СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2015 года по МПК A61K31/115 A61K33/14 A61P31/04 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к методам лечения инфекционных заболеваний животных, а именно бруцеллеза.

Известен способ лечения бруцеллеза человека, заключающийся во внутримышечном введении 5 инъекций Реаферона-ЕС в дозе 1 млн ME через каждые 72 часа и затем пероральном приеме препарата Циклоферона 0,6 г 1 раз в сутки на 1, 2, 4, 6, 8, 11, 17, 20, 23-й дни (см. патент РФ №2423143, кл. МПК A61K 38/21, опубл. 10.07.2011).

Известны также способы лечения бруцеллеза человека с помощью антибиотиков: левомицетина, тетрациклина, сочетания тетрациклина со стрептомицином (см., например, http://www.amny.ru/13_brucel_lech.html).

Известны способы лечения бруцеллеза человека и с помощью вакцин, например, вакцины на основе очищенного протективного антигена, представляющего собой белково-полисахаридный комплекс, выделенный из штаммов бруцелл видов Brucella abortus или Brucella melitensis в S-форме (см. патент РФ №2076493 по кл. МПК A61K 39/10, опуб. 27.03.1997).

Однако все известные способы применимы только в медицине и используются для лечения человека.

Наиболее близким к заявляемому является способ лечения бруцеллеза (патент РФ №2234311, кл. МПК A61K 9/127, опубл. 20.08.2004), включающий пероральное введение липосом с антибиотиком, при этом в качестве антибиотика вводят пефлоксацин или азитромицин и дополнительно - иммуномодулятор - ликопид или левамизол, который включен попарно с указанным антибиотиком в общую липосомальную везикулу.

Однако данный способ, как и вышеизложенные, неприменим для лечения крупного рогатого скота.

Общеизвестно и как отмечают ряд исследователей (см., например, http://www.allvet.ru/diseases/all_inf16.php; http://xreferat.ru/55/1301-1-profilaktika-i-psihicheskie-rasstroiystva-pri-brucelleze-brucellez-u-hivotnyh.html), что бруцеллез у животных считается практически неизлечимым заболеванием. Это связано с мощными аллергическими (ГЗТ) и аутоиммунными реакциями, которые даже после элиминации (удаления) возбудителя оказывают патологическое влияние на организм. Кроме того, бруцеллы могут переходить в L-форму, в виде которых длительно (порой годами) паразитировать в хозяевах.

Таким образом, лечение бруцеллеза животных, в частности, крупного рогатого скота, в настоящее время не разработано. Испытывавшиеся в этих целях многочисленные терапевтические средства не дали положительных результатов.

Изобретение направлено на решение задачи создания способа лечения бруцеллеза крупного рогатого скота.

Для решения поставленной задачи в способе лечения бруцеллеза, заключающемся во введении лекарственного средства, согласно изобретению в качестве лекарственного средства используют препарат, содержащий смесь медицинского раствора формальдегида и изотонического раствора натрия хлорида при соотношении весовых частей (2-6):(994-998), при этом препарат вводят внутримышечно в дозе 5-6 мл 6 раз, причем вторую инъекцию вводят на 7-8-й день после первой инъекции, третью - на 7-8 день после второй инъекции, четвертую - спустя 12 часов после третьей, пятую - спустя 12 часов после четвертой, шестую - через 7-8 дней после пятой инъекции.

В известных авторам источниках патентной и научно-технический информации не описано способа лечения бруцеллеза крупного рогатого скота на основе лекарственного препарата, содержащего малые концентрации формальдегида, который вводят по определенной схеме, подобранной экспериментальным путем.

Авторами экспериментально установлено, что заявляемая схема введения препарата обеспечивает иммунологическую перестройку по отношению к возбудителю у инфицированных коров.

При этом первая и вторая инъекции снижают активность лимфоцитарного звена иммунитета, что приводит к снижению аллергизации организма и не препятствует завершенному фагоцитозу бруцелл.

Третья инъекция, проводимая спустя 7 дней после второй, а затем последующие две инъекции (четвертая и пятая), проводимые с интервалом через 12 часов друг от друга, обеспечивают переваривание возбудителя в инфицированных фагоцитирующих клетках.

Шестое введение препарата, проведенное через 7 дней после 5-го введения, позволяет усилить полученный эффект, обеспечивая элиминирование возбудителя из организма животного и закрепляя терапевтический эффект.

Таким образом, авторами выявлено новое свойство смеси, содержащей медицинский раствор формальдегида и изотонический раствор натрия хлорида при определенных соотношениях весовых частей, в определенной кратности введения регулировать иммунологическую перестройку организма животных.

В заявляемом способе решена задача полного освобождения организма коров от внутриклеточного паразита, которая до настоящего времени была невыполнима.

Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».

Медицинский раствор формальдегида - прозрачная бесцветная жидкость со своеобразным острым запахом, смешивающаяся с водой и спиртом в любых соотношениях. Концентрация действующего вещества (см., например, http://www.tiensmed.ru/news/formalin-f6s.html) составляет 36,5--37,5%.

Формальдегид - представитель класса альдегидов НСНО. Представляет собой бесцветный газ с резким запахом, мол. массой 30,03, плотность его при 20°С равна 0,815, температура плавления 92°С, температура кипения 19,2°С. Хорошо растворим в воде, спирте. Легко полимеризуется, образуя при полимеризации в водной среде - параформальдегид, а в безводных средах (бутане, гексане) - полиоксиметилен.

Изотонический раствор натрия хлорида для инъекций - бесцветная прозрачная жидкость солоноватого вкуса 0,85-0,95%-ной концентрации. Раствор стерилен, апирогенен.

Хлорид натрия - кубические кристаллы или белый кристаллический порошок соленого вкуса, без запаха. Растворим в воде (1:3).

Готовый препарат в виде смеси медицинского раствора формальдегида с изотоническим раствором хлорида натрия представляет собой прозрачную бесцветную жидкость без запаха слегка солоноватого вкуса.

Лекарственное средство готовят следующим образом.

Берут 2-6 весовых части медицинского раствора формальдегида, добавляют его в 998-994 весовых частей стерильного раствора хлорида натрия для инъекций. Средство хранят в темном месте при температуре 15-35°С.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут приготовленный препарат в виде смеси медицинского раствора формальдегида с изотоническим раствором хлорида натрия при соотношении весовых частей (2-6):(994-998).

Лекарственное средство вводят по следующей схеме:

1 инъекция - 1-й день;

2 инъекция - на 7-8-й день после первой инъекции;

3 инъекция - на 7-8-й день после второй инъекции (или на 14-й либо на 15-й день после первой);

4 инъекция - спустя 12 часов после 3-й инъекции;

5 инъекция - спустя 12 часов после 4-й инъекции;

6 инъекция - через 7-8 дней после пятой инъекции.

Пример 1

Пример реализации способа

Способ был опробован в одном из неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйств на 70 взрослых больных коровах.

Диагноз был поставлен на основании результатов общепринятых серологических тестов: животные положительно реагировали в реакции агглютинации (РА) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

В качестве лечебного препарата использовали препарат, содержащий 2 весовых части медицинского раствора формальдегида и 998 весовых частей стерильного 0,85-0,95%-ного раствора хлорида натрия для инъекций.

Обработку взрослых животных проводили шестикратно по следующей схеме:

- первая инъекция - в 1 день,

- вторая инъекция - на 7 день после первой инъекции,

- третья инъекция - на 7 день после второй инъекции (или на 14 день после первой),

- четвертая инъекция - через 12 часов после третьей,

- пятая инъекция - через 12 часов после четвертой,

- шестая инъекция - через 7 дней после пятой инъекции.

На 7-й день после последней инъекции брали кровь от всех взрослых животных и исследовали ее серологически на бруцеллез, при этом серологические исследования крови проводили в РА и РДСК. Результаты серологических исследований коров приведены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты серологических исследований крови коров Всего исследовано жиовтных Реагировало положительно Реагировало отрицательно до введения препарата после 6-кратного введения препарата РА РДСК РА РДСК РА РДСК голов % голов % 70 70 70 27 36 43 61,4% 34 48,6%

Как видно из таблицы 1, из 70 голов, ранее положительно реагировавших на бруцеллез животных в РА и РДСК до введения препарата, при повторном исследовании после введения препарата положительно реагировало 27 голов в РА и 36 голов в РДСК.

Здоровых животных было зарегистрировано в реакции агглютинации 43 головы, что составляет 61,4%, а в реакции длительного связывания комплемента - 34 головы, что составляет 48,6%.

Наблюдения за серонегативными коровами показали отсутствие у них в последующем положительных реакций в РА и РДСК, что свидетельствовало о выздоровлении животных (срок наблюдения - 3 месяца).

В последующих примерах приведены данные по обоснованию механизма реализации заявляемого способа на клеточном уровне - на спленоцитах и перитонеальных клетках белых крыс.

Пример 2

Доказательство снижения активности лимфоцитарного звена иммунитета у белых крыс

Предварительно была отработана концентрация препарата для культуры клеток, которая составила соотношение весовых частей медицинского раствора формальдегида к изотоническому раствору натрия хлорида как 3:166, т.е. в разведении основного препарата в 600 раз.

В опыте использовали 6 белых беспородных крыс, от каждой из которых выделяли спленоциты, суспендировали их в питательной среде ДМЕМ до концентрации 1,4 млн кл/мкл. К суспензии объемом 1800 мкл добавляли 200 мкл физиологического раствора и инкубировали при 37°C в течение 40 мин.

Затем из суспензии отбирали две пробы по 800 мкл каждая. В одну из них добавляли 100 мкл физраствора и она служила в дальнейшем контролем, а в другую - 100 мкл препарата, разведенного в 600 раз. После чего добавляли по 100 мкл 0,1% нитросинего тетразолия (НСТ). Полученные культуры спленоцитов инкубировали при 37°C в течение 2-х часов, определяли накопление формазана в нг/10⁶ клеток. В таблице 2 представлены результаты НСТ-теста в спленоцитах крыс.

Таблица 2 Результаты определния НСТ-теста в спленоцитах крыс Номер животного Количество формазана в спленоцитах крыс, нг/млн клеток контроль (физиологический раствор) препарат в соотношении весовых частей 3:166 1 2,51 1,83 2 2,30 2,05 3 2,38 2,03 4 2,05 1,78 5 2,78 1,94 6 2,49 2,39 Среднее 2,40±0,1 2,0±0,1

Из таблицы 2 следует, что во всех пробах спленоцитов, взятых от 6 животных, регистрировалось достоверное (p<0,01) снижение накопления формазана в спленоцитах крыс, т.е. активность лимфоцитов в присутствии препарата снижалась по сравнению с контролем на 16,7%.

Пример 3

Доказательство активизации фагоцитирующих клеток белых крыс

Использовали препарат, аналогично примеру 2, в разведении в 600 раз, т.е. при соотношении компонентов 3:166.

В опыте использовали 3 белых беспородных крысы, от которых выделяли перитонеальные клетки по стандартной методике. Клетки суспендировали в среде ДМЕМ с 10% фетальной бычьей сыворотки до финальной концентрации клеток 2 млн кл./мл.

Затем из суспензии отбирали две пробы по 800 мкл каждая. В одну из них добавляли 100 мкл физраствора и она служила в дальнейшем контролем, а в другую - 100 мкл препарата, разведенного в 600 раз. После чего добавляли по 100 мкл 0,1% нитросинего тетразолия (НСТ). Полученные культуры спленоцитов инкубировали при 37°C в течение 2-х часов, определяли накопление формазана в нг/10⁶ клеток. В таблице 3 представлены результаты НСТ-теста в перитонеальных клетках крыс.

Таблица 3 Результаты определения НСТ теста в перитонеальных клетках крыс Номер животного Количество формазана в перитонеальных клетках крыс, нг/млн клеток контроль (физиологический раствор) препарат в соотношении весовых частей 3:166 1. 15,218 16,58 2. 11,89 12,83 3. 11,15 12,77 Среднее 12,75±2,16 14,06±2,18

Из таблицы 3 следует, что во всех 3-х случаях регистрировалось недостоверное повышение активности перитонеальных (фагоцитирующих) клеток (в среднем на 10,3%). Это позволяет сделать вывод, что препарат не влияет на активность фагоцитирующих клеток, но обуславливает освобождение их от возбудителя, предопределяя терапевтический эффект.

Полученные результаты доказывают, что заявляемый способ, основанный на обработке коров по определенной схеме препаратом, содержащим смесь медицинского раствора формальдегида с изотоническим раствором натрия хлорида, обеспечивает иммунологическую перестройку организма инфицированных животных, способствуя элиминированию возбудителя и обеспечивая терапевтический эффект.

(57) Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения бруцеллеза. Способ включает введение смеси медицинского раствора формальдегида и изотонического раствора натрия хлорида при соотношении весовых частей (2-6):(994-998). Смесь вводят внутримышечно в дозе 5-6 мл 6 раз. Вторую инъекцию вводят на 7-8 день после первой инъекции, третью - на 7-8 день после второй инъекции, четвертую - спустя 12 часов после третьей, пятую - спустя 12 часов после четвертой, шестую - через 7-8 дней после пятой инъекции. Заявленный способ высокоэффективен при лечении бруцеллеза крупного рогатого скота. 3 табл., 3 пр.

Способ лечения бруцеллеза крупного рогатого скота, заключающийся во введении лекарственного средства, отличающийся тем, что в качестве лекарственного средства используют препарат, содержащий смесь медицинского раствора формальдегида и изотонического раствора натрия хлорида при соотношении весовых частей (2-6):(994-998), при этом средство вводят внутримышечно в дозе 5-6 мл 6 раз, причем вторую инъекцию вводят на 7-8 день после первой инъекции, третью - на 7-8 день после второй инъекции, четвертую - спустя 12 часов после третьей, пятую - спустя 12 часов после четвертой, шестую - через 7-8 дней после пятой инъекции.