации лимфоцитарной взвеси с лекарственным препаратом и 18 часовой инкубации с эритроцитами барана вычисляется индекс лимфотоксичности по отношению к контролю, и в случае его превышения 1,0 делается вывод о лимфотоксическом эффекте лекарственного препарата (см. Патент РФ 2152618, кл. G 01 N 33/53, от 1997 г.). Назначение указанного известного способа - определение необходимости и адекватности возможного использования лекарственных препаратов, т.е. химических веществ, на организм человека, учитывая иммунный статус последнего.

Однако этот способ не направлен на диагностику иммунотропного действия уже имеющегося в организме вещества. Отсутствует количественный критерий наличия данного вещества в организме. В указанном способе нет упоминания, какая и по какому принципу подобрана вносимая in vitro концентрация лекарственного вещества. Данный способ не позволяет оценить влияние экологической ситуации на территории проживания пациента на иммунный статус. Способ по продолжительности слишком длителен, а оценочный индекс учетом стандартной погрешности метода до 25% некорректно мал, что также снижает точность определения.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по назначению является способ определения иммунодефицитного состояния у лиц, подвергающихся воздействию малых доз ионизирующей радиации, согласно которому проводят исследование периферической (венозной) крови и цитохимически определяют общее внутриклеточное содержание катионных белков в нейтрофильных гранулоцитах 1 мкл крови, количество нейтрофильных гранулоцитов, содержащих аномальные гранулы, и среднее содержание аномальных гранул в одном нейтрофиле и по соотношению этих показателей и по отклонению от нормы устанавливают иммунодефицитное состояние (см. Авт. свид. СССР 1807401, кл. G 01 N 33/48, от 1990 г.). В известном способе воздействие малых доз ионизирующей радиации можно принять за влияние экологической обстановки на организм человека.

Недостатком указанного способа является то, что он позволяет установить иммунодефицитное состояние человека лишь от экологически вредного воздействия радиации и является крайне неточным при определении состояния иммунного статуса населения в зависимости от влияния химических токсикантов.

Предлагаемым способом решается задача повышения точности и достоверности установления оценки влияния экологической обстановки, преимущественно от воздействия химических токсикантов, на здоровье населения, в частности на его иммунный статус.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе, включающем исследование пробы венозной крови, новым является то, что устанавливают в пробе содержание токсиканта, обусловленного экологической средой обитания населения, выделяют из пробы лимфоциты (мононуклеарные клетки) и добавляют к ним установленный токсикант в концентрации, соответствующей норме (т.е. не оказывающей вредного воздействия), полученную смесь инкубируют при температуре, соответствующей нормальной температуре организма человека, далее методом иммунологического анализа (реакция Е-розеткообразования, реакция иммунофлюоресценции, иммуноцитохимический метод) устанавливают в пробе количество лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, обусловленных воздействием токсиканта, и при снижении количества соответствующих кластеров лимфоцитов в пробе под воздействием токсиканта не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной пробой без введенного в нее дополнительно токсиканта, при одновременном обнаружении токсиканта в пробе крови в концентрации, превышающей норму, судят об ухудшении состояния здоровья, связанного с изменением иммунного статуса под воздействием экологической обстановки.

Указанный выше технический результат обеспечивается, по-видимому, благодаря следующему.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы венозной крови обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности.

Использование в качестве информативного критерия лимфоцитов обусловлено тем, что рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток лимфоцитов является самым чувствительным механизмом реагирования показателей гомеостаза (крови) на изменение условий среды обитания, в частности на действие химических токсикантов. Угнетение этого механизма различными факторами (социальными, биологическими, экологическими) приводит к изменениям внутренней среды организма, именуемым иммунодефицитными состояниями. И предлагаемый способ предполагает своеобразное моделирование вероятных условий среды обитания, но не в большом масштабе, а в эксперименте in vitro, что позволяет с высокой точностью воспроизвести вероятный ответ рецепторного аппарата клеток лимфоцитов (дифференцировочных антигенов) на присутствие в средах организма токсикантов.

Благодаря тому, что к выделенным из пробы лимфоцитам дополнительно добавляют токсикант в концентрации, соответствующей норме, обеспечивается возможность усилить и идентифицировать эффект воздействия этого токсиканта на лимфоциты in vitro, т.к. чем выше содержание этого токсиканта над нормальной, так называемой "терапевтической", концентрацией (а это содержание на этапе идентификации в предлагаемом способе будет складываться из ранее содержащегося в пробе крови токсиканта + из дополнительно введенного токсиканта), тем значительнее повреждающее его действие на дифференцировочные антигены мембран лимфоцитов, а значит благодаря внесению фиксированной нетоксичной концентрации химического вещества повысится точность определения влияния этого токсиканта.

Благодаря тому, что токсикант к лимфоцитам дополнительно добавляется в концентрации, соответствующей норме, т.е. не повреждающей мембрану лимфоцитов, также обеспечивается точность определения.

Использование в предлагаемом способе в качестве сопоставительной базы контрольной пробы без введенного в нее дополнительного токсиканта позволяет с большой долей достоверности установить при сопоставлении данных опытной и контрольной проб влияние именно неблагоприятного экологического фактора-токсиканта на иммунный статус.

Кроме того, как показали наши исследования, точность предлагаемого способа обеспечивается и тем, что о факте изменения иммунного статуса населения, связанного с воздействием экологической обстановки, достоверно судят лишь в том случае, если имеются одновременно два фактора, а именно: во-первых, имеет место снижение количества исследуемых кластеров лимфоцитов в опытной пробе не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной пробой без введенного в нее дополнительно токсиканта, а во-вторых, при одновременном обнаружении наличия токсиканта в пробе крови в концентрации, превышающей терапевтическую.

При реализации предлагаемого способа осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:
- выбирают территорию экологического риска;
- на этой территории отбирают группу статистически значимого контингента здоровых людей;
- производят забор пробы венозной крови в пробирки, где добавлен гепарин (25-50 единиц на 1 мл крови);
- определяют в пробе крови наличие химического токсиканта, оказывающего вредное экологическое воздействие на выбранной территории;
- выделяют из пробы гепаринизированной крови лимфоциты, например, путем центрифугирования на градиенте Фиколл-верографин;
- выделенную суспензию лимфоцитов (концентрация 4•10⁶/мл) смешивают в одинаковых объемах с химическим токсикантом (например, формальдегидом) в концентрации, соответствующей норме и не повреждающей мембрану лимфоцитов (для формальдегида эта концентрация равна 0,02 мкг/мл);
- полученную смесь подвергают часовому инкубированию при температуре, соответствующей нормальной температуре организма человека (при +37^oС);
- параллельно ставиться контрольная проба, но вместо химического токсиканта к ней добавляют аналогичный объем среды 199 (физраствор);
- далее одним из широко известных иммунологических методов (реакция Е-розеткообразования, или реакция иммунофлюоресценции, или иммуноцитохимический метод) устанавливают количество лимфоцитов, имеющих определенную структуру кластеров дифференцировки (популяции лимфоцитов) как в исследуемой (опытной), так и в контрольной пробах,
а) в реакции Е-розеткообразования (идентификация Е-рецепторов Т-клеток) к исследуемой суспензии мононуклеаров добавляется суспензия эритроцитов барана. Пробу инкубируют 10 минут при 37^oС, 5 минут центрифугируют, снова инкубируют 60 минут при 4^oС и фиксируют глютаровым альдегидом. Той же последовательности процедур подвергается контрольная проба;
б) в реакции иммунофлюоресценции (идентификация CD3 и CD4 рецепторов Т-клеток) к исследуемой суспензии мононуклеаров добавляются тестируемые моноклональные антитела. Пробу инкубируют 30 минут при 4^oС, затем дважды промывают и к осадку клеток добавляют вторые антитела, меченные флюоресцентной меткой, после чего повторно инкубируют 30 минут при 4^oС. Той же последовательности процедур подвергается контрольная проба;
в) при иммуноцитохимическом исследовании (идентификация CD3 и CD4 рецепторов Т-клеток) к исследуемой суспензии мононуклеаров добавляются тестируемые моноклональные антитела. Пробу инкубируют 30 минут при 4^oС, затем промывают и добавляют вторые антитела с биотином с последующей 10-минутной инкубацией. Инкубация со стрептавидином меченым ферментом (щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена) 10 минут. Инкубация с хромогенным субстратом 10 минут. Той же последовательности процедур подвергается контрольная проба.

- об ухудшении состояния здоровья населения, связанного с изменением иммунного статуса под воздействием экологической обстановки, достоверно судят лишь наличии одновременно двух факторов, а именно: при снижении количества дифференцировочных кластеров лимфоцитов в исследуемой пробе не менее чем в 1,5 раза по сравнению с количеством этих же лимфоцитов в контрольной пробе и при одновременном обнаружении наличия токсиканта в пробе крови в концентрации, превышающей норму. Причем превышение содержания токсиканта в крови над нормальным уровнем свидетельствует об опасности проживания на территории с данной химической нагрузкой (то есть экологическом неблагополучии на данной территории), а значение критерия "при снижении количества не менее чем в 1,5 раза" эффекта лимфотоксичности химического вещества in vitro указывает на состояние иммунодефицита у конкретного пациента, обусловленного экспозицией исследуемого токсиканта.

Пример. Предлагаемый способ оценки влияния экологической обстановки на состояние иммунного статуса населения был опробован на примере территории Пермского Прикамья (г. Соликамск), имеющей неблагоприятный экологический фон и характеризующейся присутствием в объектах окружающей среды такого химического токсиканта, как формальдегид.

В качестве группы населения были выбраны здоровые на момент обследования дети в возрасте 5-7 лет, постоянно проживающие на указанной территории. Выбор контингента предусматривал такой возрастной ценз обследуемых, который, с одной стороны, позволял до определенной степени избежать влияния на здоровье вредных привычек (например, курение), с другой стороны, обеспечивал необходимую для корректности исследования зрелость формирующейся иммунной системы.

У всех детей была взята венозная кровь, исследование которой проводилось по вышеуказанной схеме с тем уточнением, что количество лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, устанавливали реакцией Е-розеткообразования. Полученные данные приведены в таблице 1.

Ниже приводим пояснения к таблице 1.

Т-тфр-лимфоциты являются общепринятым показателем клеточного иммунитета, снижение которого свидетельствует о состоянии иммунодефицита.

Кратность превышения Т-лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, в контрольной пробе (контроль теста) над содержанием этих же Т-лимфоцитов в исследуемой пробе (нагрузочный тест с формальдегидом) вычислялась как отношение данных, приведенных в графе 3 таблицы 1 к данным графы 2 этой же таблицы. Во всех опытах количество Т-лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, в исследуемой пробе снижалось не менее чем в 1,5 раза по сравнению с количеством этих же Т-лимфоцитов в контрольной пробе.

И одновременно наряду с тем, что в пробе крови всех обследуемых детей присутствовал токсикант в концентрации, превышающей норму (см. графу 6 таблицы 1), был сделан вывод о подтверждении связи "неблагополучный экологический фактор - снижение иммунного статуса населения".

Причем следует отметить, что только наличие одного фактора, а именно: "наличие в крови токсиканта в концентрации, превышающей норму", не может служить доказательством влияния экологической обстановки на иммунный статус населения. Доказательством этому являются результаты исследований на содержание Т-тфр-лимфоцитов, являющихся общепринятыми показателями клеточного иммунитета, которые не показали в ряде случаев иммунодефицита несмотря на присутствие токсиканта в крови у детей в повышенной концентрации (графа 5 таблицы 1, пациенты под номерами 5, 8). А только при наличии в совокупности двух показателей: наличие в крови токсиканта в концентрации, превышающей норму, и снижение количества лимфоцитов определенных кластеров дифференцировки в исследуемой пробе с токсикантом не менее чем в 1,5 раза по сравнению с их количеством в контрольной пробе позволяют с высокой точностью идентифицировать неблагоприятное воздействие химических факторов среды обитания на иммунный статус населения.

Для обоснования критерия "не менее чем в 1,5 раза", являющимся одним из признаков предлагаемого способа, также были проведены исследования по оценке состояния иммунного статуса контрольной группы детей, проживающих на экологически благополучной территории - рекреационная зона (сельская местность Пермского Прикамья) с использованием предлагаемого способа. Полученные данные приведены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что при исключении экологически вредного влияния на организм человека, не происходит диагностически значимого (более чем в 1,5 раза) снижения количества Т-лимфоцитов (графа 2), содержащих дифференцировочные антигены в исследуемой пробе с токсикантом, по сравнению с количеством этих Т-лимфоцитов в контрольной пробе (графа 3), т.е. это доказывает то, что заявляемый критерий в предлагаемом способе является существенным признаком и в совокупности с другими признаками действительно позволяет достоверно и точно судить о влиянии экологически неблагополучных факторов на иммунный статус населения.

Заявляемый способ имеет актуальное значение в настоящих условиях, т.к. позволяет контролировать изменение иммунного статуса населения, формирующегося под воздействием химических факторов среды обитания, и учитывать этот факт при проведении мероприятий социально-гигиенического мониторинга.

Способ может быть использован в медицине, а именно в области медицинской экологии. Устанавливают в пробе венозной крови содержание токсиканта, обусловленного экологической средой обитания населения, выделяют из пробы лимфоциты (мононуклеарные клетки) и добавляют к ним установленный токсикант в концентрации, соответствующей норме, полученную смесь инкубируют при температуре, соответствующей нормальной температуре организма человека, далее методом иммунологического анализа устанавливают в пробе количество лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, обусловленных воздействием токсиканта, и при снижении количества соответствующих кластеров лимфоцитов в пробе под воздействием токсиканта не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной пробой без введенного в нее дополнительно токсиканта, при одновременном обнаружении токсиканта в пробе крови в концентрации, превышающей норму, судят об ухудшении состояния иммунитета. Способ повышает точность и достоверность установления оценки влияния химического токсиканта на состояние иммунного статуса населения. 2 табл.

Способ оценки влияния химических токсикантов на состояние иммунного статуса населения путем исследования проб венозной крови, отличающийся тем, что устанавливают в пробе венозной крови содержание химических токсикантов, обусловленное экологической средой обитания населения, выделяют из пробы лимфоциты (мононуклеарные клетки) и добавляют к ним установленный токсикант в концентрации, соответствующей норме, полученную смесь инкубируют при температуре, соответствующей нормальной температуре организма человека, далее методом иммунологического анализа устанавливают в пробе количество лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, обусловленных воздействием токсиканта, и при снижении количества соответствующих кластеров лимфоцитов в пробе под воздействием токсиканта не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной пробой без введенного в нее дополнительно токсиканта, при одновременном обнаружении токсиканта в пробе крови в концентрации, превышающей норму, судят об ухудшении состояния иммунного статуса населения.