СПОСОБ ГЕРМЕТИЗАЦИИ ГРАНУЛ, СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ-МИШЕНИ, МАТРИЦА, НАБОР И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ-МИШЕНИ Российский патент 2015 года по МПК G01N35/02 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу герметизации гранул (т.е. способу герметизации гранул), способу обнаружения молекулы-мишени, матрице, набору и устройству для обнаружения молекулы-мишени.

Уровень техники

Известен одномолекулярный анализ как способ осуществления разных анализов путем наблюдения за биомолекулами, такими как белки и нуклеиновые кислоты, так, чтобы биомолекулы можно быть идентифицировать по отдельности. Для того чтобы проводить одномолекулярный анализ, известны некоторые способы.

Источник 1 из патентной литературы раскрывает микрокамеру для обнаружения ферментативной активности одной молекулы. Эта микрокамера включает контейнерную часть, в которой может быть герметизирована капля жидкости и которая имеет вместимость для хранения капли жидкости до 1000 фл (фемтолитров). Контейнерная часть выполнена как выемка по меньшей мере в одном из первого элемента и второго элемента, которые соединены друг с другом. Согласно источнику 1 из патентной литературы, ферментную реакцию проводят в капле жидкости. При такой конфигурации ферментная реакция может быть выполнена с высокой концентрацией продуктов реакции, даже если число молекул продуктов реакции весьма небольшое. Таким образом можно обнаруживать активность одной молекулы фермента.

Источник 1 из непатентной литературы раскрывает способ выполнения ферментного анализа одной молекулы путем использования матрицы, где капля жидкости покрыта маслом, порядка нескольких фемтолитров, и доступна непосредственно снаружи. Эта матрица включает шаблон гидрофильной области, выполненный из гидрофильной поверхности, на которой предусмотрена гидрофобная области, имеющая высоту 17 нм.

Источник 2 из непатентной литературы раскрывает способ обнаружения белка путем твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) одной молекулы. Согласно этому способу, очень небольшое количество белков захватывается мелкими гранулами, покрытыми антителами, специфическими к белкам, и комплексы гранул и белков помечают флуоресценцией. Затем гранулы, включающие такие комплексы, вводят в камеру реакции под действием центробежной силы. После этого подсчитывают число гранул, захвативших белки. Таким образом выполняют количественный анализ белков.

Перечень литературных источников

[Патентная литература]

[Источник 1]

Опубликованная патентная заявка Японии, Tokukai, №2004-309405 A (дата публикации: 4 ноября, 2004 г.)

[Непатентная литература]

[Источник 1]

С. Сакакихара и др. (S. Sakakihara et al.), Lab Chip, 2010, 10, 3355-3362

[Источник 2]

Дэвид М. Риссин и др. (David M Rissin et al.), Nature Biotechnology: doi: 10.1038/nbt.1641

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Для того чтобы обнаруживать, например, маркеры заболевания в низкой концентрации при раннем обнаружении заболеваний, инфекционных заболеваний и т.д., существует потребность в способах биоотслеживания, разработанных так, чтобы они имели повышенную чувствительность. Например, в случае, когда один миллион раковых клеток в опухоли, имеющей объем 1 мм³, секретируют маркерные белки (100 молекул на одну клетку) в 5 литрах крови, концентрация белков в крови составляет приблизительно 30 аМ. Необходим способ, способный обнаруживать молекулы-мишени такой очень низкой концентрации.

Возможным способом обнаружения таких молекул-мишеней может быть способ обнаружения молекул-мишеней путем вышеупомянутого одномолекулярного ферментного анализа при чувствительности на уровне одной молекулы. Более конкретно, такой способ осуществляют путем: (i) герметизации молекулы-мишени специфически в капле жидкости порядка нескольких фемтолитров (очень небольшая капля жидкости), (ii) связывания молекулы-мишени с некоторым веществом, таким как антитело, помеченное ферментом, и (iii) обнаружения активности фермента, метящего антитело вышеуказанным образом. Герметизация молекулы-мишени специфически в очень небольшой капле жидкости может быть осуществлена способом, использующим, например, гранулу, помеченную таким веществом, как еще одно антитело для специфического связывания с молекулой-мишенью. Этим способом, после того как гранула будет связана с молекулой-мишенью, гранулу герметизируют в очень небольшой капле раствора.

В этой связи, для того чтобы эффективно обнаруживать молекулы-мишени, которые содержатся в растворе только в очень небольшом количестве, например, приблизительно 30 аМ молекулы-мишени, как сказано выше, необходимо подготовить большое число матриц для очень небольших капель жидкости, приблизительно до одного миллиона, и сделать так, чтобы матрицы захватывали гранулы.

Однако согласно способу, раскрытому в источнике 2 непатентной литературы, гранулы должны вводиться в матрицу под действием большой центробежной силы, и поэтому необходимо затратить много времени и усилий. Кроме того, число матриц, используемых в способе из источника 2 непатентной литературы, составляет приблизительно пятьдесят тысяч. Поэтому способ из источника 2 непатентной литературы очень трудно применить в случае, требующем приблизительно один миллион матриц. Таким образом, в способе из источника 2 непатентной литературы трудно эффективно герметизировать большое число гранул в матрицах. В связи с этим, ни источник 1 патентной литературы, ни источник 1 непатентной литературы не раскрывают способ решения этой задачи.

Ввиду этого, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ эффективной герметизации большого числа гранул в матрице.

Решение задачи

Для того чтобы достигнуть вышеуказанной цели, способ настоящего изобретения для герметизации гранул включает: (i) этап введения гидрофильного растворителя, содержащего гранулы, в пространство между (a) частью нижнего слоя, включающей некоторое множество лунок, каждое из которых способно хранить только одну из гранул и которые отделены друг от друга боковой стенкой, имеющей гидрофобную верхнюю поверхность, и (b) частью верхнего слоя, обращенной к поверхности части нижнего слоя, на упомянутой части верхнего слоя расположены некоторое множество лунок; и (ii) этап введения гидрофобного растворителя в это пространство, причем этап (ii) выполняют после этапа (i).

Для того чтобы достигнуть вышеуказанной цели, матрица настоящего изобретения включает часть нижнего слоя, снабженную некоторым множеством лунок, отделенных друг от друга боковой стенкой, имеющей гидрофобную верхнюю поверхность, и часть верхнего слоя, обращенную, через пространство, к поверхности части нижнего слоя, на которой расположено некоторое множество лунок.

Преимущественные эффекты изобретения

Использование способа герметизации гранул настоящего изобретения дает возможность эффективно герметизировать большое число гранул в матрице, этим способствуя способу высокой чувствительности для обнаружения молекул-мишеней в низкой концентрации.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1(a)-(e) схематически показан способ герметизации гранул согласно настоящему изобретению, и приведены виды сбоку в поперечном разрезе матрицы 1.

На Фиг.2 схематически показан один вариант осуществления устройства для обнаружения молекулы-мишени согласно настоящему изобретению.

На Фиг.3 приведено флуоресцентное изображение матрицы, в которой герметизированы гранулы в одном примере настоящего изобретения.

На Фиг.4 приведен график, показывающий интенсивности флуоресценции, наблюдавшиеся при обнаружении молекул-мишеней известным способом.

На Фиг.5(a)-(f) показаны микроскопические изображения матриц, в которых герметизированы гранулы в еще одном примере настоящего изобретения.

На Фиг.6 показан график, иллюстрирующий отношение, наблюдавшееся в еще одном примере настоящего изобретения, между (i) концентрацией стрептавидина и (ii) отношением числа гранул, захваченных стрептавидином, к числу гранул, хранящихся в матрице.

На Фиг.7 приведено изображение, объясняющее способ приготовления гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла согласно одному примеру настоящего изобретения.

На Фиг.8 приведено изображение, показывающее (i) эффективность захвата гранул в случае использования матрицы, имеющей структуру проточной кюветы (пример 3), и (ii) эффективность захвата гранул в случае использования матрицы, не имеющей структуры проточной кюветы (сравнительный пример 2).

Описание вариантов осуществления

Ниже подробно описан один вариант осуществления настоящего изобретения.

[Способ герметизации гранул]

Со ссылкой на Фиг.1(a)-(e), ниже описан способ герметизации гранул согласно данному варианту осуществления. На Фиг.1(a)-(e) схематически показан способ герметизации гранул согласно настоящему изобретению, а также показаны виды сбоку в поперечном разрезе матрицы 1.

Данный вариант осуществления относится к случаю, когда гранулы 41 и 41′ герметизированы в матрице 1, включающей часть нижнего слоя 10 и часть верхнего слоя 20. Часть нижнего слоя 10 включает некоторое множество лунок 13, каждое из которых способно хранить только одну из гранул 41 и 41′ и которые отделены друг от друга боковой стенкой 12, имеющей гидрофобную верхнюю поверхность. Кроме того, часть верхнего слоя 20 обращена к поверхности части нижнего слоя 10, на которой расположены лунки 13.

Предпочтительно, гранулы имеют средний диаметр частиц от 1 мкм до 4 мкм. При этом гранулы могут быть эффективно герметизированы в матрице, и матрица может достигать высокой плотности. Отметьте, что термин "средний диаметр частиц" здесь относится к значению, полученному в результате измерения гранул посредством наблюдения под электронным микроскопом или динамического рассеяния света.

Данный вариант осуществления описывает, но без конкретного ограничения, случай использования гранул, специфически захватывающих молекулы-мишени. В данном варианте осуществления герметизируемые гранулы являются смесью гранул 41, которые еще не захватили молекулы-мишени, и гранул 41′, которые захватили молекулы-мишени.

Например, в качестве гранул, специфически захватывающих молекулы-мишени, можно использовать гранулы, связывающиеся с молекулой для специфического захвата молекулы-мишени. Молекула для специфического захвата молекулы-мишени может быть связана с группой модификации на поверхности гранулы, например, через линкер. Например, настоящее изобретение можно выполнить так, что молекула для специфического захвата молекулы-мишени будет ковалентно связана с аминогруппой на поверхности гранулы, модифицированной аминогруппой через кросслинкер, имеющий N-гидроксисукцинимид и/или др.

Термин "молекула-мишень" относится к молекуле, которая должна быть обнаружена (целевая молекула). Более конкретно, в настоящем документе термин "молекула-мишень" относится к молекуле, которая должна быть обнаружена путем захвата гранулой этой молекулы. Примеры молекул-мишеней включают (i) биомолекулы, такие как белок, нуклеиновая кислота и сахар, и (ii) сами частицы вируса.

Молекула для специфического захвата молекулы-мишени (ниже такая молекула также именуется "молекула, захватывающая мишень") может быть выбрана исходя из молекулы-мишени. Примеры молекулы, захватывающей мишень, включают белок, антитело и нуклеиновую кислоту. Предпочтительно, одна гранула связана с 100000 или больше молекул, захватывающих мишень. Например, в случае когда молекулой, захватывающей мишень, является антитело, молекула, захватывающая мишень, имеет константу диссоциации порядка нМ. Однако при вышеупомянутом выполнении можно вызвать реакцию между гранулами и молекулами-мишенями с достаточно высокой концентрацией захвата мишени (например, в случае, когда концентрация гранул составляет 8×10⁶ частиц/мл, концентрация молекул, захватывающих мишень, составляет приблизительно 1 нМ).

Способ герметизации гранул согласно данному варианту осуществления включает этап введения гранул, этап деаэрации и этап введения гидрофобного растворителя. Каждый из этих этапов будет подробно описан ниже.

(Этап введения гранул)

Ниже описан этап введения гранул со ссылкой на Фиг.1(a) и (b).

Этап введения гранул является этапом введения гидрофильного растворителя 42, содержащего гранулы 41 и 41′, в пространство 30 между частью нижнего слоя 10 и частью верхнего слоя 20. Гидрофильный растворитель 42 может быть введен в пространство 30 между частью нижнего слоя 10 и частью верхнего слоя 20 в направлении, которое параллельно поверхностям части нижнего слоя 10 и части верхнего слоя 20, причем поверхности части нижнего слоя 10 и части верхнего слоя 20 обращены друг к другу. Например, гидрофильный растворитель 42 может быть введен в пространство 30 через сквозное отверстие (не показано), выполненное по меньшей мере в одной части верхнего слоя 20 и части нижнего слоя 10.

В качестве гидрофильного растворителя 42 предпочтительно использовать, например, по меньшей мере один выбираемый из группы, состоящей из воды, гидрофильного спирта, гидрофильного эфира, кетона, нитриловых растворителей, диметилсульфоксида (DMSO) и N,N-диметилформамида (DMF), или смесь, включающую по меньшей мере один из них. Примеры гидрофильного спирта включают этанол, метанол, пропанол и глицерин. Примеры гидрофильного эфира включают тетрагидрофуран, оксид полиэтилена и 1,4-диоксан. Примеры кетона включают ацетон и метилэтилкетон. Примеры нитрильных растворителей включают ацетонитрил.

В дополнение к гранулам 41 и 41′ гидрофильный растворитель 42 может, кроме того, включать, например, вещество для специфического обнаружения молекулы-мишени, захваченной любой из гранул 41′. Таким веществом может быть, например, флуоресцентный субстрат, который высвобождает флуоресцентный материал при разложении определенным ферментом, связанным (i) с молекулой-мишенью, захваченной любой из гранул 41′, или (ii) с молекулой, специфически связанной с молекулой-мишенью. Примеры молекулы, специфически связанной с молекулой-мишенью, включают второе антитело и нуклеиновую кислоту. Примеры определенного фермента включают β-галактозидазу и пероксидазу. Примеры флуоресцентного субстрата включают флуоресцеин-ди-β-галактопиранозид (ФДГ) и Amplex красный (зарегистрированный товарный знак).

(Этап деаэрации)

Ниже описан этап деаэрации со ссылкой на Фиг.1(c).

Этап деаэрации является этапом деаэрации пространства 30 между частью нижнего слоя 10 и частью верхнего слоя 20, который осуществляют после этапа введения гранул и перед этапом введения гидрофобного растворителя. Предпочтительно, деаэрацию выполняют способом, например, выдержки матрицы 1 в неподвижном состоянии при пониженном давлении. Более конкретно, деаэрацию выполняют способом, например, выдержки матрицы 1 в неподвижном состоянии в вакуумном десикаторе при давлении приблизительно 0,1 атм в течение приблизительно 30 секунд.

Этап деаэрации не имеет существенного значения для настоящего изобретения. Однако выполнение этапа деаэрации удаляет воздух из лунок 13, чем создает возможность для эффективного введения в лунки 13 гидрофильного растворителя 42, содержащего гранулы 41 и 41′. Это позволяет эффективно герметизировать гранулы 41 и 41′ в лунках 13. Поэтому предпочтительно выполнять этап деаэрации.

(Этап введения гидрофобного растворителя)

Ниже описан этап введения гидрофобного растворителя со ссылкой на Фиг.1(d) и (e).

Этап введения гидрофобного растворителя является этапом введения гидрофобного растворителя 43 в пространство 30 между частью нижнего слоя 10 и частью верхнего слоя 20. Этап введения гидрофобного растворителя выполняют после этапа введения гранул и, предпочтительно, после этапа деаэрации.

Гидрофобный растворитель 43 должен быть только растворителем, который трудно смешать с гидрофильным растворителем 42, используемым на этапе введения гранул. В качестве гидрофобного растворителя 43 предпочтительно использовать, например, по меньшей мере один выбираемый из группы, состоящей из насыщенного углеводорода, ненасыщенного углеводорода, ароматического углеводорода, силиконового масла, перфторуглерода, галогенных растворителей и гидрофобной ионной жидкости или смеси, включающей по меньшей мере одно из них. Примеры насыщенного углеводорода включают алкан и циклоалкан. Примеры алкана включают декан и гексадекан. Примеры ненасыщенного углеводорода включают сквален. Примеры ароматического углеводорода включают бензол и толуол. Примеры перфторуглерода включают Fluorinert (зарегистрированный товарный знак) FC40 (от компании SIGMA). Примеры галогенных растворителей включают хлороформ, метиленхлорид и хлорбензол. Гидрофобная ионная жидкость обозначает ионную жидкость, которая не диссоциирует по меньшей мере в воде. Примеры такой ионной жидкости включают 1-бутил-3-метилимидазолингексафторфосфат. Ионная жидкость обозначает соль, которая имеет форму жидкости при комнатной температуре.

Выполнение этапа введения гидрофобного растворителя позволяет эффективно формировать в соответствующих гнездах 13 капли (капли жидкости), покрытые гидрофобным растворителем 43. Также выполнение этапа введения гидрофобного растворителя дает возможность эффективно герметизировать гранулы 41 и 41′ в каплях, так что любая одна из гранул 41 и 41′ будет храниться в каждой из капель.

Согласно данному варианту осуществления, гранулы 41 и 41′ вводят через пространство 30 между частью нижнего слоя 10 и частью верхнего слоя 20, этим осуществляя высокоэффективную герметизацию любой одной из гранул в каждой из большого числа лунок 13, которые расположены на большой площади (например, 1 см² или больше).

Данный вариант осуществления позволяет создать матрицу капель большой площади, включающую большое число лунок. Например, даже при матрице, включающей один миллион или больше лунок, можно эффективно герметизировать гранулы 41 и 41′ в лунках, так что любая одна из гранул 41 и 41′ будет храниться в каждой из лунок. Таким образом, в данном варианте осуществления можно обнаруживать молекулы-мишени с высокой чувствительностью, что позволяет обнаруживать молекулы-мишени в очень низкой концентрации, такой как, приблизительно, 0,1 аМ.

[Способ обнаружения молекулы-мишени]

Далее, ниже описан способ обнаружения молекулы-мишени согласно данному варианту осуществления.

Способ обнаружения молекулы-мишени согласно данному варианту осуществления включает этап реакции, этап герметизации гранул и этап определения.

В данном варианте осуществления в качестве гранул используются гранулы, которые специфически захватывают молекулы-мишени. Например, каждая из таких гранул может быть гранулой, связанной с молекулой для специфического захвата молекулы-мишени. Для использования в качестве гранул, молекулы-мишени и молекулы для специфического захвата молекулы-мишени подходит любая из указанных в качестве примеров в описании способа герметизации гранул данного варианта осуществления.

Этап реакции является этапом, на котором гранулы реагируют с молекулами-мишенями. Например, реакция между гранулами и молекулами-мишенями может быть выполнена путем смешивания раствора, содержащего гранулы, с раствором, содержащим молекулы-мишени.

Этап герметизации гранул является этапом выполнения вышеупомянутого способа герметизации гранул путем использования гранул, которые прореагировали с молекулами-мишенями на этапе реакции. А именно, этап герметизации гранул является (i) этапом, включающим этап введения гранул и этап введения гидрофобного растворителя, или (ii) этапом, включающим этап введения гранул, этап деаэрации и этап введения гидрофобного растворителя. Отметьте, что описания этапа введения гранул, этапа деаэрации и этапа введения гидрофобного растворителя здесь опущены, поскольку эти этапы могут быть осуществлены таким же образом, как описанные в вышеприведенном разделе "Способ герметизации гранул".

Этап определения является этапом определения после этапа герметизации гранул, каждая ли из лунок 13 содержит любую одну из гранул 41′, захвативших молекулы-мишени.

Подходящие примеры способа определения, каждая ли из лунок 13 содержит любую одну из гранул 41′, захвативших молекулы-мишени, включают известные реакции распознавания молекул, такие как реакция антиген-антитело, реакция стрептавидин-биотин и комплементарное связывание нуклеиновых кислот. Например, этот способ может быть способом обнаружения флуоресцентного материала, высвобожденного флуоресцентным субстратом при разложении определенным ферментом, связанным с (i) молекулой-мишенью или (ii) молекулой, специфически связанной с молекулой-мишенью. Обнаружение флуоресцентного материала осуществляют, например, способом определения интенсивности флуоресцентности каждой лунки путем использования, например, флуоресцентного микроскопа или датчика изображения.

На этапе определения предпочтительно также определить, каждая ли из лунок 13 содержит любую одну из гранул 41 или любую одну из гранул 41′. Определение того, каждая ли из лунок 13 содержит любую одну из гранул 41 или любую одну из гранул 41′, может быть выполнено, например, путем наблюдения под микроскопом, чтобы определить присутствие или отсутствие любой одной из гранул 41 или любой одной из гранул 41′ в каждой из лунок 13. Альтернативно, определение присутствия или отсутствия любой одной из гранул 41 или любой одной из гранул 41′ в каждой из лунок 13 может быть выполнено способом обнаружения рассеянного света от гранулы или способом измерения электрического потенциала с помощью полевого транзистора (ПТ).

После этапа определения, основанного на (i) числе лунок 13, содержащих гранулы 41 или гранулы 41′, и (ii) числе лунок 13, содержащих гранулы 41′, захватившие молекулы-мишени, можно вычислить отношение числа гранул, захвативших молекулы-мишени, к общему числу гранул. Таким образом можно количественно определить концентрацию молекул-мишеней.

Согласно данному варианту осуществления, можно предусмотреть матрицу для капель большой площади, включающую большое число лунок; кроме того, даже с матрицей, включающей один миллион и больше лунок, можно эффективно герметизировать гранулы 41 и 41′ в лунках. Таким образом, при данном варианте осуществления можно обнаруживать молекулы-мишени с высокой чувствительностью, что позволяет обнаруживать молекулы-мишени очень низкой концентрации, такой как, приблизительно, 0,1 аМ.

[Матрица]

Далее, ниже описана конфигурация матрицы 1 данного варианта осуществления со ссылкой на Фиг.1(a). Матрица 1 может быть матрицей, используемой в способе герметизации гранул согласно данному варианту осуществления, или может быть матрицей, используемой в способе обнаружения молекулы-мишени согласно данному варианту осуществления.

Матрица 1 включает часть нижнего слоя 10 и часть верхнего слоя 20.

Часть нижнего слоя 10 включает пластинчатый элемент 11 и боковую стенку 12, имеющую гидрофобную верхнюю поверхность. Часть нижнего слоя 10 включает некоторое множество лунок 13, которые отделены друг от друга боковой стенкой 12.

Предпочтительно, пластинчатый элемент 11 имеет гидрофильную поверхность. Термин "гидрофильная поверхность" относится к поверхности, аффинность которой с гидрофильным растворителем выше, чем с гидрофобным растворителем. Пластинчатый элемент 11 необходимо изготавливать только из твердого материала. Например, пластинчатый элемент 11 может быть изготовлен из стекла, кремния или полимерной смолы.

Боковая стенка 12 имеет конструкцию, которая расположена на поверхности пластинчатого элемента 11, предпочтительно на гидрофильной поверхности пластинчатого элемента 11, и выполнена так, чтобы разделять некоторое множество лунок 13 друг от друга. Боковая стенка 12 имеет гидрофобную верхнюю поверхность. Здесь термин "гидрофобная" используется как синоним к термину "липофильная" и обозначает свойство, аффинность которого с гидрофобным растворителем выше, чем с гидрофильным растворителем.

Отметьте, что боковая стенка 12 должна быть выполнена так, чтобы ее верхняя поверхность, т.е. ее поверхность, обращенная к верхнему слою 20, являлась гидрофобной. В то же время, боковая поверхность боковой стенки 12, т.е. внутренней стенки каждой из лунок 13, может быть или гидрофобной, или гидрофильной.

Например, боковая стенка 12 может быть выполнена из гидрофильной конструкции и гидрофобного слоя, который выполнен на верхней поверхности гидрофильной конструкции. Гидрофильная конструкция может быть изготовлена, например, из стекла, кремния или полимерной смолы. Гидрофобный слой может быть изготовлен, например, из водоотталкивающей смолы или фторуглеродной полимерной смолы. Примеры фторуглеродной полимерной смолы включают аморфную фторуглеродную смолу. Аморфную фторуглеродную смолу использовать предпочтительнее, поскольку аморфная фторуглеродная смола имеет высокое гидрофобное свойство и низкую токсичность для биологической пробы.

Предпочтительные примеры аморфной фторуглеродной смолы включают, по меньшей мере, смолу, выбираемую из CYTOP (зарегистрированный товарный знак), TEFLON (зарегистрированный товарный знак) AF2400 и TEFLON (зарегистрированный товарный знак) AF1600. Среди них наиболее предпочтительным является CYTOP (зарегистрированный товарный знак), поскольку она легче поддается изготовлению микроскопических структур.

Альтернативно, боковая стенка 12 может быть изготовлена из гидрофобного материала. Например, боковая стенка 12 может быть изготовлена из фторуглеродной полимерной смолы или параксиленовой полимерной смолы. Примеры фторуглеродной полимерной смолы включают аморфную фторуглеродную смолу. В качестве аморфной фторуглеродной смолы предпочтительно использовать любую из вышеназванных смол.

Боковая стенка 12 только должна иметь такую конфигурацию, чтобы некоторое множество лунок 13 было размещено на пластинчатом элементе 11. Например, боковая стенка 12 может быть пластинчатой структурой, частями которой, соответствующими лункам 13, являются отверстия.

Высота (т.е. толщина в вертикальном направлении) боковой стенки 12, измеренная от поверхности пластинчатого элемента 11, должна быть выполнена только так, чтобы ни одна из гранул 41 и 41′, содержащихся в одной из лунок 13, не могла выйти из них во время описанного ниже этапа введения гидрофобного растворителя. Например, высота боковой стенки 12 может быть рассчитана так, чтобы большая часть одной из гранул 41 и 41′, предпочтительно вся гранула, содержащаяся в одной из лунок 13, была расположена ниже верхней поверхности боковой стенки 12.

Для того чтобы эффективно хранить гранулы 41 и 41′ в лунках 13, высота боковой стенки 12 предпочтительно равна или больше, чем средний диаметр частиц гранул 41 и 41′. Кроме того, для того чтобы любая одна из гранул 41 и 41′ хранилась в одной из лунок 13, высота боковой стенки 12 предпочтительно равна среднему диаметру частиц гранул 41 и 41′ или меньше его в 1,5 раза.

Каждое из некоторого множества лунок 13 является выемкой, способной хранить только одну гранулу 41 и 41′, и некоторое множество лунок 13 отделены друг от друга боковой стенкой 12. Каждая из лунок 13 имеет нижнюю поверхность, которая является частью поверхности пластинчатого элемента 11, и эта нижняя поверхность является гидрофильной.

Лунки 13 могут иметь любую форму или размер, если такая форма или размер позволяет каждой из лунок 13 хранить только одну из гранул 41 и 41′. Область, ограниченная нижней поверхностью и боковой поверхностью каждой из лунок 13, может иметь форму, например, круглого цилиндра или прямоугольной колонки.

Ширина "A" каждой из лунок 13 в горизонтальном направлении (например, в случае, когда поперечное сечение каждого приемного гнезда 13, если смотреть в горизонтальном направлении, имеет форму круга, где ширина "A" является диаметром этого круга; в случае, когда поперечное сечение каждого приемного гнезда 13, если смотреть в горизонтальном направлении, имеет форму квадрата, ширина "A" является длиной одной стороны квадрата) должна только быть больше, чем средний диаметр частиц гранул 41 и 41′. Предпочтительно, ширина "A", например, в 1,5-2 раза больше, чем средний диаметр частиц гранул 41 и 41′. В данном варианте осуществления каждая из лунок 13 имеет глубину, равную высоте боковой стенки 12. Для того чтобы эффективно хранить гранулы в лунках, глубина каждой из лунок настоящего изобретения предпочтительно равна среднему диаметру частиц гранул или больше его. Кроме того, для того чтобы хранить только одну из гранул в одной из лунок, глубина каждой из лунок настоящего изобретения предпочтительно равна среднему диаметру частиц гранул или в 1,5 раза меньше его.

Согласно данному варианту осуществления, каждая из лунок 13 имеет гидрофильную нижнюю поверхность, и боковая стенка 12 имеет гидрофобную верхнюю поверхность. Это дает возможность эффективно вводить гидрофильный растворитель 42, содержащий гранулы 41 и 41′, в лунки 13 на описанном ниже этапе введения гранул и не давать гидрофобному растворителю 43 попадать в лунки 13 на описанном ниже этапе введения гидрофобного растворителя. При этом лунки 13, хранящие капли жидкости, содержащие гранулы 41 и 41′, могут быть герметично закрыты гидрофобным растворителем эффективным образом.

Часть верхнего слоя 20 включает пластинчатый элемент 21 и гидрофобный слой 22. Гидрофобный слой 22 расположен на той поверхности пластинчатого элемента 21, которая обращена к части нижнего слоя 10. Пластинчатый элемент 21 выполнен из, например, стекла, кремния или полимерной смолы. Гидрофобный слой 22 выполнен из, например, водоотталкивающей смолы или фторуглеродной полимерной смолы. Примеры фторуглеродной полимерной смолы включают аморфную фторуглеродную смолу.

Часть верхнего слоя 20 обращена через пространство 30 к поверхности части нижнего слоя 10, на которой расположены лунки 13. А именно, пространство 30 расположено между боковой стенкой 12 и гидрофобным слоем 22. Пространство 30 служит в качестве пути для потока. Таким образом, матрица 1 выполнена в такой форме, чтобы иметь конструкцию проточной кюветы.

Пространство 30 может быть использовано как путь для потока текучей среды между частью нижнего слоя 10 и частью верхнего слоя 20 в направлении, параллельном поверхностям части нижнего слоя 10 и части верхнего слоя 20, причем поверхности части нижнего слоя 10 и части верхнего слоя 20 обращены друг к другу.

Расстояние между (i) верхней поверхностью боковой стенки 12 и (ii) гидрофобным слоем 22 пластинчатого элемента 21, т.е. ширина пространства 30 в вертикальном направлении, должно быть больше, чем средний диаметр частиц гранул 41 и 41′, и составляет, предпочтительно, от 10 мкм до 150 мкм.

Часть нижнего слоя 10 или часть верхнего слоя 20 может быть снабжена сквозным отверстием (не показано), через которое текучую среду вводят в пространство 30. Например, часть нижнего слоя 10 может иметь область с лунками 13 и область без лунок 13. Кроме того, часть нижнего слоя 10 может иметь сквозное отверстие в области без лунок 13; альтернативно, часть верхнего слоя 20 может иметь сквозное отверстие в области, обращенной к области части нижнего слоя 10 без лунок 13.

Согласно данному варианту осуществления, верхняя сторона пространства 30 соответствует поверхности гидрофобного слоя 22, и нижняя сторона пространства 30 соответствует верхней поверхности боковой стенки 12 и лункам 13. Таким образом, за исключением частей пространства 30, соответствующих нижним поверхностям лунок 13, все пространство 30 имеет гидрофобное свойство. Эта конфигурация дает возможность эффективно вводить гидрофильный растворитель 42, содержащий гранулы 41 и 41′, в лунки 13 на описанном ниже этапе введения гранул. Кроме того, эта конфигурация не дает гидрофобному растворителю 43 попадать в лунки 13 на описанном ниже этапе введения гидрофобного растворителя. Таким образом, путем введения гидрофобного растворителя 43 в пространство 30 можно эффективно сформировать в каждой из лунок 13 каплю, в которой герметизируют любую одну из гранул 41 и 41′.

Матрица 1 данного варианта осуществления может быть, например, матрицей, включающей один миллион или больше лунок. Даже при матрице, имеющей такую большую площадь, использование способа герметизации гранул данного варианта осуществления или способа обнаружения молекулы-мишени данного варианта осуществления дает возможность эффективно герметизировать гранулы в лунках, чтобы любая одна из гранул хранилась в каждой из лунок. Таким образом, согласно данному варианту осуществления можно обнаруживать молекулы-мишени с высокой чувствительностью, что позволяет получить матрицу, позволяющую обнаруживать молекулы-мишени в очень низкой концентрации, такой как, приблизительно, 0,1 аМ.

[Набор]

Далее, ниже описана конфигурация набора согласно данному варианту осуществления.

Набор данного варианта осуществления включает по меньшей мере матрицу 1 и гранулы 41. Предпочтительно, в качестве матрицы 1 используется матрица 1, имеющая вышеизложенную конфигурацию. Каждая из лунок 13 в матрице 1 выполнена так, чтобы быть способной хранить только одну из гранул 41, включенных в этот набор.

Каждая из гранул 41, включенных в этот набор, может быть гранулой, специфически захватывающей молекулу-мишень. Например, каждая из гранул 41, включенных в этот набор, может быть гранулой, связанной с молекулой для специфического связывания с молекулой-мишенью. В качестве молекулы-мишени и молекулы для специфического связывания с молекулой-мишенью могут быть использованы любые из описанных выше.

Этот набор может, кроме того, включать вещество для специфического обнаружения молекулы-мишени. Предпочтительно, в качестве вещества для специфического обнаружения молекулы-мишени можно использовать любое из указанных выше. Кроме того, набор может, кроме того, включать, например, водорастворимый растворитель и/или гидрофобный растворитель.

[Устройство для обнаружения молекулы-мишени]

Далее, ниже описано устройство 50 для обнаружения молекулы-мишени данного варианта осуществления со ссылкой на Фиг.2. На Фиг.2 схематически показан один вариант осуществления устройства для обнаружения молекулы-мишени согласно настоящему изобретению.

Устройство 50 для обнаружения молекулы-мишени данного варианта осуществления включает матрицу 1, датчик изображения 51 и источник света 52. Предпочтительно, в качестве матрицы 1 можно использовать матрицу, имеющую вышеописанную конфигурацию, и поэтому объяснение матрицы 1 здесь не приводится.

Датчик изображения 51 является датчиком для обнаружения света, излучаемого каждой из лунок 13, когда гранулы, захватившие молекулы-мишени, хранятся в лунках 13. Например, датчик изображения 51 может быть датчиком для обнаружения флуоресценции, излучаемой флуоресцентным субстратом при разложении его определенным ферментом, связанным с (i) молекулой-мишенью или (ii) молекулой, специфически связанной с молекулой-мишенью. В качестве датчика изображения 51 можно использовать, например, датчик изображения КМОП.

Источником света 52 является источник света для излучения света на матрицу 1. На Фиг.2 источник света 52 расположен над матрицей 1. Однако настоящее изобретение этим конкретно не ограничено. Альтернативно, источником света 52 может быть источник, излучающий свет, например, на боковую сторону матрицы 1.

Между матрицей 1 и датчиком изображения 51 может быть расположен, например, интерференционный светофильтр и/или световодная матрица. Кроме того, между источником света 52 и матрицей 1 может быть расположен, например, фильтр возбуждения.

Согласно данному варианту осуществления, матрица 1 и датчик изображения 51 непосредственно соединены друг с другом. Это дает возможность легко определять без использования другого устройства, такого как микроскоп, хранится ли или нет любая одна из гранул, захвативших молекулы-мишени, в каждой из лунок 13. Это позволяет легко и с высокой скоростью обнаруживать, хранится ли или нет любая одна из гранул, захвативших молекулы-мишени, в каждой из лунок 13, и предложить устройство для обнаружения молекулы-мишени по приемлемой цене.

Настоящая заявка охватывает следующие изобретения.

Способ герметизации гранул настоящего изобретения включает:

(i) этап введения гидрофильного растворителя, содержащего гранулы, в пространство между (a) частью нижнего слоя, включающей некоторое множество лунок, каждое из которых способно хранить только одну гранулу и которые отделены друг от друга боковой стенкой, имеющей гидрофобную верхнюю поверхность, и (b) частью верхнего слоя, обращенной к поверхности части нижнего слоя, на которой расположены некоторое множество лунок; и (ii) этап введения гидрофобного растворителя в это пространство, причем этап (ii) выполняют после этапа (i).

Предпочтительно, способ герметизации гранул настоящего изобретения, кроме того, включает (iii) этап деаэрации этого пространства, причем этап (iii) выполняют после этапа (i) и перед этапом (ii).

Предпочтительно, согласно способу герметизации гранул настоящего изобретения, гидрофильным растворителем является по меньшей мере один выбираемый из группы, состоящей из воды, гидрофильного спирта, гидрофильного эфира, кетона, нитрильных растворителей, диметилсульфоксида и N,N-диметилформамида, или является смесь, включающая по меньшей мере один вышеуказанный растворитель.

Предпочтительно, согласно способу герметизации гранул настоящего изобретения, гидрофобным растворителем является по меньшей мере один выбираемый из группы, состоящей из насыщенного углеводорода, ненасыщенного углеводорода, ароматического углеводорода, силиконового масла, перфторуглерода, галогенных растворителей и гидрофобной ионной жидкости, или является смесь, включающая по меньшей мере одно вышеупомянутое вещество.

Для того чтобы достигнуть вышеуказанную цель, способ обнаружения молекулы-мишени настоящего изобретения включает: (i) этап реакции гранул, специфически захватывающих молекулы-мишени, с молекулами-мишенями; (ii) этап выполнения с использованием гранул любого из вышеупомянутых способов герметизации гранул, причем этап (ii) выполняют после этапа (i); и (iii) этап определения, хранится ли любая одна из гранул, захвативших молекулы-мишени, в каждом из некоторого множества лунок, причем этап (iii) выполняют после этапа (ii).

Предпочтительно, согласно способу обнаружения молекулы-мишени настоящего изобретения, гранулы являются такими гранулами, с которыми связываются молекулы, имеющие способность специфически связываться с молекулами-мишенями.

Матрица настоящего изобретения включает: часть нижнего слоя, снабженную некоторым множеством лунок, отделенных друг от друга боковой стенкой, имеющей гидрофобную верхнюю поверхность; и часть верхнего слоя, обращенную через некоторое пространство к поверхности части нижнего слоя, на которой расположены некоторое множество лунок.

Предпочтительно, согласно матрице настоящего изобретения, каждое из некоторого множества лунок имеет гидрофильную нижнюю поверхность.

Предпочтительно, согласно матрице настоящего изобретения, часть верхнего слоя имеет гидрофобную поверхность, обращенную к части нижнего слоя.

Предпочтительно, согласно матрице настоящего изобретения, по меньшей мере одна из части верхнего слоя и части нижнего слоя имеет сквозное отверстие, через которое текучую среду вводят в упомянутое пространство.

Для того чтобы достигнуть вышеуказанной цели, набор настоящего изобретения включает: любую из вышеупомянутых матриц и гранулы, причем каждое из некоторого множества лунок способно хранить только одну гранулу.

Для того чтобы достигнуть вышеуказанной цели, устройство для обнаружения молекулы-мишени настоящего изобретения включает: любую одну из вышеупомянутых матриц и датчик изображения для обнаружения света, излучаемого каждым из некоторого множества лунок в том случае, если гранулы, захватившие молекулы-мишени, хранятся в этом некотором множестве лунок.

Настоящее изобретение не ограничено вышеприведенным описанием вариантов осуществления и может быть изменено специалистом в пределах объема формулы изобретения. Варианты осуществления настоящего изобретения, кроме того, описаны подробно посредством следующих Примеров. Само собой разумеется, что настоящее изобретение не ограничено этими Примерами. При этом понимается, что описанное таким образом изобретение также может быть изменено многими способами.

[Примеры]

Ниже будут описаны материалы и способы, которые использованы в Примерах.

(Материалы)

В Примерах в качестве молекулы-мишени использован стрептавидин (купленный у компании SIGMA), помеченный β-галактозидазой (ниже также именуется просто "стрептавидин"). Кроме того, в качестве гранул использованы обработанные биотином гранулы, подготовленные путем обработки биотином аминогранул, имеющих средний диаметр частиц 3 мкм (материал: полистирол; микромер-NH₂ - 3 мкм, купленный у компании Micromod).

(Приготовление обработанных биотином гранул)

По следующему способу аминогруппы аминогранул реагировали с NHS-PEO4-биотином, чтобы обработать последним аминогранулы.

Во-первых, 750 мкл буфера А (100 мМ буфера фосфорной кислоты, pH 8,0) добавили к 250 мкл аминогранул.

Далее, полученную смесь подвергли центрифугированию при 10000 об/мин при 4°C в течение 10 минут, чтобы получить аминогранулы, собравшиеся вместе. Затем аминогранулы суспендировали в 500 мкл буфера А (суспензия А). После этого 50 мкл NHS-PEO4-биотина (2 мкг/50 мкл DMSO) добавили к суспензии А, и затем аминогранулы и NНS-PEO4-биотин реагировали при слабом перемешивании при 25°C в течение по меньшей мере 3 часов (для перемешивания пробирку вращали вертикально).

Далее, обработанные биотином гранулы, полученные таким образом, промыли. Смесь подвергли центрифугированию при 10000 об/мин при 4°C в течение 10 минут, чтобы получить обработанные биотином гранулы, собравшиеся вместе. Затем из них удалили водную фазу с помощью пипетки Pipetman. К полученному осадку гранул, обработанных биотином, добавили 1 мл буфера А, чтобы суспендировать осадок гранул, обработанных биотином. Этот процесс повторили шесть раз, чтобы удалить непрореагировавший NHS-PEO4-биотин. Затем полученный продукт суспендировали в 500 мкл буфера А (суспензия B). Суспензию B хранили при 4°C.

Далее измерили концентрацию обработанных биотином гранул в суспензии B. Число обработанных биотином гранул в определенном объеме подсчитывали с помощью гемацитометра, чтобы определить концентрацию обработанных биотином гранул (приблизительно 3,0×10⁸ гранул/мл). Для облегчения подсчета числа обработанных биотином гранул подсчет проводили после разбавления суспензии В буфером А приблизительно в 5 раз.

Обработанные биотином гранулы были получены вышеизложенным способом.

(Захват стрептавидина)

Далее, следующим способом захватывали стрептавидин, используя обработанные биотином гранулы.

Во-первых, обработанные биотином гранулы разбавили (8×10⁶ гранул/500 мкл). Кроме того, стрептавидин, помеченный β-галактозидазой, разбавили буфером B (100 мМ буфера фосфорной кислоты, pH 8,0, с содержанием 0,1% TWEEN20 (детергент)), чтобы концентрация стрептавидина стала в два раза выше, чем целевая концентрация (совокупное количество: 500 мкл).

Затем, 500 мкл обработанных биотином гранул и 500 мкл стрептавидина, разбавленного таким образом, смешали вместе в пробирке (совокупное количество: 1 мл). Пробирку осторожно встряхивали вертикально, реакцию между обработанными биотином гранулами и стрептавидином проводили при 25°C в течение 30 минут.

Далее, полученный продукт подвергли центрифугированию при 10000 об/мин при 4°C в течение 10 минут, чтобы получить собравшиеся вместе гранулы после реакции (смесь (i) комплексов стрептавидина и обработанных биотином гранул и (ii) непрореагировавших обработанных биотином гранул). Затем, из них удалили водную фазу с помощью пипетки Pipetman. К полученному осадку гранул добавили 1 мл буфера A и суспендировали. Этот процесс повторили четыре раза для промывки, чтобы удалить непрореагировавшие молекулы-мишени.

Далее, к осадку гранул после промывки добавили 15 мкл буфера C (100 мМ буфера фосфорной кислоты, pH 7,5, 1 мМ MgCl₂) для суспендирования. Конечная концентрация гранул составила, приблизительно, 6.5×10⁶ гранул/15 мкл буфера C.

(Получение матрицы)

Далее, с использованием следующего способа была получена матрица, имеющая такую же структуру проточной кюветы, как и матрица 1, показанная на Фиг.1(a)-(e). В последующем описании элементы, имеющие такие же функции, как в матрице 1, имеют одинаковые ссылочные обозначения.

Во-первых, были подготовлены гидрофильно-гидрофобное рельефное стекло (часть нижнего слоя 10) и стекло верхней части (часть верхнего слоя 20) (высота: 24 мм × ширина: 26 мм × глубина: 5 мм, SiO₂, со сквозным отверстием, имеющим диаметр 1 мм).

(Подготовка гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла)

Со ссылкой на Фиг.7, ниже описан специфический способ подготовки гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла. На Фиг.7 показан способ подготовки гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла согласно одному примеру настоящего изобретения.

Согласно данному варианту осуществления, для получения гидрофильно-гидрофобного рельефа на стекле использовали фотолитографию и сухое травление. Для того чтобы получить гидрофильно-гидрофобный рельеф, были выполнены три этапа, включая этап нанесения CYTOP (зарегистрированный товарный знак), этап фотолитографии и этап травления и удаления резиста.

На этапе нанесения CYTOP (зарегистрированный товарный знак) сначала CYTOP (зарегистрированный товарный знак) CTL-809 (наименование продукта, доступного от компании ASAHI GLASS) нанесли на стекло высотой 24 мм и шириной 32 мм (наименование продукта: NEO MICRO COVER GLASS Толщина №1; доступен от компании MATSUNAMI) (пластинчатый элемент 11), чтобы сформировать слой 61 гидрофобной смолы.

Далее, на этапе фотолитографии положительный фоторезист 62 (наименование продукта: AZ-4903; доступен от компании AZ Electronic Materials, США) нанесли на слой 61 гидрофобной смолы. Далее посредством фотошаблона 63, имеющего желательную форму, полученный продукт подвергли действию УФ-излучения сверху, чтобы осуществить процесс щелочного развития. В результате этого процесса фоторезист 62 растворили только на частях, облучаемых УФ-излучением, чтобы открыть те части слоя гидрофобной смолы, которые обращены к частям фоторезиста 62, облучаемого УФ-излучением.

После этого на этапе травления и удаления резиста стекло протравили плазмой O₂ через частично растворенный фоторезист 62′, чтобы удалить части слоя 61 смолы. В результате была получена гидрофобная боковая стенка 12. В заключение, фоторезист 62′ растворили органическим растворителем. Таким образом, был получен гидрофильно-гидрофобный рельеф.

Другие подробные процедуры вышеуказанного процесса описаны ниже. Ссылочные номера (1)-(23) на Фиг.7 соответствуют обозначениям (1)-(23) ниже, соответственно.

<Этап нанесения CYTOP (зарегистрированный товарный знак) (т.е. подготовка слоя CYTOP (зарегистрированный товарный знак), имеющего толщину пленки приблизительно от 3,3 мкм до 3.5 мкм, путем выполнения следующих операций)>

(1) Во-первых, стекло (пластинчатый элемент 11) промыли и CYTOP (зарегистрированный товарный знак) CTL-809 нанесли на стекло.

(2) Далее, стекло погрузили в 10Н раствор KOH на ночь.

(3) Покрывное стекло, погруженное в KОН, промыли деионизированной водой десять и более раз.

(4) Стекло высушили с помощью горячей пластины при 180°C.

(5) Высушенное таким образом стекло охладили до комнатной температуры.

(6) Приблизительно 70 мкл CYTOP (зарегистрированный товарный знак) CTL-809 налили на стекло.

(7) Выполнили покрытие центрифугированием согласно следующей программе A:

[Программа A]

Наклон: 5 секунд

500 об/мин: 10 секунд

Наклон: 5 секунд

2000 об/мин: 30 секунд

Наклон: 5 секунд

Конец

(8) Стекло запекали на горячей пластине при 180°C в течение часа.

В результате повторения вышеуказанных операций (6)-(8) четыре раза был получен слой 61 гидрофобной смолы, имеющий глубину от 3,3 мкм до 3,5 мкм.

<Этап фотолитографии>

Далее была выполнена фотолитография.

(9) На слой смолы 61, подготовленный на этапе нанесения CYTOP (зарегистрированный товарный знак), налили положительный фоторезист 62 (AZ-4903) в таком количестве, чтобы положительный фоторезист 62 распространился по стеклу в диаметре приблизительно 8 мм.

(10) Выполнили покрытие центрифугированием согласно следующей программе B:

[Программа B]

Наклон: 5 секунд

500 об/мин: 10 секунд

Наклон: 5 секунд

4000 об/мин: 60 секунд

Наклон: 5 секунд

Конец

(11) Фоторезист, оставшийся на крае стекла, вытерли куском марли, смоченным в 100% EtOH.

(12) Стекло спекали при 55°C в течение 3 минут.

(13) Стекло спекали при 110°C в течение 5 минут.

(14) Фотошаблон 63 промыли ацетоном и фотошаблон 63 поместили в установку фотолитографии (доступную от компании SAN-EI ELECTORIC).

(15) Стекло с нанесенным фоторезистом 62 поместили на стол для образцов установки фотолитографии, стол подняли, чтобы ввести стекло и фотошаблон 63 в контакт друг с другом.

(16) Стекло, введенное таким образом в контакт с фотошаблоном 63, облучали УФ-излучением в течение 35 секунд (мощность: 256).

(17) Стекло погрузили в проявитель AZ Developer (доступен от компании AZ Electronic Materials, США) на 5 минут или больше для проявки.

(18) Стекло промывали MilliQ (дистиллированная вода) в течение приблизительно 10 минут.

<Этап травления и удаления резиста>

Затем были выполнены травление и удаление резиста.

(19) Стекло подвергнули травлению плазмой O₂ с использованием устройства RIE-10NR (доступно от компании Samco) при определенных условиях (O₂: 50 см³/с, давление: 10 Па, мощность: 50 Вт, время: 30 мин).

(20) Подвергнутое травлению стекло погрузили в ацетон и затем на него воздействовали ультразвуком в течение 15 минут.

(21) Ацетон заменили свежим и на стекло снова воздействовали ультразвуком в течение 15 минут.

(22) На стекло воздействовали ультразвуком в EtOH в течение 15 минут.

(23) Стекло промыли MilliQ (дистиллированная вода).

После выполнения вышеописанного способа на стекле сформировали некоторое множество лунок (лунок 13). Область, окруженная нижней поверхностью и боковой поверхностью каждой из лунок, имела форму круглого цилиндра. Поперечное сечение каждой лунки в горизонтальном направлении имело форму круга с диаметром 5 мкм. Высота боковой стенки, которая разделяет ячейки, составляла, приблизительно, от 3,3 мкм до 3,5 мкм. Кроме того, расстояние "В", на которое две смежные лунки отделены друг от друга, составляло 5 мкм.

(Верхнее стекло)

Верхнее стекло подготовили следующим способом. Для того чтобы подготовить верхнее стекло, использовали стекло толщиной 5 мм со сквозным отверстием диаметром 1 мм. Одну сторону стекла покрыли приблизительно 70 мкл CYTOP (зарегистрированный товарный знак) CTL-809 (наименование продукта, доступного от компании ASAHI GLASS). Затем выполнили центрифугирование по следующей программе C:

[Программа C]

Наклон: 5 секунд

500 об/мин: 10 секунд

Наклон: 5 секунд

2000 об/мин: 30 секунд

Наклон: 5 секунд

Конец

Затем стекло отожгли на горячей пластине при 180°C в течение часа.

Вышеописанным способом подготовили верхнее стекло, одна сторона которого снабжена гидрофобным слоем толщиной 1 мкм.

(Соединение гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла и верхнего стекла)

Далее, смазку для высокого вакуума (доступную от компании DOW CORNING TORAY) нанесли на бумажную подложку Parafilm (доступную от компании Peckiney Plastic Packaging) и затем кусок бумажной подложки Parafilm прикрепили на часть гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла, причем эта часть располагается на стороне, на которой выполнен гидрофильно-гидрофобный рельеф, и часть, не имеющую гидрофильно-гидрофобного рельефа. Верхнее стекло соединили с той стороной гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла, на которой выполнен гидрофильно-гидрофобный рельеф, чтобы сторона с покрытием верхнего стекла была обращена к гидрофильно-гидрофобному рельефному стеклу.

Следовательно, между гидрофильно-гидрофобным рельефным стеклом и верхним стеклом было образовано пространство. Ширина этого пространства в вертикальном направлении, т.е. расстояние между (i) верхней поверхностью боковой стенки гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла и (ii) верхним стеклом, составила приблизительно 150 мкм.

(Герметизация гранул в каплях)

Далее, гранулы, прореагировавшие со стрептавидином, герметизировали в каплях следующим способом.

Во-первых, 50 мМ флуоресцеин-ди-β-галактопиранозида (ФДГ) (доступного от компании Marker Gene Technology)/DMSO разбавили буфером ФДГ (100 мМ буфера KPi (pH=7,5), 1 мМ MgCl₂, 4 мкл/мл 2-меркаптетанола), чтобы приготовить 4 мМ раствор ФДГ. Затем, 15 мкл гранул (6,5×10⁶ гранул/15 мкл буфера C) и 15 мкл 4 мМ раствора ФДГ смешали вместе, чтобы приготовить раствор с гранулами.

Далее, 30 мкл раствора с гранулами загрузили в путь потока с помощью желтого наконечника через сквозное отверстие в верхнем стекле (смотрите Фиг.1(a) и (b)).

Далее, для того чтобы удалить воздух из лунок, выполнили деаэрацию в течение одной минуты (смотрите Фиг.1(c)). Деаэрацию выполнили так, чтобы матрица находилась в спокойном состоянии в вакуумном десикаторе при давлении приблизительно 0,1 атм в течение приблизительно 30 секунд. После этого матрицу оставили в состоянии покоя приблизительно на 5 минут, чтобы гранулы осели на дно лунок.

После этого 200 мкл - 1000 мкл Fluorinert (зарегистрированный товарный знак) FC40 (доступен от компании SIGMA) загрузили в путь потока через сквозное отверстие в верхнем стекле (смотрите Фиг.1(d) и (e)).

В результате, водная фаза была захвачена только в лунки, так что сформировались капли. Таким образом, гранулы были герметизированы в каплях.

[Пример 1]

Вышеописанным способом обработанные биотином гранулы и 1 фМ стрептавидина прореагировали друг с другом, и полученный продукт ввели в матрицу вместе с ФДГ, чтобы, соответственно, герметизировать гранулы в каплях. Матрицей, использованной в Примере 1, была матрица 1,0 см × 1,0 см, включающая в совокупности 1097600 лунок, более конкретно включающая решетку 20×20 (по горизонтали и вертикали) субматриц, каждая из которых (i) имела размер 512 мкм × 512 мкм и (ii) включала 2744 лунки. Эту матрицу наблюдали через флуоресцентный микроскоп (IX71 (доступный от компании OLYMPUS)).

На Фиг.3 показано изображение флуоресценции матрицы, в которой гранулы герметизированы согласно одному примеру настоящего изобретения. На Фиг.3 показана одна субматрица. Как показано на Фиг.3, на изображении флуоресценции можно наблюдать несколько ярких точек (138 ярких точек в одном поле). Эти яркие точки указывают положения лунок, в которых герметизированы обработанные биотином гранулы, захватившие стрептавидин. Это доказывает, что использование способа настоящего изобретения дает возможность адекватно обнаруживать 1 фМ стрептавидина.

[Сравнительный пример 1]

В сравнительном примере настоящего изобретения молекулы-мишени обнаруживали известным способом измерения в массе.

12,5 фМ стрептавидина, что в 12,5 раз выше концентрации в Примере 1 (1 фМ), смешали с ФДГ и полученный продукт измерили на флуоресценцию с помощью флуоресцентного спектрофотометра. Кроме того, контрольный эксперимент выполнили таким же образом, использовав 6,3 пМ стрептавидина, что в 500 раз выше концентрации в этом сравнительном примере.

На Фиг.4 показаны результаты сравнительного примера и контрольного эксперимента. На Фиг.4 приведен график, показывающий интенсивности флуоресценции, наблюдавшиеся при обнаружении молекул-мишеней известным способом. Линия "a" графика на Фиг.4 показывает результат использования 12,5 фМ с трептавидина, а линия "b" графика показывает результат использования 6,3 пМ стрептавидина.

Как показано на Фиг.4, в случае использования известного способа было невозможно обнаружить 12,5 фМ стрептавидина. Это доказывает, что 12,5 фМ ниже порога обнаружения в известном способе.

[Пример 2]

Далее, обработанные биотином гранулы реагировали со стрептавидином в пяти разных концентрациях (1 фМ, 100 аМ, 10 аМ, 1 аМ и 0,1 аМ) и затем были введены в матрицы вместе с ФДГ, чтобы соответственно герметизировать гранулы в каплях. Каждая из матриц, использованных в Примере 2, имела такую же конфигурацию, как и в Примере 1. Каждую из этих матриц наблюдали в изображении яркого поля и в изображении флуоресценции через микроскоп.

(Результаты обнаружения)

На Фиг.5(a)-(f) показаны микроскопические изображения матриц, в которых герметизированы гранулы в еще одном примере настоящего изобретения. Отметьте, что на Фиг.5(a), (c) и (e) показано изображение яркого поля одной из субматриц, а на Фиг.5(b), (d) и (f) показаны изображения флуоресценции соответствующей субматрицы, показанной на Фиг.5(a), (c) и (e). Кроме того, на Фиг.5(a) и (b) показаны результаты, полученные в случае использования 1 фМ стрептавидина; на Фиг.5(c) и (d) показаны результаты, полученные в случае использования 100 аМ стрептавидина; и на Фиг.5(e) и (f) показаны результаты, полученные в случае использования 10 аМ стрептавидина.

В случае использования 1 фМ стрептавидина совокупное число гранул, герметизированных в одной субматрице, составило 1735; из них число гранул, захвативших стрептавидин, составило 138. В случае использования 100 аМ стрептавидина совокупное число гранул, герметизированных в одной субматрице, составило 2008; из них число гранул, захвативших стрептавидин, составило 6. В случае использования 10 аМ стрептавидина совокупное число гранул, герметизированных в одной субматрице, составило 1360; из них число гранул, захвативших стрептавидин, составило 1.

(Сравнение теоретического значения и экспериментального значения)

Кроме того, были вычислены теоретическое значение и экспериментальное значение отношения (в %) числа гранул (активных), захвативших стрептавидин к совокупному числу гранул для каждой из концентраций стрептавидина.

Вычисленным как теоретическое значение было отношение (в %) числа молекул стрептавидина к совокупному числу гранул, использованных в реакции со стрептавидином. Тогда как вычисленным как экспериментальное значение было отношение (в %) числа гранул, захвативших стрептавидин, к числу гранул, хранившихся в матрице.

На Фиг.6 представлен график, иллюстрирующий отношение, наблюдавшееся в упомянутом еще одном примере настоящего изобретения, между (i) концентрацией стрептавидина и (ii) отношением числа гранул, захвативших стрептавидин, к числу гранул, хранившихся в матрице. На Фиг.6 линия "a" графика показывает теоретические значения, круглая точка показывает экспериментальное значение, и круг, начерченный пунктиром, показывает средние значения экспериментальных значений (N=2-3). Кроме того, линия «b» графика является линией, которой аппроксимированы средние значения экспериментальных значений.

Как показано на Фиг.6, теоретические значения и экспериментальные значения почти совпадают друг с другом. Это доказывает, что способ данного примера имеет высокую количественную точность и способен точно измерять концентрацию молекул-мишеней. Эти результаты показывают, что способ данного примера дает возможность адекватно обнаруживать молекулы-мишени даже в концентрации 0,1 аМ или около этого.

[Пример 3]

Вышеописанным способом раствор с гранулами (6,5×10⁶ гранул/30 мкл) ввели (загрузили) в матрицу, имеющую структуру проточной кюветы, подготовленную как в Примере 1, чтобы герметизировать (захватить) гранулы в каплях. Затем вычислили эффективность захвата (т.е. отношение (в %) числа захваченных гранул к числу загруженных гранул) в ходе этой операции.

Результат вычисления показан на Фиг.8. На Фиг.8 показаны: (i) эффективность захвата гранул в случае использования матрицы, имеющей структуру проточной кюветы (Пример 3), и (ii) эффективность захвата гранул в случае с использованием матрицы, не имеющей структуры проточной кюветы (Сравнительный пример 2).

[Сравнительный пример 2]

В этом сравнительном примере была использована матрица, не имеющая структуры проточной кюветы (т.е. матрица, изготовленная только из вышеописанного гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла) (аминогранулы Ф=3 мкм; микромер-NH₂ - 3 мкм; доступны от компании Micromod).

Вышеописанным способом гранулы герметизировали в гидрофильно-гидрофобном рельефном стекле, используя раствор с гранулами, который разбавили до той же концентрации (2,2×10⁸ гранул/мл = 6,5×10⁶ гранул/30 мкл), которую использовали в случае матрицы, имеющей структуру проточной кюветы (Пример 3).

(1) Гранулы разбавили до концентрации 2,2×10⁸ гранул/мл буфером (100 мМ буфера KPi (pH=7,5), 1 мМ MgCl₂, 2 мкл/мл 2-меркаптэтанола).

(2) Гидрофильно-гидрофобное рельефное стекло (подготовленное вышеизложенным способом) соединили с дном чашки Петри (чашка Петри 35 мм, доступная от компании Becton Dickinson). Для этого использовали клей Araldite AR-R30 (доступный от компании NICHIBAN).

(3) Верхнюю поверхность гидрофильно-гидрофобного рельефного стекла покрыли 500 мкл раствора с гранулами.

(4) Полученный продукт подвергли деаэрации и затем инкубировали в течение 5 минут.

(5) 2 мл FC40 (Fluorinert (зарегистрированный товарный знак) FC40, доступный от компании SIGMA) загрузили на гидрофильно-гидрофобное рельефное стекло, чтобы герметизировать гранулы на нем.

(6) Для того чтобы предотвратить испарение капель, на них ввели воду, чтобы масляная фаза была покрыта водой.

После этого подсчитали число гранул в каплях и затем вычислили эффективность захвата (отношение (в %) числа захваченных гранул к числу загруженных гранул).

Результаты вычислений показаны на Фиг.8. Как показано на Фиг.8, эффективность захвата в случае использования матрицы, имеющей структуру проточной кюветы, была в 25 или больше раз выше, чем в случае использования матрицы, не имеющей структуры проточной кюветы, причиной этого считается следующее: в случае использования матрицы, не имеющей структуры проточной кюветы, расстояние на которое гранулы могли распространяться в вертикальном направлении, увеличилось, что затруднило подход гранул ближе к субстрату.

Кроме того, в случае использования матрицы, не имеющей структуры проточной кюветы, вся поверхность субстрата матрицы должна быть покрыта раствором с гранулами. Это требует большого количества раствора с гранулами (т.е. приблизительно в 16 раз больше, чем в случае использования матрицы, имеющей структуру проточной кюветы). Таким образом, использование матрицы, имеющей структуру проточной кюветы, дает возможность выполнить герметизацию гранул при небольшом количестве раствора с гранулами.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение может быть применено к способу обнаружения молекул-мишеней в низкой концентрации, матрице для этого, устройству для этого и т.д.

Список ссылочных обозначений

1 Матрица 10 Часть нижнего слоя 20 Часть верхнего слоя 12 Боковая стенка 13 Лунка 30 Пространство 41, 41′ Гранулы 42 Гидрофильный растворитель 43 Гидрофобный растворитель

Настоящее изобретение относится к способу герметизации гранул (т.е. способу герметизации гранул), способу обнаружения молекулы-мишени, матрице, набору и устройству для обнаружения молекулы-мишени. Способ включает (i) этап введения гидрофильного растворителя (42), содержащего гранулы (40), (41′), в пространство (30) между (a) частью нижнего слоя (10), включающей некоторое множество лунок (13), каждая из которых способна хранить только одну гранулу (41), (41′) и которые отделены друг от друга боковой стенкой (12), имеющей гидрофобную верхнюю поверхность, и (b) частью верхнего слоя (20), обращенной к поверхности части нижнего слоя (10), на которой расположено некоторое множество лунок (13). Также способ включает (ii) этап введения гидрофобного растворителя (43) в пространство (30), причем этап (ii) выполняют после этапа (i). Техническим результатом является повышение чувствительности обнаружения молекулы-мишени с низкой концентрацией. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 ил.

1. Способ герметизации гранул, включающий:
(i) этап введения гидрофильного растворителя, содержащего гранулы, в пространство между (а) частью нижнего слоя, включающей некоторое множество лунок, каждая из которых способна хранить только одну гранулу и которые отделены друг от друга боковой стенкой, имеющей гидрофобную верхнюю поверхность, и (b) частью верхнего слоя, обращенной к поверхности части нижнего слоя, на которой расположено некоторое множество лунок; и
(ii) этап введения гидрофобного растворителя в это пространство, причем этап (ii) выполняют после этапа (i).

2. Способ по п. 1, кроме того, включающий:
(iii) этап деаэрации пространства, причем этап (iii) выполняют после этапа (i) и перед этапом (ii).

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что:
гидрофильным растворителем является по меньшей мере один, выбираемый из группы, состоящей из воды, гидрофильного спирта, гидрофильного эфира, кетона, нитрильных растворителей, диметилсульфоксида и N,N-диметилфоримамида, или является смесь, включающая по меньшей мере одно из вышеуказанного.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что:
гидрофобным растворителем является по меньшей мере один, выбираемый из группы, состоящей из насыщенного углеводорода, ненасыщенного углеводорода, ароматического углеводорода, силиконового масла, перфторуглерода, галогенных растворителей и гидрофобной ионной жидкости, или является смесь, включающая по меньшей мере одно из вышеуказанного.

5. Способ обнаружения молекулы-мишени, включающий:
(i) этап реакции гранул, специфически захватывающих молекулы-мишени, с молекулами-мишенями;
(ii) этап выполнения с использованием гранул способа по любому одному из пп. 1-4, причем этап (ii) выполняют после этапа (i); и
(iii) этап определения, хранится ли или нет любая из гранул, захвативших молекулы-мишени, в каждой из некоторого множества лунок, причем этап (iii) выполняют после этапа (ii).

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что:
гранулами являются такие гранулы, с которыми связываются молекулы, имеющие способность специфически связываться с молекулами-мишенями.

7. Набор для герметизации гранул, включающий:
матрицу, включающую:
часть нижнего слоя с некоторым множеством лунок, отделенных друг от друга боковой стенкой, имеющей гидрофобную верхнюю поверхность; и
часть верхнего слоя, обращенную через пространство к поверхности части нижнего слоя, на которой расположено некоторое множество лунок;
гранулы;
гидрофильный растворитель; и
гидрофобный растворитель,
причем каждая из упомянутого множества лунок способна хранить только одну из гранул, и
причем упомянутый набор используется для осуществления способа по п. 1.

8. Набор по п. 7, отличающийся тем, что:
каждая из некоторого множества лунок имеет гидрофильную нижнюю поверхность.

9. Набор по п. 7, отличающийся тем, что:
часть верхнего слоя имеет гидрофобную поверхность, обращенную к части нижнего слоя.

10. Набор по п. 7, отличающийся тем, что:
по меньшей мере одна из части верхнего слоя и части нижнего слоя имеет сквозное отверстие, через которое текучую среду вводят в пространство.

11. Устройство для обнаружения молекулы-мишени, включающее:
набор по любому одному из пп. 7-10; и
датчик изображения для обнаружения света, излучаемого из каждой из некоторого множества лунок в случае, когда гранулы, захватившие молекулы-мишени, хранятся в этом некотором множестве лунок.