Способ выращивания красники (Vaccinium praestans Lamb.) Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, лесного хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для ускоренного биологического получения оздоровленного посадочного материала путем микроклонального размножения с целью биологического сохранения редких видов и последующей закладки ягодных плантаций.

Красника (Vaccinium praestans Lamb.) - вегетативно-подвижный листопадный кустарничек с крупными листьями, теневыносливый мезофит, типичный ацидофил, который образует плоды - шаровидные ягоды, 8-10 мм в диаметре, ярко-красного цвета, глянцевые, с многочисленными семенами, обладают уникальными вкусовыми качествами, и обладают большим содержанием флавоноидов и других Р-активными веществ, аскорбиновой и бензойной кислот, дубильных веществ, микроэлементов, других витаминов и полезных биологически активных веществ. Ареал красники весьма ограничен и неравномерно распространен на территориях с муссонным климатом: в России - горно-таежные районы Приморского края, Хабаровский край, Камчатская и Сахалинская области), местами - на островах северной и центральной Японии). В настоящее время природные популяции сокращаются, а в культуре вид не получил широкого распространения, несмотря на неприхотливость и возможность выращивания в других природно-климатических условиях (Красикова В.И. Биология и рациональное использование красники (Vaccinium praestans Lamb.) на Сахалине: моногр. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1987. 108 с; Смирнов И.Ю. Перспективы окультуривания красники // Плодоводство и ягодоводство России. 2001. Т. 8. С. 94-99).

Известны классические способы получения посадочного материала красники: ее возможно размножать как семенами, так и вегетативно - в основном отрезками корневища, корневищными черенками и одревесневшими стеблевыми черенками, тогда как при размножении зелеными стеблевыми черенками растения в большинстве случаев не укореняются. Другими недостатками этих способов являются: маленький выход посадочного материала, сезонность в работе (ограниченные сроки заготовки материала), необходимость поддержания в течение 4 недель высокой влажности для адаптации черенков, что приводит к увеличению затрат на получение большого объема посадочного материала и удорожанию технологии (Красикова В.И. Биология и рациональное использование красники (Vaccinium praestans Lamb.) на Сахалине: моногр. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1987. 108 с; Смирнов И.Ю. Способы размножения красники // Адаптивные технологии в растениеводстве: мат-лы Всеросс. науч.-практ. конф., посв. 50-летию агрономического фак-та ФГОУ ВПО Ижевская ГСХА (г. Ижевск, 18-19 ноября 2004 г.). Ижевск, 2005. С. 312-316; Перспективы промышленного выращивания и биотехнологические методы размножения лесных ягодных растений рода Vaccinium (брусника обыкновенная, красника): моногр. / Чудецкий А.И., Бабич Н.А., Мелехов В.И., Макаров С.С., Тяк Г.В., Феклистов П.А. М.: Колос-С, 2023. 184 с; Чудецкий А.И., Макаров С.С. Опыт проращивания семян красники (Vaccinium praestans Lamb.) на аппаратах // Плодоводство, семеноводство, интродукция древесных растений: мат-лы XXV Междунар. науч. конф. (г. Красноярск, 19 апреля 2022 г. ). Красноярск, 2022. С. 124-127).

Однако для получения чистосортного и здорового посадочного материала, освобожденного от вирусной и грибной инфекции используется метод клонального микроразмножения растений в культуре in vitro, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество жизнеспособных растений, предназначенных как для садоводов, так и для промышленного выращивания (Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев: Наукова думка, 1992. 232 с; Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-Пресс, 1999. 160 с; Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология и биоинженерия: учеб. М.: URSS, 2015. 715 с.).

Известны питательные среды для клонального микроразмножения таких ягодных растений рода Vaccinium L., как голубика (патент BY 1533 C1, А01Н 4/00, 16.12.1996. Сидорович Е.А., Кутас Е.Н., Трухан Н.В., Филипеня В.Л. Способ клонального микроразмножения Vaccinium corymbosum L.; патент BY 18431 C1, A01H 4/00, 30.08.2014. Кудряшова O.A., Волотович А.А., Герасимович Т.В. [и др.]. Способ введения сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. в культуру in vitro; патент BY 18521 C1, A01H4/00, 30.08.2014. Кудряшова O.A., Волотович A.A., Герасимович Т.В. [и др.]. Способ получения регенеранта сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. с повышенным содержанием антоциановых пигментов; патент BY 18710 С1, А01Н 4/00, 30.10.2014. Кудряшова О.А., Волотович А.А., Герасимович Т.В. [и др.]. Способ получения регенеранта сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L.), черника (патент RU 2709175 C1, C12N 5/04, 16.12.2019. Березина Е.В., Агеева М.Н., Брилкина А.А. Способ культивирования каллусной ткани Vaccinium myrtillus L.), брусника (патент BY 991 C1, A01H 4/00, 15.12.1995. Сидорович Е.А., Кутас Н.Н. Способ размножения Vaccinium vitis-idaea L. in vitro.), в состав которых в качестве стимуляторов для образования побегов и корней входят регуляторы роста цитокининовой, ауксиновой и фенольной природы. Однако в некоторых случаях наблюдается сильное каллусообразование, торможение процессов формирования и роста побегов и корней, а иногда и отмирание надземной системы. Также часто имеет место специфическая реакция растения на введение в состав среды тех или иных регуляторов роста в зависимости от сорта, что приводит к наличию положительного эффекта только на какой-либо одной культуре или сорте. В свою очередь это способствует снижению ценности разработки и приводит к потере ее универсальности для других культур. При этом важным фактором являются морфогенетические особенности среди видов внутри рода Vaccinium при их размножении.

К наиболее близким, к изобретению по совокупности существенных признаков относится способ клонального микроразмножения красники с использованием модифицированной питательной среды Woody Plant Medium (1980) с добавлением цитокинина 2-iP ( Stanys V., Kawecki Z. Peculiarities of Propagation In Vitro of Vaccinium vitis-idaea L. and V. praestans Lamb. // Biologija. 2002. Vol. 1. P. 84-86). Однако к недостатку данного способа можно отнести недостаточно высокий коэффициент размножения на этапе пролиферации побегов. Кроме того, не создано способов повышения уровня укореняемости и развития корневой и надземной систем растений на этапе укоренения в культуре in vitro, а также адаптации растений-регенерантов после пересадки в нестерильные условия ex vitro. Это приводит к снижению выхода посадочного материала и увеличению цепочки технологического цикла его производства.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы: повышение коэффициента размножения и процента укоренения микропобегов; снижение затрат на получение стандартного посадочного материала; увеличение урожайности.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении коэффициента размножения растений красники при снижении трудозатрат на выращивание саженцев.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата: В способе выращивания красники, включающем посадку экспланта на питательную среду, введение в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, в соответствии с предложенным техническим решением:

- экспланты стерилизуют в растворе дезинфицирующего средства Ника-2 0,01% в течение 10 минут;

- в качестве источника углеводов в питательной среде используют фруктозу в количестве 30,0 г/л питательной среды;

- на этапе введения в культуру in vitro в питательную среду добавляют коллоидное кластерное серебро 1,0 мл/л;

- на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют 6-БАП в концентрации 1,0 мг/л и стимулятор фотосинтеза и дыхания растений Феровит в концентрации 0,1 мл/л;

- на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют индолилмасляную кислоту 1,0 мг/л и березовый уголь 10,0 г/л;

- на этапе адаптации растений in vitro к почвенным условиям ex vitro используют субстрат из смеси торфа переходного типа и шунгита в соотношении 3:1.

Преимущества предложенного способа, поясняющими сущность изобретения представлены в таблицах.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа. Примеры конкретного выполнения.

Стерилизация растительного материала. Для стерилизации стеблей, почек, и других фрагментов растений, предназначенных для вычленения экспланта, применяют различные стерилизующие растворы: водные растворы 0,2% сулемы (двухлористая ртуть), 0,2% нитрата серебра, 5% препарата Лизоформин 3000, дезинфицирующего средства Доместос в разведении 1:3. Перед тем, как приступить к стерилизации стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, промывают бидистиллированной водой и отпускают на 5 секунд в абсолютный спирт, а затем на 5-15 минут - в основной стерилизующий раствор.

Этап введения в культуру in vitro. Свободный от вирусов посадочной материал для клонального микроразмножения растений можно получить методом культуры изолированных апикальных меристем, которые являются наиболее здоровой, свободной от вирусов частью растений и представляют собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мкр) и шириной 0,25 мм. На этапе введения в культуру эксплант помещают на питательную среду Woody Plant Medium (WPM) с добавлением цитокинина в концентрации 6-БАП 0,5 мг/л. Полученные из апикальных меристем растения-регенеранты размножают методом микрочеренкования.

В результате исследований выявлено, что на этапе введения в культуру in vitro красники наиболее эффективными основным стерилизующим агентом оказалось дезинфицирующее средство Ника-2 0,01% при экспозиции 10 мин, где выявлена максимальная жизнеспособность эксплантов (98%). Достаточно высокая жизнеспособность эксплантов красники также выявлена при использовании нитрата серебра 0,2% при экспозиции 10 мин (90%).

Клональное микроразмножение путем черенкования. При культивировании микрорастений на питательной среде с добавлением цитокинина 6-БАП происходит снятие апикального доминирования, что приводит к активации развития пазушных меристем, которые в дальнейшем развиваются в микропобеги. Полученные адвентивные микропобеги отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на новой питательной среде. Для увеличения коэффициента размножения применяют микрочеренкование - деление побегов на черенки, содержащих одну или две пазушные почки.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения красники на микрочеренки с 2-3 междоузлиями и пересадить на питательную среду 1/2 WPM с добавлением цитокинина 6-БАП 0,5 мг/л. Уровень pH_KCl среды должен быть 5,3…5,5. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, 16-часовой фотопериод, температура +25°С и влажность воздуха 70%. Культивирование проводят в течение 25-30 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Процесс корнеобразования in vitro. На данном этапе необходимо создать наиболее благоприятный состав питательной среды, обеспечивающий получение высокого процента укорененных микропобегов. Для этого на последнем этапе клонального микроразмножения уменьшают концентрацию минеральных солей, сахарозы, а также исключают из состава питательной среды цитокинины. Основным регуляторным фактором корнеобразования является присутствие в составе питательной среды ауксинов. Наиболее часто для этого используют ИМК или ИУК в концентрациях от 1,0 до 5,0 мг/л. Выбор гормона и его концентрации зависит от видовых и сортовых особенностей исследуемых растений. Укоренившиеся микропобеги высаживают в условия грунта для адаптации.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения на микрочеренки длиной 1,0-1,5 см с двумя междоузлиями, удаляя нижние листочки и пересадить их на питательную среду, содержащую ауксины ИМК концентрации 0,5-1,0 мг/л. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, фотопериод 16/8 ч, температура +25°С и относительная влажность воздуха 80%. Культивирование проводят в течение 30-50 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Установлено, что на этапе введения в культуру in vitro наибольшие показатели жизнеспособности (98%) имеют экспланты при стерилизации в 0,01% растворе дезинфицирующего средства Ника-2 0,01% в течение 10 мин. На этапе собственно микроразмножения наибольшие значения суммарной длины микропобегов красники (в среднем 13,5 см) выявлены на питательной среде 1/2 WPM с добавлением 6-БАП в концентрации 1,0 мг/л и стимулятора фотосинтеза и дыхания растений Феровит в концентрации 0,1 мл/л. На этапе укоренения микропобегов in vitro красники наибольшие значения суммарной длины корней (в среднем 9,6 см) отмечены на питательной среде 1/2 WPM с добавлением ИМК в концентрации 1,0 мг/л и березового угля в количестве 10,0 г/л.

Адаптация растений in vitro к нестерильным условиям ex vitro. Для адаптации пробирочных растений в почвогрунт самым благоприятным временем года считается период со 2-й декады апреля. Тогда растения с хорошо развитой корневой системой с 2-3 листьями способны адаптироваться к условиям ex vitro. Почвенный субстрат предварительно проливают 5% раствором перманганата калия и оставляют на 14 суток в темном месте. Для лесных ягодных культур в качестве субстрата используют верховой или переходный торф и песок (3:1) и мульчируют сверху мхом сфагнумом, так как мох является хорошим антисептиком и влагоудержителем. Приготовленный субстрат раскладывают в кассеты или микропарники, в которые пересаживают растения in vitro. Температура должна быть +25° С, влажность - 80…90%. Для успешного и 100% приживаемости целесообразно использовать туманообразующую установку (как правило, используется в производственных масштабах). Для небольших партий растений целесообразно применять микропарники или использовать индивидуальное закрытие растений полиэтиленовыми стаканчиками на 14-20 суток, которые потом убирают. По мере роста растений, их пересаживают в более объемные емкости со свежим субстратом. Дальнейшее их выращивание проходит по принятой агротехнике для данного вида растения.

Растения in vitro с хорошо развитой корневой системой вынимают из пробирки пинцетом. Корни промывают в 1% раствором перманганата калия (слабо-розовый цвет) для того, чтобы впоследствии не развивалась патогенная микрофлора. Растения пересадить в кассеты с почвогрунтом, прижать почву и полить водой. После чего кассеты поставить в условия освещения (5000 лк). Каждый день необходимо опрыскивать растения водой в течение 1 недели. Через 10 суток провести первую ревизию растений.

Состав субстрата по-разному влиял на процент приживаемости, длину побегов и количество листьев красники. Наилучший показатель приживаемости (100%) растений составил в варианте использования смеси торфа и шунгита в соотношении 3:1, тогда как на верховом торфе - 70%). На субстрате торф + шунгит 3:1 также наблюдалась наибольшая длина побегов (в среднем 19,1 см) и формировалось наибольшее количество листьев (в среднем 4,1 шт.).

Технико-экономические преимущества или иная эффективность изобретения по сравнению с прототипом. Данная технология получения посадочного материала красники {Vaccinium praestans Lamb.) может быть использована как для создания генетического банка с целью биологического сохранения редких и исчезающих хозяйственно ценных видов растений, так и при массовом получении оздоровленного посадочного материала с последующей закладкой маточников, питомников и сортоучастков. Предложенный способ предусматривает использование в качестве эксплантов меристемы растений, которые пересаживаются на модифицированную питательную среду с добавлением фруктозы, коллоидного кластерного серебра, березового угля, а также цитокининов (6-БАП) и ауксинов (ИМК). Данный способ позволяет повысить коэффициент размножения растений красники в 5 и более раз, ее адаптацию в нестерильных условиях с применением субстрата из смеси перлита и шунгита (3:1) - до 100%, а также снизить в 2 раза трудозатраты при выращивании саженцев красники.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выращивания красники. Способ включает посадку экспланта на питательную среду, введение экспланта в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, согласно изобретению экспланты стерилизуют в растворе дезинфицирующего средства Ника-2 0,01% в течение 10 мин, в качестве источника углеводов в питательной среде используют фруктозу в количестве 30,0 г/л питательной среды, на этапе введения в культуру in vitro в питательную среду добавляют коллоидное кластерное серебро 1,0 мл/л, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют 6-БАП в концентрации 1,0 мг/л и стимулятор фотосинтеза и дыхания растений Феровит в концентрации 0,1 мл/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют ИМК в концентрации 1,0 мг/л и березовый уголь в количестве 10,0 г/л, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя субстрат из смеси торфа переходного типа и шунгита в соотношении 3:1. Изобретение обеспечит повышение коэффициента размножения растений красники при снижении трудозатрат на получение саженцев. 5 табл.

Способ выращивания красники, включающий посадку экспланта на питательную среду, введение в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, отличающийся тем, что экспланты стерилизуют в растворе дезинфицирующего средства Ника-2 0,01% в течение 10 мин, в качестве источника углеводов в питательной среде используют фруктозу в количестве 30,0 г/л питательной среды, на этапе введения в культуру in vitro в питательную среду добавляют коллоидное кластерное серебро 1,0 мл/л, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют 6-БАП в концентрации 1,0 мг/л и стимулятор фотосинтеза и дыхания растений Феровит в концентрации 0,1 мл/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют ИМК в концентрации 1,0 мг/л и березовый уголь в количестве 10,0 г/л, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя субстрат из смеси торфа переходного типа и шунгита в соотношении 3:1.