СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2015 года по МПК C12Q1/06 G01N13/00 C12R1/385 C12R1/445 

Описание патента на изобретение RU2547935C1

Изобретение относится к области медицинской и промышленной микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях и может быть использовано в исследовательских целях и лабораторной диагностике для характеристики штаммов по их биологической активности.

Образование биопленок является одной из основных стратегий выживания бактерий в окружающей среде. Такой способ существования бактерий создает большие проблемы в промышленной деятельности человека и, что особенно важно, в медицинской практике. В настоящее время стало известно, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантируемого оборудования - линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, - обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхности этих устройств [Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. - 2004. - Т.40, №11. - С.1445-1456].

Большое значение для диагностики и профилактики биопленкообразования микроорганизмов имеет количественная оценка способности микроорганизма к образованию биопленки. Для количественной оценки биопленкообразования можно использовать различные методы.

Известен способ оценки биопленкообразования, согласно которому биопленку сначала выращивают на определенной поверхности в течение требуемого времени, соскабливают с подложки, суспендируют в физиологическом растворе и определяют количество микроорганизмов в биопленке [Тец В.Г. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками // Автореферат диссертации канд. мед. наук. СПб.: С.-Петерб. государственный мед. акад. им. И.И. Мечникова 2007. - 22 с]. Основными недостатками известного способа являются: длительность процесса до 3-4 суток, высокий расход материалов, техническая сложность в получении однородного соскоба с поверхности и в целом высокая трудоемкость.

Известен способ оценки биопленкообразования, предложенный O′Toole G.A. с соавт. [O′Toole G.A., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Ann. Rev. Microbiol. - 2000. - 54. - P.49-79]. Согласно этому способу микроорганизмы выращивают в лунках пластиковых планшетов, окрашивают и по изменению интенсивности окраски красителя судят о способности штамма к биопленкообразованию.

Существенным недостатком данного способа является ограничение по материалу подложки, на которой исследуют биопленкообразование - полистирол. Адсорбция красителя подложкой полистиролового планшета может приводить к получению завышенных результатов.

Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ, предложенный Леоновым В.В. (прототип) [Леонов В.В. Количественная оценка способности условно-патогенных микроорганизмов к образованию биопленки в эксперименте. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - №10. - С.57-59]. Согласно прототипу микроорганизмы выращивают в бульоне на стеклянной подложке в течение 24-48 ч и по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом проводят определение удельной скорости биопленкообразования штамма исследуемого микроорганизма графическим способом.

Основной признак заявляемого изобретения, общий с прототипом: использование в качестве критерия оценки процесса образования биопленки удельной скорости, определяемой по изменению краевого угла смачивания ее поверхности вазелиновым маслом.

Недостатками способа прототипа являются: высокая трудоемкость, длительность свыше 24 ч и низкая чувствительность, связанная с использованием в качестве подложки, на которой исследуется биопленкообразование микроорганизмов, стекла.

Основными отличиями от прототипа, обеспечивающими получение заявляемого технического результата, являются использование в качестве материала подложки агаровой пластинки, измерение краевого угла смачивания поверхности биопленки через 3 и 9 ч инкубации и расчет удельной скорости биопленкообразования проводят по формуле (2).

Заявляемый способ решает задачи по ускорению и упрощению количественной оценки процесса биопленкообразования, а использование в качестве материала подложки агаровой пластинки позволяет увеличить чувствительность и проводить дифференциальную оценку биопленкообразования между штаммами микроорганизмов, хорошо образующими биопленку, например Pseudomonas aeruginosa.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что на агаровую пластинку с выросшей биопленкой наносят каплю вазелинового масла и с помощью горизонтального отсчетного микроскопа определяют краевой угол смачивания ее поверхности. Способность микроорганизма к образованию биопленки оценивают по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки в процессе культивирования, рассчитывая удельную скорость биопленкообразования.

Краевой угол смачивания в зависимости от размера капли рассчитывают по следующей формуле:

где θ - краевой угол смачивания (°);

h, l - высота и длина капли (мм) соответственно.

Удельную скорость биопленкообразования рассчитывают по следующей формуле:

где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1;

t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч (3 и 9 ч);

θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч.

Примеры 1-5. В стерильные чашки Петри (D=90 мм) с 10 мл питательного бульона МПБ (НПО «Питательные среды», Махачкала) и двумя из агаровыми пластинками (Difco) размером 2,5×2,5 см вносят 0,1 мл микробной взвеси Pseudomonas aeruginosa, стандартизованной до оптической плотности 0,100-0,110 опт. ед. (Specord). Чашки Петри с посевами инкубируют при 37°C. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимают из культуральной жидкости и отмывают 10 мл стерильной дистиллированной воды от планктонных клеток и 15 мин высушивают в термостате при 37°C. Образование биопленки оценивают по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом. Замеры проводят через 3 и 9 ч инкубации с помощью горизонтального отсчетного микроскопа марки МПБ-2 в герметичной кювете, которая позволяет рассматривать анализируемый объект в условиях равновесия.

Для одного из исследованных штаммов были получены следующие значения: h(3,0 ч)=2,0 мм; l(3 ч)=7,0 мм; h(9 ч)=1,4 мм; l(9 ч)=7,0 мм.

По изменению краевого угла смачивания судили об удельной скорости образования биопленки.

1. Расчет угла смачивания по формуле (1):

2. Расчет удельной скорости биопленкообразования по формуле (2):

Результаты эксперимента приведены в табл.1.

Как видно из данных таблицы 1, с помощью заявляемого способа получены достоверные отличия по биопленкообразованию между разными штаммами и группами микроорганизмов, а величину удельной скорости биопленкообразования, определенную данным способом, можно использовать для количественной оценки способности штамма к биопленкообразованию.

Примеры 6-8. Для сравнения чувствительности определения биопленкообразования известным способом и заявляемым были отобраны 3 штамма Pseudomonas aeruginosa с одинаковой способностью к биопленкообразованию, определенной способом-прототипом. Величина признака удельной скорости биопленкообразования составляла (5,6±0,4)·102, ч-1. Таким образом, при определении удельной скорости биопленкообразования у данных штаммов, заявляемым способом были получены достоверные отличия по биопленкообразованию (табл.2).

Полученные результаты показывают более высокую чувствительность заявляемого способа по сравнению со способом-прототипом.

Примеры 9-13 проведены в условиях, аналогичных примеру 6, но с использованием в качестве исследуемого микроорганизма Staphylococcus aureus (табл.3).

Как видно при сравнении данных таблиц 1 и 3, заявляемый способ позволяет получить статистически достоверные отличия в значениях удельной скорости биопленкообразования микроорганизмов уже через 9 ч инкубации. Использование в качестве материала подложки агара позволяет выявить различия в биопленкообразовании не только между разными группами, но и штаммами микроорганизмов.

Технический результат: изобретение позволяет ускорить и упростить процесс количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов, повышает чувствительность метода, позволяет проводить дифференциальную оценку биопленкообразования между штаммами микроорганизмов, хорошо образующими биопленку.

Таблицы

Таблица 1 Биопленкообразование Pseudomonas aeruginosa Пример Штамм µb·102, ч-1 1 27853 АТСС (5,6±0,4) 2 5070 (5,2±0,2) 3 2364 (5,6±0,3) 4 4922 (4,9±0,2) 5 2898 (5,0±0,2)

Таблица 2 Сравнительный анализ чувствительности количественной оценки биопленкообразования Pseudomonas aeruginosa с использованием заявляемого способа и способа-прототипа Пример Штамм Биопленкообразование Способ-прототип Заявляемый способ (µb·102, ч-1) 6 27853 АТСС (5,6±0,4) (5,6±0,4) 7 5070 (5,6±0,2) (5,0±0,2) 8 2898 (5,6±0,2) (4,8±0,1)

Таблица 3 Биопленкообразование Staphylococcus aureus Пример Вид и штамм µb·102, ч-1 9 25923 АТСС (3,9±0,1) 10 2891 (2,7±0,1) 11 391 (5,0±0,2) 12 2888 (3,5±0,3) 13 352 (5,9±0,6)

Похожие патенты RU2547935C1

название год авторы номер документа
Способ определения уровня биосовместимости штаммов бифидобактерий и/или лактобактерий 2018
  • Бухарин Олег Валерьевич
  • Перунова Наталья Борисовна
  • Иванова Елена Валерьевна
RU2676910C1
СРЕДСТВО ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО ВЛИЯНИЯ НА БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ 2016
  • Бухарин Олег Валерьевич
  • Фролов Борис Александрович
  • Чайникова Ирина Николаевна
  • Перунова Наталья Борисовна
  • Иванова Елена Валерьевна
  • Филиппова Юлия Владимировна
  • Бондаренко Таисия Александровна
  • Сидорова Оксана Игоревна
  • Панфилова Татьяна Владимировна
  • Железнова Алла Дмитриевна
  • Сарычева Юлия Александровна
RU2646488C2
Штамм бактерий Bifidobacterium longum ICIS-505 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиперсистентной активностью в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов 2018
  • Бухарин Олег Валерьевич
  • Иванова Елена Валерьевна
  • Перунова Наталья Борисовна
  • Андрющенко Сергей Валерьевич
RU2704423C1
ДОБАВКА К ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК (ВАРИАНТЫ) 2014
  • Баранов Александр Александрович
  • Чеботарь Игорь Викторович
  • Смирнов Иван Евгеньевич
  • Лазарева Анна Валерьевна
RU2571854C1
Способ оценки морфологической структуры биоплёнок микроорганизмов в динамике биоплёнкообразования 2024
  • Кряжев Дмитрий Валерьевич
  • Кропотов Василий Сергеевич
RU2826880C1
Способ определения пленкообразующей функции псевдомонад на базе масс-спектрометрии методом MALDI-ToF 2023
  • Алешукина Анна Валентиновна
  • Березинская Ираида Сергеевна
  • Мартюшева Ирина Борисовна
RU2807137C1
СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИМИКРОБНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ АНТИСЕПТИКОВ НА БАКТЕРИИ, СУЩЕСТВУЮЩИЕ В ФОРМЕ БИОПЛЕНКИ 2015
  • Андреева Светлана Владимировна
  • Бахарева Лариса Израилевна
  • Бурмистрова Александра Леонидовна
RU2603100C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИМИКРОБНЫХ НАНОКОМПОЗИТНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ 2014
  • Елинсон Вера Матвеевна
  • Лямин Андрей Николаевич
RU2592797C2
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИЛАКТОФЕРРИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ 2003
  • Бухарин О.В.
  • Валышев А.В.
  • Чайникова И.Н.
  • Валышева И.В.
  • Карташова О.Л.
  • Калинина Т.Н.
  • Смолягин А.И.
RU2245923C2
СПОСОБ ДЕСТРУКЦИИ БИОПЛЁНОК PSEUDOMONAS AERUGINOSA КОМБИНАЦИЕЙ ОЗОНА С ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА 2023
  • Ушакова Анастасия Алексеевна
  • Каримов Ильшат Файзелгаянович
  • Борисов Сергей Дилюсович
  • Паньков Александр Сергеевич
RU2802662C1

Реферат патента 2015 года СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для количественной оценки способности микроорганизмов к биопленкообразованию на различных биотических и абиотических поверхностях. Способ заключается в том, что в подготовленные для посева стерильные чашки Петри с питательным бульоном и двумя агаровыми пластинками вносят микробную взвесь. Чашки Петри с посевами инкубируют при 37°C. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимают из культуральной жидкости, отмывают стерильной дистиллированной водой от планктонных клеток и высушивают в термостате. Проводят замеры углов смачивания через 3 и 9 ч. По изменению краевого угла смачивания судят об удельной скорости образования биопленки. При этом рассчитывают удельную скорость биопленкообразования по формуле:

μ b = 1 t 2 t 1 l n ( θ 1 θ 2 ) , где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1; t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч (3 и 9 ч); θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч. Изобретение позволяет ускорить и упростить процесс количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов и повысить чувствительность метода. 3 табл.

Формула изобретения RU 2 547 935 C1

Способ количественной оценки биопленкообразования микроорганизмов, заключающийся в том, что на подложку с выросшей биопленкой наносят каплю вазелинового масла, с помощью горизонтального отсчетного микроскопа измеряют краевой угол смачивания ее поверхности, отличающийся тем, что в качестве материала подложки используют агаровые пластинки и замеры угла смачивания проводят через 3 и 9 ч культивирования микроорганизмов, а удельную скорость биопленкообразования (µb) рассчитывают по формуле:
,
где µb - удельная скорость биопленкообразования, ч-1;
t1 и t2 - продолжительность инкубации, ч;
θ1,2 - краевые углы смачивания (°), измеренные после инкубации в течение 3 и 9 ч.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2547935C1

ЛЕОНОВ В.В
Количественная оценка способности условно-патогенных микроорганизмов к образованию биопленки в эксперименте
Клиническая лабораторная диагностика
Изложница с суживающимся книзу сечением и с вертикально перемещающимся днищем 1924
  • Волынский С.В.
SU2012A1
МАЯНСКИЙ А.Н
и др
Pseudomonas aeruginosa: характеристика биопленочного процесса
Молекулярная генетика, микробиология и вирусология
М.: Медицина, 2012г, N1, с.3-8.

RU 2 547 935 C1

Авторы

Леонов Вадим Вячеславович

Соколова Татьяна Николаевна

Афанасьева Татьяна Петровна

Христофорова Юлия Валерьевна

Пахомова Мария Алексеевна

Даты

2015-04-10Публикация

2013-12-11Подача