СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ХРИЗАНТЕМЫ Российский патент 2015 года по МПК A01H4/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к способам размножения растений методом культуры тканей. Служит охране окружающей среды.

Уровень техники

Известен способ клонального микроразмножения хризантемы, включающий черенкование пробирочных растений на черенки длиной 10-15 мм с двумя узлами. Микрочеренки (растительные сегменты, экспланты) стерилизуют в 0,1% растворе сулемы (хлорид ртути) в течение 3-4 мин, затем промывают в стерильной дистиллированной воде. Стерильные микрочеренки высаживают в пробирки на твердую питательную среду, приготовленную по прописи Мурасига и Скуга (1962) в сочетании с агаром и сахарозой (15 г/л), дополненную регулятором роста - индолилуксусной кислотой в концентрации 0,5 мг/л. Растения культивируют при температуре +20-25°С и 16-часовом световом фотопериоде (см. автореферат дис…к.б.н. / Гранда Харамильо Роберто Карлос. - МСХА имени К.А.Тимирязева. - Москва, 2009. - 19 с.).

Недостатком данного способа является то, что на этапе введения в культуру тканей для стерилизации микрочеренков используется сулема (хлорид ртути), которая вызывает некроз (гибель) растительных тканей, а также создает остаточный фон токсичности опасный для человека и требует специальной утилизации.

Кроме того, длительное использование экзогенных регуляторов роста при клональном микроразмножении приводит к изменению эндогенного гормонального баланса у пробирочных растений и как следствие быстрому старению тканей и невозможности размножения культуры, что ограничивает эффективность метода при размножении растений микрочеренкованием.

Недостатком является также то, что в данном техническом решении не предложен способ адаптации микрорастений (растения-регенеранты) хризантемы к почвенным условиям.

Прототипом заявленного изобретения явился способ стерилизации первичных эксплантов хризантемы на этапе введения в культуру тканей. Проводят стерилизацию микрочеренков хризантемы водным раствором анолита нейтрального катодно-обработанного (анолит АНК) в концентрации 0,2 мг/л (0,02%) в течение 5 мин без последующего промывания в стерильной дистиллированной воде. Стерильные черенки высаживают на безгормональную питательную среду, приготовленную по прописи Мурасига и Скуга (1962) (см. Широносов В.Г., Широносов О.В., Минаков В.В., Аверкиев М.С., Казанцева С.Р., Пигалев С.А., Дедюхина О.Н., Яговкина О.В., Широносова Г.И., Егоркина С.Б., Зарипова Р.А. Водоочистка, водоподготовка, водоснабжение на основе конденсированных неравновесных сред // Водоочистка, водоподготовка, водоснабжение: производственно-технический и научно-производственный журнал. - 2012. - Вып.1(49). - С.20-26).

Использование анолита АНК на этапе введения в культуру тканей значительно упрощает и ускоряет процесс стерилизации первичных эксплантов, поскольку после обработки эксплантов анолитом АНК не проводят промывание стерильной дистиллированной водой, так как продуктами деградации анолита АНК являются исходные вещества, т.е. слабоминерализованная вода. Данная особенность использования анолита АНК является существенным преимуществом по сравнению с другим известным аналогом, так как позволяет значительно сократить время (до 1 часа на каждый образец) при подготовке растительного материала для введения в культуру тканей.

Недостатком данного способа является то, что он обеспечивает 70%-ный выход стерильных и жизнеспособных эксплантов и разработан только для первого этапа клонального микроразмножения растений - стерилизации растительных эксплантов и его результаты нельзя перенести на весь процесс клонального микроразмножения хризантемы.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности клонального микроразмножения коммерческих сортов хризантемы, а также снижение негативного воздействия на окружающую среду.

Решение поставленной задачи достигается за счет того, что в предложенном способе на каждом этапе клонального микроразмножения используют электрохимически активированные водные растворы: анолит нейтральный катодно-обработанный (анолит АНК) и католит, которые не оказывают отрицательного воздействия на сложные биосистемы и являются экологически безопасными.

Католит обладает католитическими и биологическими стимулирующими свойствами, а анолит антисептическими и бактерицидными свойствами.

В отличие от прототипа в предложенном способе растительные сегменты на этапе введения в культуру тканей обрабатывают анолитом АНК в концентрации 0,03% в течение 10 мин., что обеспечивает выход 90-100% стерильных и жизнеспособных эксплантов.

На этапе собственно микроразмножения в качестве стимулятора роста и развития растений применяют католит, что позволяет избежать быстрого старения тканей, а также витрификации (гипергидратации) побегов, которая встречается в ходе микроразмножения. Механизм действия католита на живые системы похож на действие таких важнейших витаминов-антиоксидантов, как Е, С, Р, РР, являющихся иммунностимуляторами.

На этапе адаптации микрорастений к почвенным условиям используют совместную обработку анолитом АНК и католитом, что позволяет улучшить жизненные показатели микрорастений (длина побегов, длина и количество корней) и увеличить их приживаемость в почвенном субстрате.

Предложенный способ клонального микроразмножения хризантемы по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- разработан для всех этапов клонального микроразмножения: стерилизация растительных эксплантов, собственно микроразмножение, адаптация растений-регенерантов к почвенным услвовиям;

- позволяет получить высокий выход - от 90 до 100% стерильных и жизнеспособных эксплантов;

- благодаря совокупной обработке микрочеренков анолитом АНК и католитом достигается положительный эффект: значительно сокращаются сроки развития первичных эксплантов за счет слабого поражения растительной ткани, ускоряются рост и развитие растений, улучшаются биометрические показатели корневой системы растений-регенерантов;

- исключает использование экзогенных регуляторов роста;

- использование электрохимически активированных водных растворов является безопасным для человека и окружающей среды и не требует специальной утилизации;

- электрохимически активированные водные растворы являются более дешевыми, по сравнению с традиционными средствами;

Осуществление изобретения.

Способ иллюстрируется следующим примером использования электрохимически активированных водных растворов в процессе клонального микроразмножения хризантемы.

В качестве первичных эксплантов для получения стерильных растений используют стеблевые микрочеренки сортов хризантемы длиной 1,2-1,8 см с одним междоузлием, которые выдерживают в 0,03% растворе анолита АНК в течение 10 минут без последующего промывания стерильной дистиллированной водой. В условиях ламинар-бокса стерильные микрочеренки помещают на агаризованную (0,7%), безгормональную питательную среду, приготовленную по прописи Мурасига и Скуга (1962). Культуру содержат при температуре воздуха 25±2°С, на свету белых люминесцентных ламп при 16-часовом фотопериоде.

На этапе введения в культуру тканей при использовании в качестве стерилизующего вещества анолита АНК отмечается не только высокий выход стерильных и жизнеспособных эксплантов до 90-100%, но и их более быстрое развитие. Различие в регенерационных и биометрических показателях растений связано со сроком начала роста побегов. В результате быстрого развития эксплантов при указанных концентрации и времени обработки анолитом АНК растения получают небольшой забег в своем росте и развитии, что позволяет сократить продолжительность первого этапа клонального микроразмножения в среднем на 2 недели и как следствие повысить эффективность клонального микроразмножения хризантемы.

На этапе собственно микроразмножения в качестве экологически чистого стимулятора роста и развития растений применяют водный раствор католита. В работе используют стерильные микрочеренки хризантемы длиной 15-20 мм с 2 узлами. Обработку водным раствором католита и высадку микрочеренков на агаризованную (0,7%), безгормональную питательную среду, приготовленную по прописи Мурасига и Скуга (1962), проводят в условиях ламинар-бокса. Культуру содержат при температуре воздуха 25±2°С, на свету белых люминесцентных ламп при 16-часовом фотопериоде. Использование обработки микрочеренков раствором католита на этапе микроразмножения способствует получению растительного материала с высокими биометрическими показателями, что обеспечивает сокращение сроков получения стандартных растений-регенерантов, готовых для адаптации к почвенным условиям (табл.1).

Таблица 1 - Влияние обработки раствором католита на биометрические показатели микрорастений хризантемы (через 30 дней культивирования)

Таблица 1 № Вариант опыта Средние биометрические показатели растений Агент Экспозиция, мин Высота растений, см. Количество побегов, шт. Количество корней, шт. Длина корней, см 1 Католит 3 4,5 1,9 6,1 4,6 2 Контроль (без обработки) 2,6 1,6 4,3 3,1

Так, обработка микрорастений католитом оказывает влияние на образование и рост корней пробирочных растений: увеличивается в среднем в 1,3 раза на одно растение число корней, длина корня, что положительно сказывается на дальнейшей адаптации растений-регенерантов к почвенным условиям. Кроме того, отмечается увеличение длины побегов в среднем в 1,5 раза, что свидетельствует об увеличении потенциального микроразмножения хризантем. В конечном итоге это позволяет ускорить процесс клонирования растений и тем самым повысить эффективность клонального микроразмножения хризантемы при высоком качестве микрочеренков.

На этапе адаптации микрорастений к почвенным условиям используют субстрат, состоящий из торфа:вермикулита:перегноя в соотношении 1:1:1. Предварительно субстрат обрабатывают раствором анолита АНК в концентрации 0,03%. Для адаптации используются микрорастения, имеющие высоту побегов от 3,2 до 4,8 см, корневую систему, представленную из 3-6 шт. корней первого порядка длиной от 2,4 до 8,5 см. При переводе в почвенные условия микрорастения обрабатывают водным раствором католита в течение 10 мин.

Применение обработки растений-регенерантов водным раствором католита в течение 10 минут оказывает положительное влияние на биометрические параметры растений (высота побегов, количество и длина корней), а также процессы роста и развития растений в почвенных условиях, способствует сокращению периода адаптации, что сказывается на эффективности клонального микроразмножения хризантемы и повышению выхода посадочного материала (табл.2).

Таблица 2 - Влияние обработки водным раствором католита на приживаемость микрорастений хризантемы к почвенным условиям (через 30 дней культивирования)

Таблица 2 № Вариант опыта Приживае-мость, % Средние биометрические показатели растений Агент Экспозиция, мин Количество побегов, шт./растение Высота растений, см Количество корней, шт. Длина корней, см 1 Католит 10 87,5 1,5 5,7 7,4 5,7 2 Контроль (без обработки) - 75,0 1,3 5,6 7,2 4,9

Как видно из таблицы 2, применение католита на этапе адаптации способствует лучшей приживаемости растений, а также ускоряет рост и развитие регенерантов. Обработка растений-регенерантов католитом в течение 10 минут оказывает положительное влияние данного раствора на биометрические характеристики растений (высота побегов, количество и длина корней). Более быстрое развитие растений в почвенных условиях способствует сокращению периода адаптации, что повышает эффективность клонального микроразмножения хризантемы.

Использование заявляемого способа позволяет повысить эффективность клонального микроразмножения хризантемы: увеличить выход стерильных и жизнеспособных эксплантов на 20-30% по сравнению с прототипом, ускорить развитие первичных эксплантов, улучшить биометрические показатели растений-регенерантов, упростить процесс адаптации микрорастений к почвенным условиям, увеличить выход посадочного материала, снизить нагрузку на окружающую среду.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения хризантемы, включающий микрочеренкование растительных побегов, стерилизацию растительных эксплантов с последующей их высадкой на безгормональную питательную среду Мурасига и Скуга, размножение микроклонов, укоренение вновь образованных in vitro побегов и адаптацию растений-регенерантов к почвенным условиям, где на этапе стерилизации растительных эксплантов используют обработку микрочеренков водным раствором анолита нейтрального катодно-обработанного в концентрации 0,03% в течение 10 мин, без последующего промывания стерильной дистиллированной водой, на этапе микроразмножения проводят обработку микрочеренков раствором католита в течение 3 мин, на этапе адаптации почвенный субстрат обрабатывают водным раствором анолита нейтрального катодно-обработанного в концентрации 0,03%, а микрорастения обрабатывают раствором католита в течение 10 мин. Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность клонального микроразмножения растений хризантемы: увеличить выход стерильных и жизнеспособных эксплантов 90-100%, улучшить жизненные показатели растений-регенерантов (количество и длину корней в 1,3 раза, длину побегов в 1,5 раза), а также повысить приживаемость микрорастений к почвенным условиям. 2 табл.

Способ клонального микроразмножения хризантемы, включающий микрочеренкование растительных побегов, стерилизацию растительных эксплантов с последующей их высадкой на безгормональную питательную среду Мурасига и Скуга, размножение микроклонов, укоренение вновь образованных in vitro побегов и адаптацию растений-регенерантов к почвенным условиям, отличающийся тем, что на этапе стерилизации растительных эксплантов используют обработку микрочеренков водным раствором анолита нейтрального катодно-обработанного в концентрации 0,03% в течение 10 мин, без последующего промывания стерильной дистиллированной водой, на этапе микроразмножения проводят обработку микрочеренков раствором католита в течение 3 мин, на этапе адаптации почвенный субстрат обрабатывают водным раствором анолита нейтрального катодно-обработанного в концентрации 0,03%, а микрорастения обрабатывают раствором католита в течение 10 мин.