СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ. Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Предлагаемая группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для приготовления бактериальных препаратов, применяемых в качестве пробиотических биологически активных добавок к пище.

Известен способ получения пищевого продукта, включающий восстановление сухого обезжиренного молока в нормализованном молоке с сахаром, термообработку, охлаждение, засев среды йогуртной закваской пробиотических молочнокислых бактерий, сквашивание, охлаждение, приготовление соковой части с полиненасыщенными ω-3-жирными кислотами и/или свободной аминокислотой, смешивание с йогуртной частью в соотношении 1:1, диспергирование и фасовку (см. RU №2282995, A23C 9/12, A23L 1/30 17.12.2004).

Недостатком данного способа является сложность процесса его получения и использование только ω-3 полиненасыщенных жирных кислот в относительно небольшом количестве.

Наиболее близким способом к заявляемой группе изобретений по совокупности признаков является способ получения бактериального препарата для лечения и профилактики гиперхолестеринемии, включающий приготовление питательной среды, стерилизацию, охлаждение, внесение инокулята Lactobacillus helveticus ГКНМ 147, наращивание биомассы, отделение биомассы от культуральной жидкости, розлив, укупорка, маркировка, хранение (см. RU №2072692, A61K 38/46, C12N 1/20, C12R 1/225, 21.01.1997).

Недостатком данного способа является высокая кислотообразующая способность L. helveticus и недостаточно высокая холестериндеградирующая активность микроорганизмов, что снижает потребительские и пробиотические свойства.

Таким образом, при производстве бактериальных концентратов основной задачей является подбор условий культивирования для получения концентратов с высокими холестериндеградирующими, пробиотическими и потребительскими свойствами.

Технический результат, обеспечивающий осуществление предлагаемого изобретения, заключается в повышении потребительских свойств и уровня деградации холестерина.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в способе получения бактериального концентрата, включающем приготовление питательной среды, стерилизацию, охлаждение, внесение инокулята, наращивание биомассы, отделение биомассы от культуральной жидкости, розлив, укупорку, согласно изобретению в состав питательной среды вносят 1-1,5% от массы среды кедрового или льняного масла, или рыбьего или нерпичьего жира и засев осуществляют инокулятом штамма бифидобактерий Bifidobacterium longum DK-100.

Указанный технический результат достигается также применением бактериального концентрата, полученного заявляемым способом, в качестве пробиотической биологически активной добавки к пище.

Отличительными признаками заявляемого способа являются внесение в состав питательной среды кедрового или льняного масла, или рыбьего или нерпичьего жира, выбор их оптимальной дозы и использование штамма Bifidobacterium longum DK-100, при этом отмечены высокие холестериндеградирующая активность, потребительские и пробиотические свойства концентрата.

Кроме того, отличительной особенностью заявляемого изобретения является применение бактериального концентрата, полученного предлагаемым способом, в качестве пробиотической биологически активной добавки к пище.

Для осуществления заявляемого способа были проведены экспериментальные исследования.

На первом этапе исследований нами было изучено влияние полиненасыщенных жирных кислот на рост биомассы и количество жизнеспособных клеток бифидобактерий. Для этого инокуляты чистых культур вносили в питательную среду на основе творожной сыворотки с добавлением кедрового или льняного масла, или рыбьего или нерпичьего жира в количестве 0,5-1,5%. Накопление биомассы микроорганизмов проводили путем периодического культивирования при 36±1°C. Рост культур оценивали по изменению оптической плотности λ=450 нм на фотоколориметре. Титр жизнеспособных клеток бифидобактерий определяли по числу КОЕ/см³ при высеве клеточной суспензии на среду ГМК. За контроль взят бактериальный концентрат соответствующего штамма бифидобактерий без добавления растительного масла или животного жира.

Результаты исследований представлены в таблице 1 и на фиг.1, 2.

Таблица 1 Влияние ПНЖК кедрового и льняного масла, рыбьего и нерпичьего жира на рост биомассы и количество жизнеспособных клеток бифидобактерий Наименование штамма микроорганизмов Добавляемый компонент Количество добавляемого
компонента, % Оптическая плотность, ОД Логарифм количества клеток, КОЕ/см³ Продолжительность культивирования, ч 6 12 18 24 6 12 18 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 В. bifidum 8 контроль 0,2 0,29 0,46 0,5 7,2 8,4 10,5 11,2 кедровое масло 0,5 0,21 0,32 0,49 0,59 7,5 9,8 10,7 11,8 1 0,28 0,35 0,52 0,6 7,9 10,2 10,9 12,1 1,5 0,3 0,39 0,57 0,64 8,2 10,5 11,4 12,2 льняное масло 0,5 0,21 0,33 0,53 0,59 7,8 9,8 10,9 11,9 1 0,29 0,35 0,59 0,63 8,1 10,4 11,2 12,3 1,5 0,31 0,4 0,61 0,66 8,3 10,6 11,8 12,4 рыбий жир 0,5 0,29 0,33 0,51 0,57 8,4 10 11 12 1 0,31 0,4 0,64 0,68 8,4 10,4 11,4 12,4 1,5 0,37 0,45 0,67 0,71 8,5 11 12 13,4 нерпичий жир 0,5 0,22 0,33 0,48 0,55 8,3 10 11 12 1 0,28 0,35 0,51 0,58 8,3 10,3 11,3 12,3

Продолжение таблицы 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 В. bifidum 8 нерпичий жир 1,5 0,32 0,38 0,55 0,6 8,4 10,9 11,5 12,4 В. longum DK 100 контроль 0,2 0,31 0,49 0,54 7,3 8,4 10,5 11,6 кедровое масло 0,5 0,22 0,33 0,5 0,59 8 10 11 12   1 0,3 0,37 0,53 0,6 8 10,4 11 12,2   1,5 0,32 0,41 0,6 0,67 8,3 10,6 11,5 12,4 льняное масло 0,5 0,22 0,33 0,59 0,6 8 10 11 12   1 0,3 0,37 0,61 0,67 8,2 10,5 11,3 12,5   1,5 0,33 0,4 0,67 0,7 8,4 10,8 11,9 12,7 рыбий жир 0,5 0,3 0,4 0,54 0,6 8,3 10 12 12,5   1 0,33 0,49 0,68 0,7 8,3 10,3 12 13   1,5 0,38 0,53 0,8 0,89 8,6 11 12,3 13,5 нерпичий жир 0,5 0,28 0,34 0,52 0,6 8,3 10 11 12   1 0,33 0,4 0,55 0,66 8,3 10,4 11,4 12,3   1,5 0,35 0,45 0,68 0,74 8,5 10,9 11,5 12,4 В. longum В379М контроль 0,19 0,28 0,46 0,5 7,2 8 10,5 11,2 кедровое масло 0,5 0,21 0,29 0,49 0,57 7,5 9,7 10,6 11,8   1 0,26 0,31 0,51 0,59 7,8 10,1 10,7 12   1,5 0,29 0,37 0,56 0,62 8,2 10,3 11,2 12,1 льняное масло 0,5 0,21 0,31 0,51 0,58 7,8 9,7 10,6 11,8   1 0,26 0,34 0,59 0,6 8 10,2 11,2 12   1,5 0,29 0,38 0,6 0,64 8,2 10,4 11,6 12,3 рыбий жир 0,5 0,23 0,34 0,51 0,6 8,3 10 11 12   1 0,3 0,38 0,6 0,64 8,3 10,3 11,3 12,3   1,5 0,33 0,44 0,63 0,7 9 11 11,5 13 нерпичий жир 0,5 0,21 0,31 0,51 0,6 8,3 10 11 12 1 0,27 0,33 0,55 0,65 8,3 10,3 11,3 12 1,5 0,31 0,38 0,59 0,67 8,4 11 11,4 12,3

Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 1, внесение кедрового и льняного масла, рыбьего и нерпичьего жира в питательную среду ускоряет наращивание биомассы и рост бифидобактерий в питательной среде по сравнению с контролем. Максимальный рост бифидобактерий отмечен при концентрации кедрового и льняного масла, рыбьего и нерпичьего жира в количестве 1,5% (фиг.1 и 2).

Указанные штаммы обладают пробиотическими свойствами, но наиболее интенсивное нарастание биомассы бифидобактерий и наиболее высокое количество жизнеспособных клеток наблюдается при использовании штамма В. longum DK-100 (фиг.1 и 2).

На следующем этапе исследований было изучено влияние полиненасыщенных жирных кислот кедрового и льняного масла, рыбьего и нерпичьего жира на холестериндеградирующие свойства бифидобактерий.

В качестве источника холестерина применяли очищенную сыворотку крови. Культивирование проводили в течение 24 часов с двукратной нейтрализацией. За этот период следили за динамикой холестерина в питательной среде.

Результаты исследований представлены в таблице 2 и на фиг.3.

Таблица 2 Холестериндеградирующая активность бифидобактерий Наименование штамма микроорганизмов Добавляемый компонент Количество добавляемого компонента, % Содержание холестерина в питательной среде, ммоль/л Уровень разрушения холестерина, % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 В. bifidum 8 контроль 4,92 4,92 4,9 4,76 4,42 3,12 36,59 кедровое масло 0,5 4,92 4,92 4,83 4,52 3,97 2,43 50,61 1 4,92 4,91 4,79 4,31 3,84 2,01 59,15 1,5 4,92 4,9 4,76 4,26 3,68 1,72 65,04 льняное масло 0,5 4,92 4,92 4,81 4,46 3,89 2,24 54,47 1 4,92 4,91 4,76 4,27 3,76 1,69 65,65 1,5 4,92 4,9 4,71 4,19 3,57 1,41 71,34 рыбий жир 0,5 4,92 4,87 4,51 3,92 2,97 2,06 58,13 1 4,92 4,84 4,39 3,86 2,65 1,81 63,21 1,5 4,92 4,78 4,07 3,54 2,16 1,17 76,22 нерпичий жир 0,5 4,92 4,9 4,78 4,53 3,14 2,11 57,11 1 4,92 4,88 4,71 4,42 2,75 1,52 69,11 1,5 4,92 4,85 4,59 4,18 2,67 1,24 74,8 В. longum DK 100 контроль 4,92 4,92 4,87 4,61 4,31 2,95 40,04 кедровое масло 0,5 4,92 4,91 4,81 4,47 3,82 2,37 51,83 1 4,92 4,9 4,73 4,26 3,64 1,85 62,02 1,5 4,92 4,89 4,68 4,1 3,35 1,57 68,09 льняное масло 0,5 4,92 4,91 4,75 4,38 3,76 2,19 55,49 1 4,92 4,9 4,69 4,21 3,57 1,54 68,7 1,5 4,92 4,88 4,61 4,03 3,28 1,26 74,39 рыбий жир 0,5 4,92 4,86 4,42 3,85 2,84 1,92 60,98 1 4,92 4,81 4,27 3,79 2,51 1,48 69,92 1,5 4,92 4,75 4,04 3,51 2,12 1,03 79,07 нерпичий жир 0,5 4,92 4,89 4,73 4,46 2,96 1,99 59,55 1 4,92 4,86 4,67 4,38 2,54 1,51 69,31 1,5 4,92 4,81 4,52 4,14 2,53 1,13 77,03

Продолжение таблицы 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 В. longum В379М контроль 4,92 4,92 4,91 4,81 4,54 3,21 34,76 кедровое масло 0,5 4,92 4,92 4,89 4,62 4,19 2,57 47,76 1 4,92 4,91 4,85 4,45 4,02 2,21 55,08 1,5 4,92 4,91 4,81 4,31 3,87 1,94 60,57 льняное масло 0,5 4,92 4,92 4,85 4,53 4,14 2,47 49,8 1 4,92 4,91 4,79 4,41 3,95 2,02 58,94 1,5 4,92 4,91 4,74 4,31 3,86 1,63 66,87 рыбий жир 0,5 4,92 4,89 4,75 4,07 3,34 2,12 56,91 1 4,92 4,87 4,56 3,91 2,79 1,89 61,59 1,5 4,92 4,83 4,15 3,62 2,13 1,38 71,95 нерпичий жир 0,5 4,92 4,9 4,81 4,56 3,45 2,25 54,27 1 4,92 4,89 4,78 4,52 2,91 1,93 60,77 1,5 4,92 4,87 4,63 4,24 2,68 1,51 69,31

Как видно из табл.2, отмечено высокое разрушение холестерина в процессе культивирования у всех штаммов пробиотических микроорганизмов. Уровень холестерина в питательной среде определяли ферментативным методом (см. БАЛЯБИНА М.Д. Методы определения холестерина/М.Д. БАЛЯБИНА, В.В. СЛЕПЫШЕВА, А.В. КОЗЛОВ//Гепатология-2004.-Т6, №6.- с.73-75; ТУ 9398-267-23548172-2002), основанным на внесении в питательную среду крови человека.

Наибольшей холестериндеградирующей активностью обладает В. Longum DK-100, который метаболизирует 68,09% общего холестерина при внесении кедрового масла, 74,39% - при внесении льняного масла, 79,07% - при внесении рыбьего жира и 77,03% - при внесении нерпичьего жира соответственно (фиг.3).

Таким образом, полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что внесение кедрового и льняного масла, а также рыбьего и нерпичьего жира, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты, повышает холестеринметаболизирующие свойства и количество жизнеспособных клеток бифидобактерий, что свидетельствует о повышении пробиотических свойств.

Сравнительный анализ ассимиляции холестерина представлен в таблице 3 (ШЕНДЕРОВ Б.А. Медицинская и микробная экология и функциональное питание. Том II: Социально экономические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных.- М: Изд-во ГРАНТЪ,1998.-416 с.).

Таблица 3 Микроорганизмы Процент ассимиляции холестерина Аналог Предлагаемый способ С кедровым маслом С льняным маслом С рыбьим жиром С нерпичьим жиром B.longum KV8001 54,29         B.longum DK-100   68,09 74,39 79,07 77,03

Полученные результаты свидетельствуют, что культивирование бифидобактерий в питательной среде с добавление 1,5% кедрового или льняного масла, рыбьего или нерпичьего жира приводит к повышению холестеринметаболизирующей способности бифидобактерий. Наиболее высокая холестеринметаболизирующая активность отмечена у культур с добавлением рыбьего жира.

Следует отметить, что БАД на основе пробиотических микроорганизмов и кедрового и льняного масла, рыбьего или нерпичьего жира в литературе не обнаружено.

На основании проведенных исследований подобрана оптимальная доза внесения кедрового или льняного масла, рыбьего или нерпичьего жира в количестве 1-1,5% от объема питательной среды, стимулирующая активный рост и жизнеспособность бифидобактерий. Также установлено, что данные бактериальные концентраты обладают высокими потребительскими свойствами: консистенция однородная, без отделения сыворотки; вкус и запах чистые, кисловатые, с привкусом соответствующего добавленного растительного масла или животного жира; высокая холестеринметаболизирущая активность и высокое количество жизнеспособных клеток бифидобактерий.

Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод, что бифидосодержащие бактериальные концентраты с кедровым или льняным маслом, рыбьим или нерпичьим жиром обладают высокой биохимической высокой холестеринметаболизирующей активностью.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

В качестве питательной среды для культивирования бифидобактерий используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют ростовые компоненты: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон, агар. Устанавливают pH среды в пределах (7±0,1). Затем стерилизуют при температуре 121°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры культивирования 36±1°C, вносят 1-1,5% от массы среды кедрового или льняного масла, или рыбьего или нерпичьего жира и 5% инокулята закваски Bifidobacterium longum DK-100. Проводят наращивание клеток бифидобактерий в течение 20-24 часов при двукратной нейтрализации среды через 10 часов для поддержания pH на оптимальном уровне. Затем отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости. Полученную суспензию клеток разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 12 см³, укупоривают, охлаждают до (4±2)°C.

Полученный жидкий бактериальный концентрат используют в качестве пробиотических биологически активных добавок к пище.

Пример 1. В качестве питательной среды для культивирования бифидобактерий используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют ростовые компоненты: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон, агар. Устанавливают pH среды в пределах (7±0,1). Затем стерилизуют при температуре 121°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры культивирования 36°C, вносят 1% кедрового масла и 5% инокулята закваски Bifidobacterium longum DK-100. Проводят наращивание клеток бифидобактерий в течение 24 часов при двукратной нейтрализации среды через 10 часов для поддержания pH на оптимальном уровне. Затем отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости. Полученную суспензию клеток разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 12 см³, укупоривают, охлаждают до (4±2)°C.

Пример 2. В качестве питательной среды для культивирования бифидобактерий используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют ростовые компоненты: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон, агар. Устанавливают pH среды в пределах (7±0,1). Затем стерилизуют при температуре 121°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры культивирования 36°C, вносят 1% льняного масла и 5% инокулята закваски Bifidobacterium longum DK-100. Проводят наращивание клеток бифидобактерий в течение 24 часов при двукратной нейтрализации среды через 10 часов для поддержания pH на оптимальном уровне. Затем отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости. Полученную суспензию клеток разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 12 см³, укупоривают, охлаждают до (4±2)°C.

Пример 3. В качестве питательной среды для культивирования бифидобактерий используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют ростовые компоненты: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон, агар. Устанавливают pH среды в пределах (7±0,1). Затем стерилизуют при температуре 121°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры культивирования 36°C, вносят 1% рыбьего жира и 5% инокулята закваски Bifidobacterium longum DK-100. Проводят наращивание клеток бифидобактерий в течение 24 часов при двукратной нейтрализации среды через 10 часов для поддержания pH на оптимальном уровне. Затем отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости. Полученную суспензию клеток разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 12 см³, укупоривают, охлаждают до (4±2)°C.

Пример 4. В качестве питательной среды для культивирования бифидобактерий используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют ростовые компоненты: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон, агар. Устанавливают pH среды в пределах (7±0,1). Затем стерилизуют при температуре 121°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры культивирования 36°C, вносят 1% нерпичьего жира и 5% инокулята закваски Bifidobacterium longum DK-100. Проводят наращивание клеток бифидобактерий в течение 24 часов при двукратной нейтрализации среды через 10 часов для поддержания pH на оптимальном уровне. Затем отделяют бактериальную массу от культуральной жидкости. Полученную суспензию клеток разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 12 см³, укупоривают, охлаждают до (4±2)°C.

Пример 5. Применение жидкого бактериального концентрата, полученного по примерам 1-4, в качестве пробиотических биологически активных добавок к пище.

Полученные жидкие бактериальные концентраты по примерам 1-4 применяют в качестве пробиотических биологически активных добавок к пище для восстановления микрофлоры желудочно-кишечного тракта, повышения иммунитета и защиты организма от сердечно-сосудистых заболеваний.

Рекомендуется принимать взрослым 3 раза в день по одной чайной ложке во время приема пищи в течение четырех недель.

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для приготовления бактериальных препаратов, применяемых в качестве пробиотических биологически активных добавок. Способ получения бактериального концентрата предусматривает приготовление питательной среды, стерилизацию, охлаждение. Внесение инокулята, наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной жидкости, розлив и укупорку. В состав питательной среды вносят кедровое или льняное масло, или рыбий или нерпичий жир в количестве 1-1,5% от массы среды, а в качестве инокулята используют штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum DK-100. Полученный бактериальный концентрат используют в качестве пробиотической биологически активной добавки к пище. Группа изобретений позволяет восстановить микрофлору желудочно-кишечного тракта. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 3 ил., 5 пр.

1. Способ получения бактериального концентрата, предусматривающий приготовление питательной среды, стерилизацию, охлаждение, внесение инокулята, наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной жидкости, розлив, укупорку, отличающийся тем, что в состав питательной среды вносят кедровое или льняное масло или рыбий или нерпичий жир в количестве 1-1,5% от массы среды, в качестве инокулята используют бифидобактерий Bifidobacterium longum DK-100.

2. Применение бактериального концентрата, полученного способом по п.1, в качестве пробиотической биологически активной добавки к пище.