СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ИЗ ШТАММА BRUCELLA ABORTUS 19 ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЕДИНОГО БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РА, РСК И РДСК, БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РОЗ-БЕНГАЛ ПРОБЫ (РБП) И БРУЦЕЛЛЕЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ КОЛЬЦЕВОЙ РЕАКЦИИ (КР) С МОЛОКОМ, СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ НАБОРЫ Российский патент 2009 года по МПК A61K39/10 A61K39/40 A61P31/04 

Группа изобретений относится к областям ветеринарии и биотехнологии.

Известен способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, PCK и РДСК, включающий культивирование возбудителя бруцеллеза на плотной питательной среде в четвертях (см., например, Касьянов А.Н. и др. Получение единого бруцеллезного антигена для PA, PCK и РДСК, Ветеринария, 1973, №10, с.50-52).

Способ требует использования дорогостоящей, сложной в изготовлении плотной питательной среды, большого количества стеклянной посуды, при его использовании существует возможность контакта персонала с живой культурой бруцелл.

Известен способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, PCK и РДСК, включающий получение посевного материала на плотной питательной среде, глубинное культивирование штамма Br.abortus 19 в жидкой питательной среде, концентрирование и очистку на ультрафильтрационной установке и инактивацию антигена в биореакторе при температуре 80°С в течение часа (см., например, RU 2085212 С1, 27.07.1997). Данный способ трудоемок, т.к. предусматривает получение посевного материала на плотной питательной среде и концентрирование бактериальной массы в два приема.

Известен способ получения антигена для серологической диагностики бруцеллеза, согласно которому для изготовления антигена используют вакцинный штамм Brucella abortus 19 и бруцеллезный бактериофаг (см., например, SU 1713592 А, 23.02.1992). Полученный по этому способу антиген активен, отличается высокой чувствительностью, однако способ его получения сложен, требует большого расхода бактериального материала, наличия специфического бруцеллезного бактериофага, операция центрифугирования взвеси опасна для обслуживающего персонала.

Наиболее близким является способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для PA, PCK и РДСК, включающий получение посевного материала и культивирование возбудителя бруцеллеза в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией на волокнах и их инактивирование нагреванием (см., например, RU 2163141 С1, 20.02.2001). Однако данный способ длителен, т.к. стадия культивирования возбудителя бруцеллеза составляет 19-21 час, стадия концентрирования бактериальных клеток - 5-7 часов, а во время ультрафильтрации нередко наблюдается разрыв волокон, что приводит к потере бактериальной массы и ее контаминации посторонней микрофлорой.

Известен способ получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП), включающий окрашивание антигена бруцеллезного бенгальской розовой (см., например, Ветеринарные препараты. Справочник. М.: Колос. Стр.185-187).

Известен способ получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, включающий окрашивание антигена бруцеллезного гематоксилином в синий или тетразолием в красно-вишневый цвет (см., например, Ветеринарные препараты. Справочник. М.: Колос. Стр.183-185).

Задачей группы изобретений в части способа получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, бруцеллезного антигена для РБП, бруцеллезного антигена для КР с молоком является унификация и упрощение технологии и сокращение времени получения антигена для препаратов: единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, бруцеллезного антигена для РБП, бруцеллезного антигена для КР с молоком, повышение его качества и повышение культуры его производства.

Поставленная задача в части способа получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК решается тем, что в способе получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, включающем получение посевного материала и культивирование возбудителя бруцеллеза в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией и их инактивирование нагреванием, согласно изобретению культивирование возбудителя бруцеллеза в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования осуществляют в следующем режиме: температура 37±0,5°С, рН 6,9-7,2, аэрация - с 1 по 3 час - 20-25 рО₂, с 3 по 6 час - 25-40 pO₂, с 6 по 15 час - 40-45 pO₂ и с 15 по 16-18 час - 30-35 pO₂, а отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией осуществляют с использованием мембранных кассет.

Задача решается также тем, что концентрация посевного материала составляет 3,5-5,0 млрд.м.кл./см³.

Задача решается также тем, что инактивирование микробных клеток нагреванием осуществляют после окончания их культивирования в ферментере при более щадящем антиген режиме: температура - 70±1°С, время - 1 час.

Задача решается также тем, что культивирование возбудителя бруцеллеза в глубинных условиях осуществляют в течение 16-18 часов.

Задача решается также тем, что при концентрировании используют мембранные кассеты с пределом задержания 20 КД.

Задача решается также тем, что при концентрировании используют мембранные кассеты с фильтродержателем АСФ-007.

Задача решается также тем, концентрирование осуществляют в течение 2-2,5 часов.

Задача решается также тем, что по окончании концентрирования полученный антиген ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором до ОК 250-300 млрд.м.кл./см³.

Поставленная задача в части способа получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) решается тем, что в способе получения бруцеллезного антигена для РБП, включающем окрашивание концентрата антигена бенгальской розовой, согласно изобретению используют концентрат антигена, полученный описанным выше способом.

Задача решается также тем, что бенгальский розовый перед окрашиванием титруют в водяной бане при температуре 40°С, а окрашивание антигена проводят при этой же температуре в течение часа.

Поставленная задача в части способа получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком решается тем, что в способе получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции с молоком, включающем окрашивание ресуспендированной бактериальной массы антигена тетразолием хлористым или гематоксилином, согласно изобретению используют антиген, полученный описанным выше способом.

Технический результат, получаемый в результате использования заявленной группы изобретений - увеличение накопления бруцелл при сокращении времени культивирования, повышение агглютинабельных свойств при снижении концентрации микробных клеток в готовом препарате, сокращение времени концентрирования бактериальных клеток и устранение их контаминации посторонней микрофлорой в процессе концентрирования, а также устранение контакта персонала с живой культурой бруцелл во время концентрирования на ультрафильтрационной установке и сокращение времени окрашивания бруцеллезного антигена для РБП.

Известен принципиальный способ получения моноспецифических сывороток путем иммунизации кроликов внутривенно разовыми дозами антигена из штамма Br.abortus в дозе, содержащей 10⁹ КОЕ в 1 мл. Затем через 5-7 дней после завершения иммунизации животных обескровливают при титре сывороточной агглютинации не мене 1:1280, после чего проводят абсорбцию сыворотки бакмассой штамма гетерологичного вида бруцелл, инкубируют при 37°С в течение 2 ч, восстанавливают центрифугированием, разводят в фенолсолевом растворе, фасуют и хранят при 4°С (см., например, Corbel M.J. et al., Methods for the Identification of Brucella. Ministry of Agriculture, Floweriest and Food. Research Section. Central veterinary Lab. New. Ham. Weighbridge. Surry RT, 153, 13B, 1978).

Недостатком способа является небольшая чувствительность получаемой сыворотки.

Известен способ получения диагностической бруцеллезной агглютинирующей сыворотки, заключающийся в иммунизации кроликов-продуцентов живыми вирулентными клетками В.abortus 146 и B.melitensis И-297. Кроликов породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг иммунизируют взвесью живых клеток в 0,85%-ном растворе натрия хлорида 48-часовой агаровой культуры бруцелл. Животным вводят подкожно трехкратно в четыре точки спины вдоль позвоночника 0,5, 0,75 и 1.0 мл смеси в равных количествах культур с равным объемом полного адъюванта Фрейнда с недельным интервалом. Через две недели после завершающей инъекции антигена вводят подкожно в область внутренней верхней трети поверхности бедра 1,0 мл смеси культур в 0,85%-ном растворе натрия хлорида. Через 14 дней после окончания иммунизации кроликов тотально обескровливают. Сыворотку инактивируют нагреванием и консервируют добавлением мертиолята натрия (см., например, RU 2005781 С1, 15.01.1994).

При использовании живой вирулентной культуры необходим строгий противоэпидемический режим, способ трудоемок и длителен.

Наиболее близким является способ получения поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки, по которому иммунизируют крупный рогатый скот в возрасте от 2 до 5-6 лет, при этом используют некастрированных быков-продуцентов. До начала иммунизации животных выдерживают в течение 1 месяца на карантине, после чего проводят грунд-иммунизацию путем однократного введения 10 мл бруцеллезного антигена подкожно, и через 1 месяц приступают к иммунизации. Иммунизацию осуществляют в 2-4 цикла с интервалами 20-30 суток. В течение одного цикла проводят 5 ежедневных инъекций антигена с объемами 10, 15, 20, 30, 40 мл. По окончании цикла иммунизации на 10-ый день после последней инъекции антигена берут контрольную пробу крови для постановки реакции агглютинации. При наличии титра антител в сыворотке крови не ниже 1:3200 проводят кровопускание. Для иммунизации животного применяют антигены, инактивированные нагреванием при температуре 60°С в течение 2 часов с последующим добавлением карболовой кислоты и выдерживанием при 37°С 48 часов. Антигены представляют собой взвеси культур В.abortus 544, В.melitensis 16-M и В.suis 1330 (см., например, Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая. ТУ-316-82 от 01.06.1982, утв. ГУ по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР).

Недостатками способа являются длительность, трудоемкость процесса, эпидемическая опасность, связанная с использованием вирулентных культур бруцелл, и высокая себестоимость конечного продукта.

Задачей изобретения в части способа получения сыворотки бруцеллезной диагностической является снижение трудоемкости процесса ее изготовления и повышение активности сыворотки.

Поставленная задача в части способа получения сыворотки бруцеллезной диагностической решается тем, что в способе получения сыворотки бруцеллезной диагностической, включающем гипериммунизацию животных-продуцентов бруцеллезным антигеном с последующим кровопусканием, отделением сыворотки, ее консервированием, проверкой на стерильность, активность и специфичность и расфасовкой, решается тем, что согласно изобретению гипериммунизацию животных-продуцентов осуществляют антигеном (живая культура бруцелл), полученным по способу, описанному выше.

В качестве животных-продуцентов используют волов.

Гипериммунизацию животных-продуцентов проводят антигеном, изготовленным из вакцинного штамма В.abortus 19, подкожно в области средней трети шеи по следующей схеме: 1-ый день - вводят 5 см³ антигена (75 млрд.м.кл.), 10-ый день - вводят 8 см³ антигена (120 млрд.м.кл.), 20-21-ый день - вводят 10 см³ антигена (150 млрд.м.кл.), на 27-28 день проводят пробное крововзятие, а на 30-31-ый день - осуществляют производственное кровопускание.

Кровь выдерживают при температуре 37-38°С в течение 2-3 часов, а затем помещают в холодильник при 2-8°С на 3-5 суток, после чего отделяют сыворотку.

Полученную сыворотку консервируют 5%-ным раствором фенола на изотоническом растворе в соотношении 1:10.

Полученную сыворотку консервируют путем добавления 4% сухой борной кислоты, после чего прогревают в водяной бане при температуре 54-56°С в течение 40 минут при постоянном перемешивании, а затем помещают в холодильник при температуре 2-8°С на 10 суток.

Сыворотка должна быть стерильной, иметь титр в РА не ниже 1:1000, а в РСК - не ниже 1:20.

После расфасовки сыворотки проводят ее лиофилизацию.

Технический результат, достигаемый при использовании заявленного способа, заключается в том, что значительно уменьшен срок цикла гипериммунизации животных, упрощен способ получения сыворотки и существенно снижена ее себестоимость при увеличении активности. Способ исключает возможность заражения персонала.

Наборы компонентов для диагностики бруцеллеза из уровня техники неизвестны.

Задачей изобретения в части наборов компонентов для диагностики бруцеллеза животных является улучшение контроля при серологическом исследовании животных на бруцеллез.

Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в PA, PCK и РДСК согласно заявленному изобретению содержит антиген бруцеллезный единый для РА, PCK и РДСК, полученный по описанному выше способу, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по описанному выше способу, и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.

Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в роз-бенгал пробе (РБП) согласно заявленному изобретению содержит антиген бруцеллезный для РБП, полученный по описанному выше способу, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по описанному выше способу, и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.

Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции (КР) с молоком согласно заявленному изобретению содержит антиген бруцеллезный для КР, полученный по описанному выше способу, и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по описанному выше способу.

Техническим результатом группы изобретений в части наборов является то, что заявленная комплектация наборов позволяет унифицировать серологическую диагностику бруцеллеза животных и контролировать правильность постановки серологических реакций во всех ветеринарных лабораториях страны.

Группа изобретений характеризуется следующими примерами.

Пример 1.

Для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют стерильную питательную среду на основе перевара Хоттингера, содержащую, об.%: перевар Хоттингера - 25, глицерин - 2, глюкоза - 1,5, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой аутолизат нативный - 3,4, вода - до 100. Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus 19 засевают в микроферментер с данной питательной средой. Концентрация посевного материала составляет 3,5 млрд.м.кл./см³. Культивируют 24 часа до накопления 35 млрд.м.кл./см³.

Производственное культивирование проводят глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. При культивировании рН поддерживают в пределах 6,9, а температуру - в пределах 36,5°С. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода составляет: с 1 по 3 час - 20 рО₂, с 3 по 6 час - 25 pO₂, с 6 по 15 час - 40 рО₂ и с 15 по 16 час - 30 pO₂. Время культивирования составляет 16 часов, накопление клеток составляет 70 млрд.м.кл./см³. По окончании культивирования бактериальную суспензию концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембранных кассет с пределом задержания 20 КД. Время концентрирования - 2,5 часа. Концентрат в биореакторе ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором до 250 млрд.м.кл./см³ и инактивируют нагреванием при следующем режиме: температура - 70±1°С, время - 1 час.

Инактивированную бактериальную суспензию сливают в стерильные бутыли и хранят в холодильнике.

Полученный концентрат бактериальной суспензии используется для изготовления единого бруцеллезного антигена для PA, PCK и РДСК, а также для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) и для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком.

Пример 2.

Антиген изготавливают аналогично примеру 1, но для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют стерильную питательную среду на основе перевара Хоттингера, содержащую, об.%: перевар Хоттингера - 20, глицерин - 1, глюкоза - 1,0, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой аутолизат нативный - 3,0, вода - до 100. Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus 19 засевают в микроферментер с данной питательной средой. Концентрация посевного материала составляет 5,0 млрд.м.кл./см³. Культивируют 26 часов до накопления 45 млрд.м.кл./см³.

Производственное культивирование проводят глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. При культивировании рН поддерживают в пределах 7,2, а температуру - в пределах 37,5°С. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода составляет: с 1 по 3 час - 25 pO₂, с 3 по 6 час - 40 pO₂, с 6 по 15 час - 45 pO₂ и с 15 по 18 час - 35 pO₂. Время культивирования составляет 18 часов, накопление клеток составляет 75 млрд.м.к./см³. По окончании культивирования бактериальную суспензию концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембранных кассет с фильтродержателем АСФ-007. Время концентрирования - 2,0 часа. Концентрат в биореакторе ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором до 300 млрд.м.кл./см³, инактивируют нагреванием при следующем режиме: температура - 70±1°С, время - 1 час.

Инактивированную бактериальную суспензию сливают в стерильные бутыли и хранят в холодильнике.

Полученный концентрат бактериальной суспензии используется для изготовления единого бруцеллезного антигена для PA, PCK и РДСК, а также для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) и для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком.

Пример 3.

Активность и специфичность полученного по примерам 1 и 2 антигена устанавливают при его титровании в РА со стандартным образцом сыворотки против Brucella abortus. Предлагаемый антиген, содержащий меньшее количество клеток (17,3-17,5 млрд.м.кл./см³), дает реакцию интенсивностью в 2 креста с разведением сыворотки 1:500 (конечное разведение 1:1000), что свидетельствует о его соответствии Международному стандарту.

Пример 4.

Получение бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП).

Для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) концентрат антигена, изготовленный по примеру 1 или по примеру 2, помещают в биосмеситель. Бенгальскую розовую титруют в водяной бане при температуре 40°С. Окрашивание антигена проводят при этой же температуре. В результате получают быстрое, в течение часа полное яркое и равномерное окрашивание микробной клетки.

Пример 5.

Активность и специфичность полученного по примеру 4 антигена устанавливают при его титровании в РБП со стандартным образцом сыворотки против Brucella abortus. Предлагаемый антиген, содержащий меньшее количество клеток (95 млрд.м.кл./см³) дает реакцию интенсивностью в 4 креста с сывороткой в разведении 1:10, содержащей 100 ME, 1-2 креста с сывороткой в разведении 1:20 (50 ME) и отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 1:35 (28,5 ME), что свидетельствует о его стандартности.

Пример 6.

Получение бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком.

Для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком ресуспендированную бактериальную массу антигена, изготовленного по примеру 1 или по примеру 2, окрашивают гематоксилином в синий или тетразолием в красно-вишневый цвет. Активность и специфичность полученного по данному примеру антигена устанавливают при его титровании с 10 пробами свежего парного или охлажденного коровьего молока, содержащими в 2 см³ 40, 20 и 10 ME антител. Предлагаемый антиген содержит меньшее количество клеток (95-100 млрд.м.кл./см³), что обусловливает его более высокую активность по сравнению с известным диагностикумом.

Пример 7.

Получение сыворотки бруцеллезной диагностической.

Для получения сыворотки бруцеллезной диагностической проводят гипериммунизацию животных-продуцентов антигеном (живая культура бруцелл), полученным по примеру 1 или по примеру 2. В качестве продуцентов используют волов. Гипериммунизацию животных проводят подкожно в области средней трети шеи по следующей схеме: 1-ый день - вводят 5 см³ антигена (75 млрд.м.кл.), 10-ый день -

8 см³ (120 млрд.м.кл.), 20-ый день - 10 см³ (150 млрд.м.кл.). На 27 день проводят пробное крововзятие, а на 30-ый день, если достаточен уровень антител в РА, осуществляют производственное кровопускание. Кровь выдерживают при температуре 37°С в течение 3 часов, а затем помещают в холодильник при 2°С на 3 суток, после чего отделяют сыворотку.

Полученную сыворотку консервируют 5%-ным раствором фенола на физиологическом растворе в соотношении 1:10.

Сыворотка стерильна, имеет титр в РА 1:1000, а в РСК - не ниже 1:20.

Готовую сыворотку расфасовывают и лиофилизируют.

Пример 8.

Получение сыворотки бруцеллезной диагностической проводят аналогично примеру 7, но гипериммунизацию волов проводят подкожно в области средней трети шеи по следующей схеме: 1-ый день - вводят 5 см³ антигена (75 млрд.м.кл.), 10-ый день - вводят 8 см³ антигена (120 млрд.м.кл.), 21-ый день - вводят 10 см³ антигена (150 млрд.м.кл.). На 28 день проводят пробное кровопускание, а на 31-ый день осуществляют производственное кровопускание. Кровь выдерживают при температуре 38°С в течение 2 часов, а затем помещают в холодильник при 8°С на 5 суток, после чего отделяют сыворотку. Полученную сыворотку консервируют путем добавления 4% сухой борной кислоты, после чего прогревают в водяной бане при температуре 50°С в течение 40 минут при постоянном перемешивании, а затем помещают в холодильник при температуре 5±3°С на 10 суток.

Сыворотка стерильна, имеет титр в РА 1:1000, а в РСК - не ниже 1:20.

Готовую сыворотку расфасовывают и лиофилизируют.

Пример 9.

Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в PA, PCK и РДСК.

В состав набора входят следующие компоненты:

- антиген бруцеллезный единый для РА, PCK, РДСК, полученный по примерам 1-2,

- сыворотка бруцеллезная диагностическая лиофилизированная, полученная по примерам 7-8,

- сыворотка негативная, представляющая собой лиофилизированную сыворотку крови здорового крупного рогатого скота.

Антиген бруцеллезный единый выявляет в указанных серологических реакциях специфические антитела в сыворотке крови больных бруцеллезом животных или иммунизированных агглютиногенными противобруцеллезными вакцинами.

Сыворотка бруцеллезная диагностическая содержит специфические бруцеллезные антитела, дающие положительные серологические реакции с бруцеллезным антигеном.

Сыворотка негативная, представляющая собой сыворотку крови здорового крупного рогатого скота, не содержит специфических бруцеллезных антител и не дает серологических реакций с бруцеллезным антигеном.

Обе сыворотки являются контрольными, подтверждающими специфичность диагностической реакции и правильность техники ее постановки.

Пример 10.

Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РБП (роз-бенгал пробе).

В состав набора входят следующие компоненты:

- антиген бруцеллезный для РБП, полученный по примерам 4-5;

- сыворотка бруцеллезная диагностическая лиофилизированная, полученная по примерам 7-8;

- сыворотка негативная, представляющая собой лиофилизированную сыворотку крови здорового крупного рогатого скота.

Набор компонентов применяется для серологической экспресс-диагностики бруцеллеза у неиммунизированных бруцеллезными вакцинами животных методом пластинчатой реакции агглютинации с сывороткой крови.

Антиген бруцеллезный, окрашенный бенгальской розовой, выявляет в пластинчатой реакции агглютинации специфические антитела в сыворотке крови больных бруцеллезом животных.

Сыворотка бруцеллезная диагностическая содержит специфические бруцеллезные антитела, дающие положительные серологические реакции с бруцеллезным антигеном.

Сыворотка негативная, представляющая собой сыворотку крови здорового крупного рогатого скота, не содержит специфических бруцеллезных антител и не дает серологических реакций с бруцеллезным антигеном.

Обе сыворотки являются контрольными, подтверждающими специфичность пластинчатой реакции агглютинации и правильность техники ее постановки.

Пример 11.

Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции (КР) с молоком.

Набор компонентов применяется для исследования молока в кольцевой реакции с целью определения благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота (буйволов) и для экспресс-диагностики бруцеллеза при реализации молока на рынках.

Набор состоит из следующих компонентов:

- антиген бруцеллезный для КР, полученный по примеру 6.

- сыворотка бруцеллезная диагностическая лиофилизированная, полученная по примерам 7-8.

Антиген бруцеллезный для КР с молоком выявляет методом кольцевой реакции специфические антитела, содержащиеся в молоке больных бруцеллезом животных.

Сыворотка бруцеллезная диагностическая содержит специфические бруцеллезные антитела, дающие положительную кольцевую реакцию с бруцеллезным антигеном.

Такая комплектация набора позволяет контролировать специфичность экспресс-метода и правильность постановки реакции.

Как следует из приведенных выше примеров, технический результат, достигаемый в процессе реализации заявленной группы изобретений, заключается в увеличении накопления бруцелл при сокращении времени культивирования, повышении агглютинабельных свойств при снижении концентрации бактериальных клеток в готовом антигене за счет предложенного режима глубинного культивирования, сокращении времени концентрирования бактериальных клеток с 5-7 часов до 2-2,5 часов и устранении их контаминации посторонней микрофлорой в процессе концентрирования за счет замены полых волокон на мембранные кассеты и исключения разрыва волокон во время фильтрации, а также устранение контакта персонала с живой культурой бруцелл во время концентрирования на ультрафильтрационной установке за счет проведения их инактивации по окончании культивирования в ферментере.

Предложенный способ окрашивания бруцеллезного антигена для РБП позволяет сократить срок технологического процесса с четырех суток до двух часов, а предложенная технология гипериммунизации продуцентов позволяет повысить активность сыворотки бруцеллезной диагностической в РА до 1000 ME антител в 1 мл. Использование же в составе наборов сывороток крови в лиофилизированном виде позволяет вдвое дольше сохранить их активность, а введение в состав наборов антигена, позитивной и негативной сывороток позволяет улучшить контроль при серологическом исследовании животных на бруцеллез и в целом унифицировать серологическую диагностику бруцеллеза.

Таким образом, поставленные задачи решены.

Группа изобретений относится к областям ветеринарии и биотехнологии. Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК включает получение посевного материала и культивирование бруцелл в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией и их инактивирование нагреванием. При этом культивирование бруцелл в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования осуществляют в следующем режиме: температура 37±0,5°С, рН 6,9-7,2, аэрация с 1 по 3 час - 20-25 рO₂, с 3 по 6 час - 25-40 pO₂, с 6 по 15 час - 40-45 pO₂ и с 15 по 16-18 час - 30-35 рO₂. Отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией осуществляют с использованием мембранных кассет. Полученный данным способом концентрат антигена используют также для получения антигена для роз-бенгал пробы (РБП), для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком и для получения сыворотки бруцеллезной диагностической, которые вместе с сывороткой крови здорового крупного рогатого скота входят в состав наборов для диагностики бруцеллеза. Группа изобретений позволяет повысить эффективность процесса диагностики бруцеллеза и улучшить контроль при серологическом исследовании животных. 7 н. и 15 з.п. ф-лы.

1. Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, включающий получение посевного материала и культивирование бруцелл в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией и их инактивирование нагреванием, отличающийся тем, что культивирование бруцелл в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования осуществляют в следующем режиме: температура 37±0,5°С, рН 6,9-7,2, аэрация с 1 по 3 ч - 20-25 pO₂, с 3 по 6 ч - 25-40 pO₂, с 6 по 15 ч - 40-45 pO₂ и с 15 по 16-18 ч - 30-35 рO₂, а отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией осуществляют с использованием мембранных кассет.

2. Способ получения бруцеллезного антигена по п.1, отличающийся тем, что концентрация посевного материала составляет 3,5-5,0 млрд.м.кл./см³.

3. Способ получения бруцеллезного антигена по п.1, отличающийся тем, что инактивирование микробных клеток нагреванием осуществляют после окончания их культивирования в ферментере при следующем режиме: температура 70±1°С, время 1 ч.

4. Способ получения бруцеллезного антигена по п.1, отличающийся тем, что культивирование бруцелл в глубинных условиях осуществляют в течение 16-18 ч.

5. Способ получения бруцеллезного антигена по п.1, отличающийся тем, что при концентрировании бактериальной массы используют мембранные кассеты с пределом задержания 20 КД.

6. Способ получения бруцеллезного антигена по п.5, отличающийся тем, что при концентрировании бактериальной массы используют мембранные кассеты с фильтродержателем АСФ-007.

7. Способ получения бруцеллезного антигена по п.1, отличающийся тем, что концентрирование осуществляют в течение 2-2,5 ч.

8. Способ получения бруцеллезного антигена по п.1, отличающийся тем, что по окончании концентрирования полученный антиген ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором до ОК 250-300 млрд.м.кл./см³.

9. Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП), включающий окрашивание концентрата антигена бенгальской розовой, отличающийся тем, что используют концентрат антигена, полученный по любому из пп.1-7.

10. Способ получения бруцеллезного антигена по п.9, отличающийся тем, что бенгальскую розовую перед окрашиванием титруют в водяной бане при температуре 40°С, а окрашивание антигена проводят при этой же температуре в течение часа.

11. Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, включающий окрашивание ресуспендированной бактериальной массы антигена тетразолием хлористым или гематоксилином, отличающийся тем, что используют антиген, полученный по любому из пп.1-8.

12. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической, включающий гипериммунизацию животных-продуцентов бруцеллезным антигеном с последующим кровопусканием, отделением сыворотки, ее консервированием и расфасовкой, проверкой на стерильность, активность и специфичность, отличающийся тем, что гипериммунизацию животных-продуцентов осуществляют антигеном, полученным по способу, описанному выше.

13. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической по п.12, отличающийся тем, что в качестве животных-продуцентов используют волов.

14. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической по п.12, отличающийся тем, что гипериммунизацию животных-продуцентов проводят подкожно в области средней трети шеи по следующей схеме: 1-й день вводят 5 см³ антигена (75 млрд.мк.кл.), 10-й день - 8 см³ (120 млрд.м.кл.), 20-21-й день - 10 см³ (150 млрд.мк.кл.), на 27-28-й день проводят пробное крововзятие, а на 30-31-й день осуществляют производственное кровопускание.

15. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической по п.14, отличающийся тем, что кровь выдерживают при температуре 37-38°С в течение 2-3 ч, а затем помещают в холодильник при 2-8°С на 3-5 суток, после чего отделяют сыворотку.

16. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической по п.15, отличающийся тем, что полученную сыворотку консервируют 5%-ным раствором фенола на изотоническом растворе в соотношении 1:10.

17. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической по п.15, отличающийся тем, что полученную сыворотку консервируют путем добавления 4% сухой борной кислоты, после чего прогревают в водяной бане при температуре 50°С в течение 40 мин при постоянном перемешивании, а затем помещают в холодильник при температуре 2-8°С на 10 суток.

18. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической по п.12, отличающийся тем, что сыворотка стерильная имеет титр в РА не ниже 1:1000, а в РСК не ниже 1:20.

19. Способ получения сыворотки бруцеллезной диагностической по п.12, отличающийся тем, что после расфасовки сыворотку лиофилизируют.

20. Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК и РДСК, отличающийся тем, что содержит антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК, полученный по любому из пп.1-8, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по любому из пп.12-19, и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.

21. Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в РБП, отличающийся тем, что содержит антиген бруцеллезный для РБП, полученный по любому из пп.9-10, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по любому из пп.12-19, и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.

22. Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в КР с молоком, отличающийся тем, что содержит антиген бруцеллезный для КР, полученный по п.11 и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученную по любому из пп.12-19.