Способ выращивания княженики арктической (Rubus arcticus L.) Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, лесного хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для ускоренного биологического получения оздоровленного посадочного материала путем микроклонального размножения с целью последующей закладки ягодных плантаций.

Известны классические способы получения посадочного материала княженики арктической {Rubus arcticus L.): ее размножают семенами, так и вегетативно (делением куста, стеблевыми и корневыми черенками). Недостатками этих способов являются: маленький выход посадочного материала, грибные и вирусные болезни передаются от родительских растений, сезонность в работе (ограниченные сроки заготовки материала), необходимость поддержания в течение 4 недель высокой влажности для адаптации черенков, что приводит к увеличению затрат на получение большого объема посадочного материала и удорожанию технологии (Тяк Г.В., Макаров С.С., Калашникова Е.А., Тяк А.В. Размножение и культивирование княженики арктической (Rubus arcticus L.) // Плодоводство и ягодоводство России. 2018. Т. 52. С. 95-99).

Однако для получения чистосортного и здорового посадочного материала, освобожденного от вирусной и грибной инфекции используется метод клонального микроразмножения растений в культуре in vitro, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество жизнеспособных растений, предназначенных как для садоводов, так и для промышленного выращивания (Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев: Наукова думка, 1992. 232 с.; Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-Пресс, 1999. 160 с.; Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология и биоинженерия: учеб. М.: URSS, 2015. 715 с.). Известны питательные среды для клонального микроразмножения ягодных растений рода Rubus L., в состав которых входят в качестве стимуляторов для образования побегов и корней регуляторы роста цитокининовой, ауксиновой и фенольной природы (а/с N 1706481, кл. А01Н 4/00, 15.05.1990. Упадышев М.Т., Высоцкий В.А. Питательная среда для укоренения побегов ежевики. Бюл. N3 от 23.01.1992; патент RU 2080059 C1, А01Н 4/00, 27.05.1997. Высоцкий В.А., Соломонова Ф.Н. Способ получения растений-регенерантов малины in vitro; патент RU 2111653 C1, А01Н 4/00, 27.05.1998. Упадышев М.Т., Гуськов А.В. Питательная среда для укоренения растений in vitro; патент RU 2662670 С2, А01Н 4/00, 26.07.2018. Филиппов М.В., Азарова А.Б., Шестибратов К.А. Способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины {Rubus idaeus)). Однако во многих случаях наблюдается сильное каллусообразование, торможение процессов формирования и роста побегов и корней, а иногда и отмирание надземной системы. К тому же часто имеет место специфическая реакция растения на введение в состав среды тех или иных регуляторов роста в зависимости от сорта, что приводит к наличию положительного эффекта только на какой-либо одной культуре или сорте. В свою очередь это способствует снижению ценности разработки и приводит к потере ее универсальности для других культур.

Наиболее близким, к изобретению по совокупности существенных признаков относится способ клонального микроразмножения ягодных растений рода Rubus L. с использованием модифицированной питательной среды Мурасиге и Скуга (1962) с добавлением ИМК (Donnelly D.J., Stace-Smith R., Mellor F.C. In Vitro Culture of Three Rubus Species // Acta Horticulturae. 1980. No. 12. P. 69-75). Недостатком данной среды является то, что она не позволяет достичь высокого коэффициента размножения на этапе пролиферации побегов и максимально возможного уровня укореняемости и развития корневой и надземной систем растений на этапе укоренения в культуре in vitro, а также их приживаемости после пересадки в нестерильные условия ex vitro. Это приводит к снижению выхода посадочного материала и увеличению цепочки технологического цикла его производства.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы: повышение коэффициента размножения и процента укоренения микропобегов; снижение затрат на получение стандартного посадочного материала; увеличение урожайности.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении коэффициента размножения растений княженики арктической при снижении трудозатрат при выращивании саженцев.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата: В способе выращивания княженики арктической, включающий посадку экспланта на питательную среду, укоренение в культуре in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, в соответствии с предложенным техническим решением в качестве источника углеводов в питательной среде используют фруктозу в количестве 25,0 г/л питательной среды, при этом на этапе введения в культуру in vitro в питательную среду к стерилизующим агентам добавляют фунгицид Ордан в соотношении 1:5, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют березовый уголь 8,0 г/л, коллоидное кластерное серебро 1,0 мл/л и витамин В12 в количестве 0,3 мл/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют 10,0 мг/л янтарной кислоты, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя кокосовый субстрат с добавлением цеолита, которые берут в соотношении 3:1.

- питательная среда в качестве источника углеводов содержит фруктозу в количестве 25 г/л среды;

- на этапе введения в культуру in vitro к стерилизующим агентам добавляется фунгицид Ордан в соотношении 1:5;

- на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляется березовый уголь 8 г/л, коллоидное кластерное серебро 1,0 мл/л и витамин В12 0,3 мл/л;

- на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляется янтарная кислота 10,0 мг/л;

- на адаптации размноженных in vitro растений к почвенным условиям ex vitro используется кокосовый субстрат с добавлением цеолита в соотношении 3:1.

Преимущества предложенного способа, поясняющими сущность изобретения представлены в таблицах.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа. Примеры конкретного выполнения.

Стерилизация растительного материала. Для стерилизации стеблей, почек, и других фрагментов растений, предназначенных для вычленения экспланта, применяют различные стерилизующие растворы: водные растворы 0,1% диацида, сулемы (двухлористая ртуть), 3-6% хлорамина, 5-10% гипохлорита натрия.

Перед тем, как приступить к стерилизации стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, промывают бидистиллированной водой и отпускают на несколько секунд в абсолютный спирт, а затем на несколько минут - в основной стерилизующий раствор.

Этап введения в культуру in vitro. Свободный от вирусов посадочной материал для клонального микроразмножения растений можно получить методом культуры изолированных апикальных меристем, которые являются наиболее здоровой, свободной от вирусов частью растений и представляют собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мкр) и шириной 0,25 мм. На этапе введения в культуру эксплант помещают на питательную среду Мурасиге-Скуга с добавлением цитокинина 6-БАП в концентрации 0,5-1,0 мг/л. Полученные из апикальных меристем растения-регенеранты размножают методом микрочеренкования.

В результате исследований выявлено, что на этапе введения в культуру in vitro наиболее эффективным оказался AgNO₃ 0,2%+Ордан 5% (в соотношении 1:5), где приживаемость составила 90-100%. Ниже был процент приживаемости в варианте с сулемой 0,1% (79-82%), еще ниже -при стерилизации раствором моющего средства Белизна в разведении 1:3 (лишь 55-70%).

Клональное микроразмножение путем черенкования. При культивировании микрорастений на питательной среде с содержанием цитокинина 6-БАП 0,5 мг/л или препарата Цитодеф 0,2 мг/л происходит снятие апикального доминирования, что приводит к активации развития пазушных меристем, которые в дальнейшем развиваются в микропобеги. Полученные адвентивные микропобеги отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на новой питательной среде. Для увеличения коэффициента размножения применяют микрочеренкование - деление побегов на черенки, содержащих одну или две пазушные почки. Для некоторых растений на этапе собственно микроразмножения наблюдается спонтанное образование корней, вероятно за счет присутствия в составе питательной среды веществ с ауксиновой активностью, (например ИУК или ИМК).

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения княженики на микрочеренки с 2-3 междоузлиями и пересадить на питательную среду 1/2 минеральных солей по прописи MS с добавлением цитокинина 6-БАП 0,5 мг/л или препарата Цитодеф 0,2 мг/л. Уровень рН среды должен быть 5,3-5,5. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, 16-часовой фотопериод, температура +25°С и влажность воздуха 70%. Культивирование проводят в течение 38-54 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Процесс корнеобразования in vitro. На данном этапе необходимо создать наиболее благоприятный состав питательной среды, обеспечивающий получение высокого процента укорененных микропобегов. Для этого на последнем этапе клонального микроразмножения уменьшают концентрацию минеральных солей, сахарозы, а также исключают из состава питательной среды цитокининов. Основным регуляторным фактором корнеобразования является присутствие в составе питательной среды ауксинов. Наиболее часто для этого используют ИМК или ИУК в концентрациях от 1 до 5 мг/л. Выбор гормона и его концентрации зависит от видовых и сортовых особенностей исследуемых растений. Укоренившиеся микропобеги высаживают в условия грунта для адаптации.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения на микрочеренки длиной 1,0-1,5 см с двумя междоузлиями, удаляя нижние листочки и пересадить их на питательную среду, содержащую ауксины. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, фотопериод 16/8 ч, температура +25°С и относительная влажность воздуха 80%. Культивирование проводят в течение 30-50 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Суммарная длина корней княженики также была значительно больше в вариантах с питательной средой 1/2 MS+фруктоза 25 г и ИМК при концентрации 1,0 мг/л она достигала в среднем 5,4 см, при 0,5 мг/л - 4,3 см, а с ИУК - 3,4 и 3,8 см, соответственно. При добавлении в питательную среду Экогеля в концентрации 0,5 мг/л суммарная длина корней княженики была значительно больше. Наибольшая суммарная длина корней также была в варианте ИМК 1,0 мг/л+Экогель 0,5 мг/л и составляла 6,3 см.

Адаптация растений in vitro к нестерильным условиям ex vitro. Для адаптации пробирочных растений в почвогрунт самым благоприятным временем года считается период со 2-й декады марта до 1-й декады июня. Тогда растения с хорошо развитой корневой системой с 5-7 листьями способны адаптироваться к условиям ex vitro. Почвенный субстрат предварительно проливают 5% раствором перманганата калия и оставляют на 1 неделю в темном месте. Для лесных ягодных культур в качестве субстрата используют верховой или переходный торф и песок (3:1) и мульчируют сверху мхом сфагнумом, так как мох является хорошим антисептиком и влагоудержителем. Приготовленный субстрат раскладывают в кассеты или микропарники, в которые пересаживают растения in vitro. Температура должна быть +25°С, влажность - 80…90%. Для успешного и 100% приживаемости целесообразно использовать туманообразующую установку (как правило, используется в производственных масштабах). Для небольших партий растений целесообразно применять микропарники или использовать индивидуальное закрытие растений полиэтиленовыми стаканчиками на 14-20 суток, которые потом убирают. По мере роста растений, их пересаживают в более объемные емкости со свежим субстратом. Дальнейшее их выращивание проходит по принятой агротехнике для данного вида растения.

Растения in vitro с хорошо развитой корневой системой вынуть из пробирки пинцетом. Корни промыть в 1% раствором перманганата калия (слабо-розовый цвет) для того, чтобы впоследствии не развивалась патогенная микрофлора. Растения пересадить в кассеты с почвогрунтом, прижать почву и полить водой. После чего кассеты поставить в условия освещения (5000 лк). Каждый день необходимо опрыскивать растения в течение 1 недели, после чего провести первую подкормку половинным минеральным составом среды MS. Через 10 суток провести первую ревизию растений.

У различных культур состав субстрата по-разному влиял на процент приживаемости, длину побегов и количество листьев княженики арктической сортов Anna, Sofia и Галина. Наилучший показатель приживаемости княженики арктической составил на варианте «кокосовый субстрат+цеолит» в соотношении 3:1 у всех сортов - 100%. Достаточно высокая приживаемость была отмечена на субстратах из торфа переходного типа - 85,3-90,0%, тогда как на субстрате «торф+песок» 1:1 - лишь 49,7-50,4%. Таким образом, для адаптации растений-регенерантов княженики арктической лучше использовать субстрат из торфа и кокосовой стружки.

Немаловажным показателем является и урожайность ягодных культур. В 2022-2023 гг.в год вступления в плодоношение растений, полученных способом клонального микроразмножения, средняя урожайность на выработанном торфянике княженики арктической сорта Anna составила 65,7 г/м², сорта Sofia - 66,0 г/м², а отечественного сорта Галина - 77,45 г/м².

Технико-экономические преимущества или иная эффективность изобретения по сравнению с прототипом. Данная технология получения посадочного материала княженики арктической {Rubus arcticus L.) может быть использована при массовом получении оздоровленного посадочного материала с последующей закладкой маточников, питомников и сортоучастков. Предложенный способ предусматривает использование в качестве эксплантов меристемы растений, которые пересаживаются на модифицированную питательную среду с добавлением березового угля, витамино-минерального комплекса, а также ауксинов и цитокининов. Данный способ позволяет повысить коэффициент размножения растений княженики арктической в 10 и более раз, ее адаптацию в нестерильных условиях с применением кокосового субстрата в смеси с цеолитом - до 100%, а также снизить в 3 раза трудозатраты при выращивании саженцев княженики арктической.

Способ выращивания княженики арктической относится к области сельского хозяйства и биотехнологии и может быть использован для ускоренного биологического получения оздоровленного посадочного материала. Способ включает посадку экспланта на питательную среду, укоренение в культуре in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, при этом в качестве источника углеводов в питательной среде используют фруктозу в количестве 25,0 г/л питательной среды, при этом на этапе введения в культуру in vitro в питательную среду к стерилизующим агентам добавляют фунгицид Ордан в соотношении 1:5, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют березовый уголь 8,0 г/л, коллоидное кластерное серебро 1,0 мл/л и витамин В12 в количестве 0,3 мл/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют 10,0 мг/л янтарной кислоты, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя кокосовый субстрат с добавлением цеолита, которые берут в соотношении 3:1. Изобретение обеспечит повышение коэффициента размножения растений княженики арктической при снижении трудозатрат на получение саженцев. 5 табл.

Способ выращивания княженики арктической, включающий посадку экспланта на питательную среду, укоренение в культуре in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, отличающийся тем, что в качестве источника углеводов в питательной среде используют фруктозу в количестве 25 г/л питательной среды, при этом на этапе введения в культуру in vitro в питательную среду к стерилизующим агентам добавляют фунгицид Ордан в соотношении 1:5, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют березовый уголь 8 г/л, коллоидное кластерное серебро 1 мл/л и витамин В12 в количестве 0,3 мл/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют 10 мг/л янтарной кислоты, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя кокосовый субстрат с добавлением цеолита, которые берут в соотношении 3:1.