СПОСОБ СОЗДАНИЯ МОДЕЛИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/52 

Известны способы оценки эффективности модели перекисного окисления путем определения роста общего содержания SH-групп моделированных белков [Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes / B.R. Burchill, J.M. Oliver, С.B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P. 439-447.], но данная модель не позволяет оценить уровень белково-связанного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность моделирования перекисного окисления лимфоцитов. Известен также способ косвенного определения содержания восстановленного глутатиона по активности глутатионпероксидазы [Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах./Под ред. А.И. Карпищенко - Т. 2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с], однако, активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет с высокой точностью оценить уровень восстановленного и белково-связанного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность моделирования перекисного окисления. Известен также способ косвенного определения концентрации восстановленного глутатиона по активности глутатионредуктазы [Медицинские лабораторные технологии: В 2-х томах./Под ред. А.И. Карпищенко - Т. 2 / А.И. Карпищенко. - СПб.: Интермедика. - 1999. - 656 с], однако активность этого фермента зависит от конформации активного центра фермента. При изменении конформации активного центра фермента его активность меняется, что не позволяет достоверно в любой ситуации оценить с высокой точностью уровень восстановленного и белково-связанного глутатиона, а следовательно, оценить эффективность модели переокисления липидов.

Известен также способ оценки эффективности модели переокисления по содержанию восстановленного глутатиона, предложенный М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P. 33-39.], основаный на взаимодействии восстановленного глутатиона (GSH) с 5,5′-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ). При этом образуется окисленный глутатион (GSSG), который затем восстанавливается и вновь взаимодействует с ДТНБ. Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.

Недостатком данного способа является невозможность оценки эффективности модели перекисного окисления липидов в мембране лимфоцитов.

Целью предлагаемого изобретения является повышение оценки эффективности и точности способа.

Указанная цель достигается дополнительной предварительной обработкой лимфоцитов перекисью водорода в конечной концентрации 0,5 мМ для последующей оценки уровня белково-связанного глутатиона лимфоцитов.

Новым в данном способе является внесение в инкубационную среду лимфоцитов перекиси водорода в конечной концентрации 0,5 мМ, без которой невозможна оценка эффективности модели перекисного окисления липидов в мембране лимфоцитов.

Следовательно, только комплексная модернизация способа-прототипа позволяет получить желаемый результат. Только внесение в инкубационную среду лимфоцитов перекиси водорода в концентрации 0,5 мМ позволяет эффективно оценить модель перекисного окисления липидов в мембране лимфоцитов, а именно при одноразовом увеличении уровня белково-связанного глутатиона в 6 раз и более считают модель эффективной, а при увеличении уровня белково-связанного глутатиона в 2 раза и менее считают неэффективной.

В настоящее время известно, что ряд патологических состояний, в том числе гипоксия, нейродегенеративные процессы, онкологические заболевания сопровождаются наработкой активных форм кислорода (АФК), нарушением окислительно-восстановительного баланса клетки с последующим формированием окислительного стресса (ОС) и дизрегуляцией апоптоза. Для изучения процесса дизрегуляции апоптоза в условиях ОС и поиска молекулярных мишеней воздействия на клеточную гибель используются модели, созданные in vitro, получившие в экспериментальной медицине и биологии широкое распространение.

Для интеграции теории в практику необходимы экспериментальные модели патологических процессов, которые создаются на нормально функционирующих клеточных или тканевых системах.

Модель экспериментального перекисного окисления лимфоцитов формировали на лимфоцитах крови. Для индукции переокисления в эксперименте использовали различные концентрации пероксида водорода: 0,3; 0,5; 1 и 2 мМ. Оптимальным был выбран уровень 0,5 мМ (см. таблицы 1 и 2).

Таблица 1 Концентрация активных форм кислорода, количество аннексин-положительных и пропидий иодид-положительных лимфоцитов крови при различных концентрациях пероксида водорода в среде культивирования и увеличение концентрации белково-связанного глутатиона (Me(Q₁-Q₃))   Интактные лимфоциты крови n=20 Конечная концентрация H₂O₂ в культуральной среде лимфоцитов крови 0,3 мМ n=20 0,5 мМ n=20 1 мМ n=20 2 мМ n=20 Активные формы кислорода, у.е. 0,19 (0,11-0,26) 0,45 (0,34-0,65) р<0,05 0,71 (0,57-1,92) р<0,05 0,81 (0,78-1,23) р<0,05 1,56 (1,43-1,89) р<0,05 Количество аннексин-положительных клеток, % 12,20 (11,80-22,40) 36,05 (21,05-37,09) р<0,05 67,90 (53,09-69,34) р<0,05 15,04 (12,78-19,34) 7,56 (6,09-11,98) Количество пропидий
иодид-положительных клеток, % 4,09 (0-4,80) 6,98 (3,67-7,90) 7,22 (6,45-8,09) р<0,05 44,44 (37,67-47,01) р<0,05 67,98 (43,20-82,23) р<0,05 Увеличение концентрации белково-связанного глутатиона (разы) 1 2,8 5,2 р<0,01 3,7 р<0,05 3,5 р<0,05 Примечание: экспериментальным путем установлен оптимальный рост белково-связанного глутатиона при обработке лимфоцитов перекисью водорода в конечной концентрации 0,5 мМ

Таблица 2 Параметры системы глутатиона, концентрация активных форм кислорода (Me(Q₁-Q₃)) в лимфоцитах крови при различных условиях культивирования лимфоцитов   Конечная концентрация H₂O₂ в культуральной среде     лимфоцитов крови     0,3 мМ 0,5 мМ 1 мМ 2 мМ   n=20 n=20 n=20 n=20 GSH нмоль/ 1,91 2,00 2,00 1,76 мг белка (1,89-1,92) (1,5-2,16) (1,91-3,19) (1,64-1,83) GSSG 0,14 0,17 0,14 0,15 нмоль/ мг белка (0,139-0,142) (0,14-0,17) (0,И-0,14) (0,167-0,306) Примечание: установлена максимальная концентрация восстановленного и окисленного глутатиона после обработки лимфоцитов 0,5 мМ перекиси водорода

Для оценки клеточного ответа на воздействие пероксида водорода в изучаемых концентрациях проводили определение: содержания внутриклеточных АФК методом проточной цитофлуориметрии с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией - дихлорфлуоресцеина диацетата. Дихлорфлуоренцеин диацетат, изначально не флуоресцирующий, пассивно проникает внутрь клетки и под действием эстераз переходит в полярное соединение, не способное диффундировать обратно из клетки. После реакции с H₂O₂ он превращается во флуоресцирующий метаболит. Количество аннексин-положительных клеток оценивается методом проточной цитофлуориметрии по способности аннексина V специфически связываться с фосфатидилсерином, экспрессированным на внешней стороне цитоплазматической мембраны апоптозных клеток и количества пропидий иодид-положительных клеток, оцениваемых по способности пропидия йодида (PI) проникать в поврежденные клетки и интерколировать с дефрагментированной ДНК при некрозе клетки.

Поддержание внутри клетки содержания на определенном уровне АФК важно для регуляции жизнедеятельности. Активные формы кислорода участвуют в реализации танатогенной программы посредством изменения редокс-регуляции экспрессии генов и проапоптотических белков.

При активации реакций переокисления происходит окисление белков, что способствует развитию повреждений на уровне молекул, клеток и целого организма.

Первые сведения об окислении белковых молекул АФК получены A.J. Swallow (1960), W.M. Garrison, М.Е. Jayko (1962), которые описали модификацию 17-ти белков под действием ^·ОН и $$O_2^{{\cdot }^{-}}$$ , генерируемых при радиолизе воды. В настоящее время интерес к изучению механизмов взаимодействия АФК с белками значительно возрос. Механизмы повреждений белков различными АФК включают нарушение третичной структуры, агрегацию и денатурацию с изменением функциональной активности и антигенных свойств молекул.

В любых белках наиболее чувствительны к окислению остатки триптофана, цистеина, тирозина и гистидина. Атака функциональных групп аминокислот приводит к образованию первичных радикалов, которые вступают в реакции с соседними остатками аминокислот, создавая сложную картину повреждающего действия АФК на макромолекулы белка. Окислительные изменения структуры полипептидной цепи могут касаться не только функциональных групп в боковых радикалах аминокислотных остатков, но и непосредственно пептидных связей, приводя к фрагментации молекул.

Поэтому в настоящее время окислительное повреждение белков рассматривается как «ранний индикатор повреждения тканей при различных патологических процессах», в том числе при гипоксии и должен использоваться для создания модели перекисного окисления лимфоцитов.

Карбонилированные производные белков (КПБ) образуются при окислении остатков аргинина, лизина, гистидина, пролина, треонина. Вместе с тем, карбонильные группы могут появиться вследствие реакций белка с альдегидными продуктами перекисного окисления липидов, а именно 4-гидрокси-2,3-ноненалем, малоновым диальдегидом с участием гликозилирования и гликооксидации.

Определение уровня окислительно-модифицированных белков (глутатионилирования) в клетках, чувствительных к гипоксии, основывалось на определении: а) содержания SH-групп белков, основанного на способности тиоловых соединений при взаимодействии с ДТНБ образовывать окрашенное соединение - тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм; б) содержания белково-связанного глутатиона, основанного на способности боргидрата натрия высвобождать глутатион из связи с белками; в) уровня карбонилированных аминокислот модифицированных белков методом иммуноферментного анализа.

Оптимальным для оценки эффективности создания модели перекисного окисления лимфоцитов было определение уровня белково-связанного глутатиона. При этом оптимальная конечная концентрация перекиси водорода была установлена экспериментальным путем.

Таким образом, при гипоксии и переокислении существенная доля образованных в клетках активных форм кислорода не утилизируется и оказывает цитотоксические эффекты. Накопление окислительных повреждений белковых и липидных молекул в результате окислительной модификации белков приводит к возникновению окислительного стресса - составного элемента гипоксии. Накопление окислительно-модифицированных производных белковых молекул не только снижает функциональную активность ион-транспортных систем, но и может являться стимулом для запуска программированной гибели в изучаемых клетках.

При этом антиоксидантная система направлена на эффективную нейтрализацию прооксидантов и снижение токсичной для организма гидроперекиси. Основным компонентом антиокидантной системы является восстановленная форма глутатиона.

Глутатион - трипептид (L-γ-глутамил-L-цистеилглицин) с молекулярной массой 307 Da занимает особое место среди SH-содержащих соединений. Наличие γ-глутамильной связи защищает трипептид от ферментативной деградации. В организме глутатион присутствует в двух формах: окисленной - GSSG и восстановленной - GSH, причем содержание GSH в клетках на несколько порядков выше, чем GSSG [Колесниченко Л.С., 1989; Wu G. et al., 2004; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. По данным P. Pietarinen-Runtti et al. (2000), концентрация GSH в нейтрофилах составляет около 5 нмоль/мг белка. Содержание глутатиона в сыворотке крови здоровых людей незначительно, поэтому клетки основную потребность в GSH обеспечивают путем нематричного синтеза [Wu G. et al., 2004] в ходе двух последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеин-синтетазой (КФ 6.3.2.2) и глутатион-синтетазой (КФ 6.3.2.3) [Кулинский В.И., 1990; Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005; Марри Р. и соавт., 2009]. Лимитирующим звеном синтеза является образование γ-глутамилцистеина, зависящее от наличия L-цистеина и его способности окисляться в L-цистин [Зенков Н.К. и соавт., 2001]. В то же время недостаточность глутатион-синтетазы способствует развитию окислительных повреждений в нейтрофилах [Spielberg S.P. et al., 1979].

Глутатион при физиологических значениях pH имеет две анионные карбоксигруппы, положительно заряженную аминогруппу и SH-группу цистеинового остатка, которая придает GSH свойства восстановителя и способность быстро обезвреживать свободные радикалы и АФК [Day R.M., 2005; Zhu Y., 2007; Circu C.L. et al., 2009]. Глутатин является типичным тиолом и, участвуя в одноэлектронных восстановительных реакциях, становится GS^·, который димеризуется до GSSG, легко реагирующего со свободными SH-группами. Второй тип окислительно-восстановительных превращений с участием GSH - это реакции тиолдисульфидного обмена, которые известны как основной путь образования смешанных дисульфидов глутатиона с белками (белок-SSG) и играют роль в регуляции биологических процессов [Chai Y.C. et al., 1994]. В реакциях третьего типа происходит двухэлектронное окисление глутатиона с образованием интермедиата, который реагирует со второй молекулой GSH (получение GSSG) или иной молекулой (синтез смешанного дисульфида) [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].

GSH является ингибитором активных форм кислорода (АФК) и стабилизатором мембран [Биленко М.В, 1989; Udupi V., 1992; Trudel S. et al., 2009]. Он защищает клеточные структуры нейтрофилов от высокотоксичного OCI-, производимого МПО [Carr А.С, Winterbourn С.С, 1997], при этом GSH превращается в глутатион-сульфонамид и дегидроглутатион [Harwood D.T. et al., 2006]. Связывая NO, глутатион образует токсичные для клетки нитрозильные комплексы. Моно нитрозоглутатион может активировать апоптоз [Turpaev К.Т. et al., 1997].

Не всегда восстановительного потенциала GSH достаточно для полной нейтрализации прооксидантов. Существует мнение, что взаимодействие GSH с органическими радикалами эффективно только в условиях удаления $$O_2^{{\cdot }^{-}}$$ , поэтому глутатион образует с супероксиддисмутазой своеобразную антиоксидантную систему, ибо в противном случае развиваются реакции образования H₂O₂ и GS^· [Панкин В.З. и соавт., 1997; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006]. В сочетании с витамином B₁₂ глутатион, а также N-ацетилцистеин, могут потенцировать прооксидантное и цитотоксическое действие на клетку [Соловьева М.Е. и соавт., 2007].

Основной антиоксидантный эффект GSH реализует посредством участия в работе ферментов. Глутатион выступает донором водорода при восстановлении H₂O₂ и перекисей липидов глутатион-пероксидазами и глутатион-S-трансферазами (ГТ) [Hirayama К., 1989; Sies Н. et al., 1997; Кулинский В.И., 1990; Hayes J.D. et al., 2005; Зенков H.K.. и соавт., 2009; Liu G. et al., 2010]. Высокая активность глутатион-редуктазы и накопление GSH оказывает протекторный эффект в отношении альвеолярных макрофагов, инкубируемых с прооксидантами in vitro [Pietarinen Р.К. 1995].

С изменением окислительно-восстановительного баланса сопряжено большое количество реакций, поэтому поддержание оптимального редокс-состояния цитозоля выступает важным условием нормальной жизнедеятельности клеток. Высокая концентрация глутатиона в цитоплазме, его редокс-активность и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают систему GSH/GSSG важнейшим внутриклеточным редокс-буфером [Reed М.С. et al., 2008]. Концентрация GSH в клетке в 500-1000 раз превышает уровень НАДФН и других внутриклеточных редокс-систем, поэтому изменения соотношения GSH/GSSG прямо отражают изменения редокс-статуса клетки [Кулинский В.И., 2007; Asian М., Canatan D., 2008; Reed М.С., 2008]. Считают, что буферная емкость системы глутатиона защищает репликативную систему клетки, а дефицит GSH в условиях высокой генерации АФК приводит к снижению синтеза ДНК и белков [Poot М., 1991; Ланкин В.З., 1997; Day R.M., Suzuki Y.J., 2005; Liu G. et al., 2010].

Исходя из вышесказанного, целесообразно создание модели перекисного окисления липидов путем предварительной обработки лимфоцитов перекисью водорода в конечной концентрации 0,5 мМ с последующим определением белково-связанного глутатиона (табл.1), а также окисленного и восстановленного глутатиона (табл.2). Конечная концентрация перекиси водорода подобрана экспериментально. Лимфоциты обрабатывались перекисью водорода в конечной концентрации 0,3 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 2 мМ (таблица 1, табл.2) Следовательно, комплексная модернизация способа-прототипа позволяет повысить точность создания модели перекисного окисления лимфоцитов.

Каждый вновь введенный в формулу изобретения признак выполняет функцию повышения точности и эффективности способа: дополнительная обработка лимфоцитов перекисью водорода в конечной концентрации 0,5 мМ, подобранная экспериментально для последующего определения белково-связанного глутатиона.

Защита лимфоцитов от продуктов перекисного окисления осуществляется антиоксидантами. Общепринятой номенклатуры антиоксидантов в настоящее время не существует, хотя ряд авторов [Dimascio Р., 1990; Kalra V. et al., 2001; Зайцев В.Г. и соавт., 2003] выделяет два класса: превентивные, снижающие скорость инициации цепной реакции окисления, и гасящие (прерывающие цепь), препятствующие развитию цепной реакции. К превентивным относят каталазу и пероксидазы, разрушающие ROOH, а также агенты, образующие хелатные комплексы с металлами переменной валентности, к прерывающим цепь - фенолы, ароматические амины. В условиях in vivo главными гасящими антиоксидантами являются витамин Е, нейтрализующий ROO^· в липидной фазе мембран [Jore D. et al., 1990; Hong J.H. et al., 2004], фермент СОД, улавливающий $$O_2^{{\cdot }^{-}}$$ в водной фазе клетки [Fridovich 1., 1989; Dimascio P., 1990; CiureaD., 1992], и церулоплазмин - белок острой фазы, выполняющий антирадикальную функцию в крови [Marklund S.L., 1987; AtanasiuRL. et al., 1998].

Более известно деление антиоксидантов на ферменты и соединения неферментативной природы. Последние в определенных концентрациях всегда присутствуют в липидной фазе мембран и водных средах организма и расходуются первыми при устранении проявлений окислительного стресса [Droge W., 2002; Blokhina О., 2003]. Ферменты наиболее активно присоединяется к АОЗ после включения механизмов индукции [Лущак В.П., 2001]. При возникновении ОС расход антиоксидантов возрастает и меняется экспрессия генов, кодирующих белковые компоненты АОЗ [Дубинина Е.Е., 2006]. Между ферментами и неферментативными элементами АОЗ существует равновесие, причем последние при ряде патологических состояний организма могут выступать в качестве прооксидантов [Зенков Н.К. и др., 2001].

Главную роль среди неферментативных антиоксидантных систем защиты отводят глутатиону.

В настоящее время в лабораторной практике наиболее распространен способ оценки эффективности антиоксидантной активности с помощью определения глутатиона.

Содержание глутатиона определяют методом, предложенным М.Е. Anderson (1985) в модификации S. Kojima et al. (2004) [Kojima, S. Low dose gamma-rays activate immune functions via induction of glutathione and delay tumor growth / S. Kojima, K. Nakayama, H. Ishida // J. Radiat. Res. - 2004. - Vol.45, №1. - P.33-39.]. Принцип метода основан на взаимодействии GSH с 5,5'-дитио-бис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ) с образованием тио-2-нитробензойной кислоты, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм. При этом образуется GSSG, который восстанавливается глутатионредуктазой до GSH и вновь взаимодействует с ДТНБ. Скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию общего глутатиона. Для определения содержания GSSG пробы прединкубируются с блокатором SH-групп 2-винилпиридином («Wako», Япония), который необратимо связывает GSH, и, следовательно, скорость образования окрашенного продукта пропорциональна содержанию GSSG.

Лизат лимфоцитов крови готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы. Количество общего глутатиона (GSH и GSSG) определяют в пробе, содержащей 0,1 М Na-фосфатный буфер (pH 7,5) с 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ НАДФН2, 0,3 мМ ДТНБ и 1 U/мл глутатион-редуктазы («Wako», Япония). При измерении уровня GSSG супернатант предварительно инкубируют 30 мин с 10 мМ 2-винилпиридином, после чего определяют скорость реакции в описанной выше инкубационной среде. Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производят с помощью калибровочных графиков, для построения которых растворы GSH и GSSG («Sigma», США) в концентрации от 3 до 100 мкМ обрабатывают аналогично опытным пробам. Концентрацию GSH рассчитывают как разницу между концентрацией общего глутатиона и GSSG, выражая результат в нмоль/мг белка.

Концентрацию белка в лимфоцитах крови определяют методом [A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analyt. Biochem. - 1976. - Vol.7, №1, 2. - P. 248-254.], основанным на взаимодействии Кумасси голубого G-250 с остатками аргинина и лизина в белках. Свободный краситель красного цвета (максимум поглощения - 495 нм) при образовании комплекса с белком переходит в синюю форму (максимум поглощения - 595 нм).

К 0,1 мл лизата лимфоцитов крови добавляют 1,0 мл раствора Кумасси голубого (100 мг красителя, 50 мл 96° этанола, 100 мл 85% Н₃РО₄, Н₂О до 1,0 л), перемешивают, инкубируют 3 мин при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность проб (длина волны 595 нм) против контроля, содержащего 0,1 мл воды и 1,0 мл раствора Кумасси голубого. Содержание белка рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по разведениям стандартного раствора альбумина (1,0 мг/мл) и выражают в мг/мл.

Функционирование лимфоцитов связано с уровнем белково-связанного глутатиона. Определение белково-связанного глутатиона основано на способности боргидрата натрия (NaBH₄) высвобождать из связи с белками глутатион, который при взаимодействии с ДТНБ образует окрашенное соединение, а именно тио-2-нитробензойную кислоту, водный раствор которой имеет максимум поглощения при длине волны 412 нм [Burchill, B.R. Microtubule dynamics and glutathione metabolism in phagocytizing human polymorphonuclear leukocytes [Text] / B.R. Burchill, J.M. Oliver, C.B. Pearson et al. // J. of Cell Biology. - 1978. - Vol.76, №2. - P. 439-447.].

В настоящее время крайне важно оценить эффективность модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов с последующим определением белково-связанного глутатиона. Для решения этой задачи предложен новый способ оценки эффективности модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов после дополнительной предварительной обработки лимфоцитов перекисью водорода в конечной концентрации 0,5 мМ.

Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способа оценки эффективности модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов для оценки их функциональной активности.

Популярность указанного выше способа обоснована его высокой чувствительностью, простотой осуществления и достаточной адекватностью получаемых результатов, лежащих в основе определения белково-связанного глутатиона.

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявленной совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области, и не являются очевидными для специалиста.

Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научной медицинской литературы.

Данное изобретение может быть использовано в медицинской практике для повышения точности оценки функции лимфоцитов при окислительном стрессе и при различных заболеваниях. Таким образом, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».

Метод основан на определении восстановленного глутатиона.

Способ осуществляется следующим образом поэтапно.

1. Выделение лимфоцитов крови из венозной крови.

Пробирки с венозной гепаринизированной кровью (25 Ед/мл) выдерживали при температуре 37°C в течение 40 минут для отделения плазмы и эритроцитов. Затем пробирки переносят в стерильный ламинарный шкаф для выполнения процедуры выделения лимфоцитов крови. Полученную плазму наслаивают на градиент плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (ρ=1,077 г/см³) в соотношении 1:2 и центрифугируют при 500 g в течение 20 минут [Bignold L.P., 1987]. После центрифугирования собирают образовавшееся интерфазное кольцо из смеси мононуклеарных клеток в стерильную центрифужную пробирку с 4,5 мл питательной среды ((90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Россия), инактивированной при температуре 56°C в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина («Борисовский ЗМП», Беларусь), 100 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль/мл Hepes («Flow», Великобритания)), затем центрифугируют 10 минут при 500 g. Процедуру отмывки повторяют дважды: последовательно ресуспендируя клетки и затем центрифугируя в течение 10 минут при 500 g. Выделение лимфоцитов из мононуклеарной фракции клеток проводят на двойном градиенте Перколла [Ulmer A.J., 1979]. Стандартный изоосмотический раствор Перколла (SIP) получают смешиванием одного объема 10х PBS (фосфатно-солевого буфера (pH 7,4)) с девятью объемами Перколла («Sigma», США) (плотность полученного раствора - 1,130 г/мл). Затем готовят 47,5% стандартный изоосмотический раствор Перколла (47,5%о SIP) и 15,0%) стандартный изоосмотический раствор Перколла (15,0% SIP). К клеточной суспензии добавляют 1,5 мл SIP (4°C), перемешивают и переносят в новую стерильную пробирку. Сверху наслаивают 5 мл 47,5% SIP (4°C). Создают верхнюю фазу посредством 2 мл 15,0% SIP (4°C). Центрифугируют при 1500 g и 4°C 45 минут. Собирают интерфазное кольцо (лимфоцитарную фракцию клеток). Объем доводят до 5 мл питательной средой ((90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Россия), инактивированной при температуре 56°C в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина («Борисовский ЗМП», Беларусь), 100 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль/мл Hepes («Flow», Великобритания)), температура раствора должна соответствовать 37°C. Далее проводят центрифугирование при 700 g и 20°C в течение 10 минут. Затем удаляют супернатант до конечного объема 1 мл.

2. Количественное определение численности жизнеспособных лимфоцитов крови с помощью окраски трипановым синим микроскопическим методом.

Лимфоциты крови ресуспендируют в 1 мл клеточной взвеси. Отбирают 100 мкл ресуспендированной клеточной суспензии и добавляют 100 мкл 0,1% раствора трипанового синего на физ. растворе, хорошо перемешивают и заполняют камеру Горяева. Предварительно к камере притирают покровное стекло так, чтобы появлялись радужные ньютоновые кольца (только при этих условиях соблюдался правильный объем камеры). Каплю клеточной взвеси с красителем вносят под притертое покровное стекло. Подсчет клеток производят в 5 больших квадратах по диагонали камеры Горяеева. Расчет клеточности лимфоцитов крови производят по формуле

А×10⁶=(число клеток)/4

где А - клеточность лимфоцитов крови.

3. Методика создания модели перекисного окисления

В среду культивирования лимфоцитов добавляют перекись водорода в конечной крнцентрации 0,5 мМ.

4. Биохимическое исследование белково-связанного, восстановленного и окисленного глутатиона.

Лизат лимфоцитов готовят на 5% сульфосалициловой кислоте, которая осаждает белки, но не ингибирует активность глутатионредуктазы. Количество общего глутатиона (GSH и GSSG) определяют в пробеЮ содержащей 0,1 М Na-фосфатный буфер (pH 7,5) с 1 мМ ЭДТА, 0,4 мМ НАДФН2, 0,3 мМ ДТНБ и 1 U/мл глутатионредуктазы («Wako». Япония). Окисленный глутатион определяют аналогичным способом в клеточном лизате после предварительной инкубации пробы в течение 30 мин с 10 мМ 2-винилпиридином. Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производят с помощью калибровочных графиков, для построения которых используют растворы GSH и GSSG («МР», США) в концентрации от 3 до 100 мкМ, обработанные аналогично опытным пробам. Концентрацию GSH рассчитывают как разницу между концентрацией общего глутатиона и GSSG, выражая результат в нмоль/мг белка. Определение белково-связанного глутатиона.

После инкубации клетки центрифугируют 5 минут при 4°C и 1500 об/мин для их осаждения. Удаляют супернатант. Добавляют 1 мл охлажденного PBS (рН 7,4). Ресуспендируют на вортексе. Центрифугируют 5 минут при 4°C и 1500 об/мин. Удаляют супернатант. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл 5% сульфосалициловой кислоты для получения клеточного лизата. Центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. 1,0 мл осадка белка инкубируют 1 ч при 50°C с 1,0 мл 1% NaBU₄. Далее оставшийся белок осаждают добавлением 0,4 мл 30% ТХУ. Пробу инкубируют 15 мин при 50°C. Затем пробу охлаждают 5 мин (0°C). Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант смешивают с 2,5 мл PBS (рН 7,4) и добавляют 2,0 мл ацетона для полного окисления NaBH₄. Перемешивают. Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Удаляют верхнюю фазу. К нижней фазе добавляют равный объем диэтилового эфира (для удаления ТХУ). Перемешивают. Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Затем снова удаляют верхнюю фазу. Далее процедуру отмывки пробы от ТХУ с помощью диэтилового эфира производят четырехкратно. Затем отбирают 0,1 мл жидкости (из нижней фазы) и смешивают с 0,4 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,0). В пробу добавляют 0,1 мл 0,4 мг/мл ДТНБ. Пробу спектрофотометрируют при 412 нм против контроля, содержащего воду вместо раствора осажденного белка.

Расчет производят с учетом коэффициента молярной экстинкции 13·10³ М^-1 см^-1. Результаты определения концентрации белково-связанного глутатиона выражают в нмоль/мг белка.

Исследование антиоксидантной активности по способу-прототипу и предлагаемому способу выполнялось 40 раз. Результаты исследования обработаны статистически с использованием пакета программ Stat Soft Statistica 6.0.

При проведении исследования по способу-прототипу уровень белково-связанного глутатиона после инкубации лимфоцитов возрастал в 1,5 раза и менее, а при оценке эффективности модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов по предлагаемому способу в случае эффективно созданной модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов уровень белково-связанного глутатиона возрастал в 6,2±0,5 раза, а в случае неэффективно созданной модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов уровень белково-связанного глутатиона возрастал в 2,0±0,2 раза (табл.3).

Полученные результаты уровня белково-связанного глутатиона соответствуют данным литературы [Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н., 2005].

Итак, при применении способа-прототипа был получен недостаточно точный результат, не позволивший оценить эффективность модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов, что связано с отсутствием биохимической стимуляции процесса перекисью водорода в конечной концентрации 0,5 мМ, а наиболее эффективным и точным был предлагаемый способ.

При этом предлагаемый способ прост в исполнении и интерпретации полученных результатов.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки эффективности модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов. Для этого предварительно обрабатывают лимфоциты перекисью водорода в конечной концентрации 0,5 мМ и определяют белково-связанный глутатион. При увеличении уровня белково-связанного глутатиона в 6 раз и более считают модель эффективной, а при увеличении уровня белково-связанного глутатиона в 2 раза и менее считают неэффективной. Изобретение позволяет оценить экспериментальную модель перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов. 3 табл.

Способ оценки эффективности модели перекисного окисления липидов мембран лимфоцитов путем определения белково-связанного глутатиона, отличающийся тем, что предварительно обрабатывают лимфоциты перекисью водорода в конечной концентрации 0.5 мМ и при увеличении уровня белково-связанного глутатиона в 6 раз и более считают модель эффективной, а при увеличении уровня белково-связанного глутатиона в 2 раза и менее считают неэффективной.