СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И КЛАССИФИКАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ Российский патент 2021 года по МПК G01N21/25 

Изобретение относится к аналитической химии и, в частности, к способам обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в растворах на основе оптических сенсорных устройств без использования аналитических меток. Оптические сенсорные устройства могут быть выполнены на основе различных оптических волокон (волноводов): планарных, микроструктурных и др.

К настоящему времени в известных источниках предложено большое количество сенсоров с использованием микроструктурированных оптических волокон (МВ) в качестве чувствительного элемента для проведения анализа газов и жидкостей. Общим для всех предложенных схем является использование эффекта взаимодействия излучения с введенным в МВ анализируемым веществом, как в полых объемах волокна, так и на его поверхности, и регистрация соответствующих этому взаимодействию изменений в оптических свойствах МВ.

Обнаружение и классификация специфических взаимодействий белковых молекул играют важнейшую роль в функционировании живых систем, научных исследованиях и медицинской практике.

Известен способ обнаружения белковых молекул с помощью функционализации поверхности оптического волокна, что дает возможность создания биосенсоров для анализа специфичных взаимодействий между белками-мишенями (см. Huang Y., Yu B., Guo T., Guan B.O. Ultrasensitive and in situ DNA detection in various pH environments based on a microfiber with a graphene oxide linking layer // RSC Advances 2017. V. 7. № 22. P. 13177). В способе используется модификация поверхности МВ карбоксилированным оксидом графена, способным к π−π взаимодействию с молекулами ДНК в широком диапазоне pH (4.3−8.5), что перспективно для in situ определения одноцепочечных ДНК в организме человека.

Однако данному подходу свойственны недостатки, связанные с длительной и сложной процедурой формирования на поверхности МВ чувствительного слоя, обладающего стабильностью свойств на всей поверхности МВ и устойчивостью при хранении.

Известен способ обнаружения сердечного биомаркера тропонина cTnI без применения аналитических меток с использованием фотонно-кристаллических волокон с открытой микрополостью (см. Zhang, B., Morales, A. W., Peterson, R., Tang, L., & Ye, J. Y. (2014). Label-free detection of cardiac troponin I with a photonic crystal biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 58, 107–113.). Структура сенсора содержит открытую полость, облегчающую иммобилизацию специфических к cTnI антител, которые иммобилизуются на поверхности сенсора для специфического обнаружения cTnI в широком диапазоне концентраций.

Недостатком способа в первую очередь является длительность, сложность и трудоёмкость создания на внутренней поверхности МВ однородного слоя, специфичного к сорбции целевого аналита.

Известен также способ обнаружения и классификации белковых молекул без аналитических меток с использованием пластиковых сенсорных элементов, полученных микрорепликацией (см. патент Японии № 4504686 по кл. МПК
B01L3/00, опуб. 02.06.2005). Описана возможность обнаружения различных белковых молекулярных комплексов, включая олигонуклеотиды, взаимодействия антитело-антиген, взаимодействия гормона-рецептора и взаимодействия фермент-субстрат. Сенсорное устройство состоит из двух частей: элемента специфичного распознавания, систему детектирования аналитического сигнала, включающую преобразователь, который преобразует событие молекулярного распознавания в поддающийся количественной оценке сигнал. Специфичный элемент распознавания выполнен на основе оптической решетки, содержащей материал с высоким показателем преломления, слоя подложки, поддерживающего оптическую решетку, и иммобилизованных на поверхность оптической решетки веществ способных к специфическому связыванию анализируемых молекул. При взаимодействии излучения с оптической решеткой в отраженном спектре излучения возникает детектируемый резонансный эффект.

Недостатками способа являются использование отраженного сигнала, что значительно ограничивает возможности при анализе взаимодействий белковых молекул, а также сложная, длительная и трудоемкая процедура изготовления микрореплик оптических решеток с разрешением 0,1 мкм с иммобилизованными на поверхность оптической решетки веществами, способными к специфическому связыванию анализируемых молекул.

Общим недостатком описанных выше способов обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий является использование иммобилизованных на твердую подложку специфических элементов (центров) связывания, например антител, то есть проведение аналитических определений в гетерогенном формате, который предполагает длительные и сложно воспроизводимые стадии синтеза модифицированной твердой подложки и продолжительную процедуру инкубации анализируемых растворов на подложке для осуществления специфического связывания определяемых белковых молекул и получения значимого аналитического сигнала..

Альтернативой гетерогенному формату определений является гомогенный, при котором обнаружение белковых молекул и продуктов их взаимодействия проводятся при введении специфических центров связывания непосредственно в анализируемый раствор.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения взаимодействий антител с антигенами в микроструктурных оптических волокнах (Pavel S. Pidenko, Andrey A. Shuvalov, Anastasia A. Zanishevskaya, Natalia A. Burmistrova, "Detection of antigen-antibody interactions in microstructured optical fibers," Proc. SPIE 11457, Saratov Fall Meeting 2019:), включающий приготовление модельных образцов, представляющих собой, раствор обнаруживаемого белка, раствор специфического центра связывания, и смеси раствора белка с растворами специфических центров связывания с различной концентрацией, введение растворов и смесей во внутреннюю полость микроструктурированного оптического волокна, детектирование спектров пропускания растворов и смесей, по которым судят о наличии взаимодействий. В прототипе показана принципиальная возможность обнаружения взаимодействия антигенов с антителами на примере пары антител мыши (mAb) и кроличьих антимышиных антител (rAmAb) в микроструктурных оптических волокнах в гомогенном формате. Раствор rAmAb (100 мкг/л) применяли для связывания различных концентраций mAb (1 – 100 мкг / л). Смеси mAb/ rAmAb готовили путем добавления раствора mAb к раствору rAmAb в соотношении 1:1. Смеси инкубировали 30 минут и детектировали спектр пропускания волокна. На основании изменения интенсивности характеристического максимума в спектре пропускания волокна проводили оценку степени взаимодействия антител.

К недостаткам прототипа относятся использование видимого спектрального диапазона длин волн (от 400 до 700 нм), который не охватывает ближние ультрафиолетовые (УФ) и инфракрасные (ИК) области, в которых осуществляется значительное поглощение и рассеяние излучения белковыми молекулами, а также использование одномерного подхода (оценка интенсивности сигнала при одной длине волны) при обработке спектральных данных, который вследствие сложного характера данных спектров пропускания МВ, не позволяет разделять близкие по характеру и перекрывающиеся изменения в спектрах пропускания МВ, что значительно уменьшает точность определений.

Технической проблемой заявляемого изобретения является создание способа обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в растворах с использованием микроструктурированных оптических волокон в гомогенном формате без применения стадии иммобилизации на поверхность волокон специфических центров связывания и без использования аналитических меток.

Технический результат заключается в сокращении времени и повышении точности и достоверности обнаружения, и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в растворах.

Для достижения технического результата в способе обнаружения взаимодействий белковых молекул со специфическим центром связывания, включающем приготовление модельных образцов, представляющих собой, по крайней мере, один раствор обнаруживаемого белка, раствор специфического центра связывания, и смеси раствора белка с растворами специфических центров связывания с различной концентрацией, введение растворов и смесей во внутреннюю полость микроструктурированного оптического волокна, детектирование спектров пропускания растворов и смесей, по которым судят о наличии взаимодействий, согласно изобретению, детектирование спектров пропускания осуществляют в оптическом спектральном диапазоне от 250 нм до 3000 нм, данные спектров пропускания модельных образцов используют для построения математической модели взаимодействия обнаруживаемых белков, для этого данные спектров представляют в виде матрицы, строки которой соответствуют номерам образца, а столбцы - интенсивностям спектрального сигнала, проводят разложение матрицы по методу главных компонент, получают графики счетов и нагрузок, на которых выделяют группы точек, характеризующие наличие или отсутствие взаимодействия, готовят тестируемый раствор и смеси тестируемого раствора со специфическим центром связывания с различной концентрацией, вносят тестируемый раствор и смеси во внутренние полости микроструктурированного оптического волокна и детектируют спектры пропускания, которые сравнивают со спектрами модельных образцов и при попадании спектральных данных тестируемых растворов в соответствующую группу точек модельных образцов судят о наличии или отсутствии взаимодействия.

Изобретение иллюстрируется чертежами, где:

- на фиг 1 представлено распределение групп точек модельных образцов: раствора модельного белка, в частности иммуноглобулина G (область 1), раствора специфического центра связывания, в частности протеина А (область 2), смеси растворов специфических центров связывания с раствором модельного белка, в частности – комплекса протеин А/иммуноглобулин G (область 3);

- на фиг. 2 распределение групп точек тестируемых растворов относительно модельных образцов представлено символами в виде крестиков: наличие иммуноглобулина G в исследуемой жидкости – в области 2, образование комплекса протеин А/иммуноглобулин G – в области 3;

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят модельные растворы: раствор обнаруживаемого белка, раствор специфического центра связывания, и смеси раствора белка с растворами специфических центров связывания с концентрацией (плюс и минус 30% от максимально и минимально возможной).

Используют микроструктурированое оптическое волокно с полой, подвешенной, твердой сердцевиной, или волокно иной конструкции, имеющее полые микро капилляры. (см., например, Pavel S. Pidenko, Andrey A. Shuvalov, Anastasia A. Zanishevskaya, Natalia A. Burmistrova, "Detection of antigen-antibody interactions in microstructured optical fibers," Proc. SPIE 11457, Saratov Fall Meeting 2019:).

Вводят растворы и смеси в полые микрокапилляры микроструктурированного оптического волокна под действием капиллярных сил, насоса, или иным доступным способом.

Так как индивидуальные белковые молекулы и продукты их взаимодействий поглощают и рассеивают излучение в оптическом диапазоне длин волн от 250 нм до 3000 нм, то для получения спектров пропускания МВ используют источник излучения и детектор, работающие в этом спектральном диапазоне.

Данные спектров пропускания модельных образцов используют для построения математической модели взаимодействия обнаруживаемых белков. При построении модели используют многомерные методы анализа, например метод главных компонент.

Для проведения обработки данные спектров пропускания МВ представляют в виде матрицы Х, состоящей из n объектов (строк) и р характеристик (столбцов). Таким образом, матрицу данных n × p представляют следующим образом:

(1)

На первом этапе проверяют матрицу данных на полноту и при необходимости заполняют пустоты в данных по среднему значению столбца или строки, или ближайших соседей. В случаях, когда данные сильно коррелируют друг с другом или избыточны и постоянны, их удаляют из выборки.

Далее проводят центрирование данных. Центрирование – это вычитание из исходной матрицы Х матрицы М. В способе используют среднее центрирование, где каждая переменная центрируется вычитанием среднего значения столбца в соответствии с уравнением (2):

(2)

Далее проводят обработку данных методом главных компонент с целью уменьшить размерность спектральных данных без значительной потери информации из-за скрытой структуры данных. Проводят разложение матрицы данных, в которой число строк соответствует количеству образцов, а число столбцов – числу независимых переменных (в частном случае – аналитических сигналов), на произведение двух матриц Т и Р с меньшими размерностями и матрицу остатков Е, которая содержит фоновую информацию (шум) (Родионова О.Е. Хемометрика в аналитической химии // 2006. 61с.).

Далее проводят отбор пробы биологической, или иной анализируемой жидкости. Проводится необходимая пробоподготовка и разбавление с целью получения визуально прозрачного исходного раствора. При приготовлении растворов, подготовке проб и выполнении измерений соблюдают следующие условия: температура окружающего воздуха (20±5) °С; атмосферное давление 84,0-106,7 кПа (630-800 мм рт.ст.); относительная влажность воздуха при 25°С ниже 85%. Проводится внесение в раствор раствора специфических центров связывания с известной концентрацией.

Проводится внесение подготовленных таким образом образцов в полые микрокапилляры микроструктурированного оптического волокна и детектирование спектров пропускания МВ, заполненных различными образцами. В качестве аналитического сигнала используется спектр пропускания МВ. При этом обнаружение и классификация белковых молекул-аналитов и продуктов их взаимодействий определяется по изменению характеристик спектра пропускания МВ. Обнаружение и классификация белковых молекул-аналитов и продуктов их взаимодействий проводится на основе описанной выше построенной математической модели методом главных компонент.

Пример. Применение белка А для специфичного распознавания иммуноглобулинов G в плазме крове человека.

На первом этапе проводится построение многомерной математической модели модельного набора данных. Для этого готовят набор не менее чем из 15 растворов белка А, иммуноглобулина G в различных концентрациях и соотношениях. Получают спектры пропускания МВ, заполненных приготовленными растворами. Данные спектров пропускания представляют в виде матрицы, состоящей из n объектов (строк) и р характеристик (столбцов). где строки соответствуют номеру образца, а столбцы интенсивностям спектрального сигнала. Проверяют матрицу данных на полноту и при необходимости заполняют пустоты в данных по среднему значению столбца или строки, или ближайших соседей. При необходимости удаляют избыточные данные и проводят центрирование. Далее проводят разложение матрицы по методу главных компонент, получают и анализируют графики счетов и нагрузок.

При этом график счетов (см. фиг.1) содержит в своем составе три характеристические группы точек: спектральные данные образцов плазмы крови, содержащие иммуноглобулины G (область 1), протеин А (область 2) и белковые комплексы протеин А/иммуноглобулин G (область 3).

Определение наличия иммуноглобулинов G с использованием протеина A, проводится по следующей методике. Первоначально производится отбор биологического материала (цельной крови) в вакуумные пробирки с литий гепарином. В течение 24 часов после проведения отбора пробы проводятся необходимые процедуры пробоподготовки: центрифугирование образцов для выделения плазмы крови, разделение (аликвотрирование) образца плазмы крови на равные объёмы для проведения параллельных исследований (n=5) и расчета стандартного отклонения. Непосредственно перед внесением специфического центра связывания (Белок A (Sigma-Aldrich, США, кат. №P 6031), образцы плазмы крови последовательно разбавляются с использованием фосфатно-солевого буферного раствора, до достижения максимальной оптической плотности (A = 0.8 a. u) в диапазоне 200-1200 нм. Контроль оптической плотности проводят на спектрофотометре Shimadzu UV-1800 (Shimadzu Europa GmbH, Дуйсбург, Германия). К приготовленному образцу плазмы крови, добавляют раствор Белка A в концентрации составлять 2 г/л. После внесения Белка А, смесь инкубируется при температуре 36.6 градусов Цельсия, при постоянном перемешивании (200 об/мин) в течение 15 минут. В дальнейшем смесь (100 мкл) шприцевым насосом инжектируется во внутренние полости МВ, для стабильности оптического сигнала, кювета с установленным образцом МВ, аналогично заполняется смесью (200 мкл) после заполнения смесью производят детектирование спектров пропускания МВ. После записи спектров пропускания смеси в МВ, спектральные данные, нормируются на спектральные данные источника излучения используют в качестве тестового набора данных. Тестовый набор данных соотносят с модельным набором данных. Результатом является определение, в какую из трех характеристических областей групп точек модельного набора данных (фиг. 1) попадают полученные спектральные данные тестового набора (фиг. 2). Если в образцах тестового набора данных наблюдается образование белкового комплекса протеин А/иммуноглобулин G, то они будут расположены в области 3 характеристической группы, в случае отсутствия - в области 2 группы, соответственно.

Таким образом, введение белка А в образец биологической жидкости и последующее обнаружение, и классификация его возможных взаимодействий может быть применено для количественной оценки содержания иммуноглобулинов G. Концентрационный всплеск иммуноглобулинов G в биологическом объекте, полученном от пациента, свидетельствует о наличии выраженного иммунного ответа. Поскольку для IgG1, IgG2 и IgG4 период полужизни составляет 21 день, обнаружение и классификация данного вида взаимодействий применимо при создании экспресс-тестов распознавания иммунного ответа при разработке и тестировании вакцин, а также для формирования групп риска в эпидемических условиях.

Обнаружение и классификация взаимодействий между специфичными IgG и антигенами белковой природы применимо в разработке экспрессных тест-систем и систем потокового мониторинга, взамен методов классического иммуноферментного анализа, позволяющих значительно сократить время проведения и интерпретации результатов анализа.

В качестве белковых молекул и продуктов их взаимодействий, которые могут быть обнаружены и классифицированы предлагаемым способом можно привести следующие примеры.

1. Биотин (X) Биотиназа – Карбоксилазы (соединенные с биотином) – Стрептавидин/Авидин (Y).Биотин – витамин, дефицит которого способствует развитию ряда заболеваний. Стрептавидин и авидин – белки, селективно связывающие биотин. Введение белков стрептавидина и авидина в образец биологической жидкости (сыворотки крови) и последующее детектирование ББВ применимо для экспресс-определения уровня свободного биотина при лечении и профилактике дефицита биотина у пациента.

2. Полимераза, специфические и неспецифические продукты ее реакций при проведении процедуры полимеразной цепной реакции в различных вариантах.

3. Белок pRb (X) – фактор транскрипции E2F (Y). Белок ретинобластомы (pRb) является ингибитором клеточного цикла и выполняет роль супрессора опухолеобразования, за счет связывания факторов транскрипции семейства E2F. pRb инактивирует транскрипцию комплекса E2F-DP (состоящего из димеров белка E2F и димеризованного партнера белка DP), активирующего прогрессирование клеточного цикла. В случае возникновения мутации в обоих аллелях гена RB1 (кодирующего pRB), pRB инактивируется, что приводит к развитию ретинобластомы. Детектирование взаимодействия между pRb пациента и введенным фактором транскрипции E2F позволяет выявить генетическую мутацию и начать терапию на раннем этапе развития ретинобластомы, что повышает шанс выживания пациента и сохранения глаза и его функции как органа зрения.

Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить точность и достоверность обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в гомогенном формате с использованием микроструктурированных оптических волокон без применения стадии иммобилизации на поверхность волокон специфических центоров связывания и без использования аналитических меток.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в растворах на основе оптических сенсорных устройств без использования аналитических меток. Способ обнаружения взаимодействий белковых молекул со специфическим центром связывания включает приготовление модельных образцов, представляющих собой по крайней мере один раствор обнаруживаемого белка, раствор специфического центра связывания и смеси раствора белка с растворами специфических центров связывания с различной концентрацией, введение растворов и смесей во внутреннюю полость микроструктурированного оптического волокна, детектирование спектров пропускания растворов и смесей, по которым судят о наличии взаимодействий, при этом детектирование спектров пропускания осуществляют в спектральном диапазоне от 250 нм до 3000 нм, данные спектров пропускания модельных образцов используют для построения математической модели взаимодействия обнаруживаемых белков, для этого данные спектров представляют в виде матрицы, строки которой соответствуют номерам образца, а столбцы - интенсивностям спектрального сигнала, проводят разложение матрицы по методу главных компонент, получают графики счетов и нагрузок, на которых выделяют группы точек, характеризующие наличие или отсутствие взаимодействия, готовят тестируемый раствор и смеси тестируемого раствора со специфическим центром связывания с различной концентрацией, вносят тестируемый раствор и смеси во внутренние полости микроструктурированного оптического волокна и детектируют спектры пропускания, которые сравнивают со спектрами модельных образцов, и при попадании спектральных данных тестируемых растворов в соответствующую группу точек модельных образцов судят о наличии или отсутствии взаимодействия. Техническим результатом является сокращение времени анализа, повышение точности и достоверности обнаружения и классификации белковых молекул и продуктов их взаимодействий в растворах. 2 ил.

Способ обнаружения взаимодействий белковых молекул со специфическим центром связывания, включающий приготовление модельных образцов, представляющих собой по крайней мере один раствор обнаруживаемого белка, раствор специфического центра связывания и смеси раствора белка с растворами специфических центров связывания с различной концентрацией, введение растворов и смесей во внутреннюю полость микроструктурированного оптического волокна, детектирование спектров пропускания растворов и смесей, по которым судят о наличии взаимодействий, отличающийся тем, что детектирование спектров пропускания осуществляют в спектральном диапазоне от 250 нм до 3000 нм, данные спектров пропускания модельных образцов используют для построения математической модели взаимодействия обнаруживаемых белков, для этого данные спектров представляют в виде матрицы, строки которой соответствуют номерам образца, а столбцы - интенсивностям спектрального сигнала, проводят разложение матрицы по методу главных компонент, получают графики счетов и нагрузок, на которых выделяют группы точек, характеризующие наличие или отсутствие взаимодействия, готовят тестируемый раствор и смеси тестируемого раствора со специфическим центром связывания с различной концентрацией, вносят тестируемый раствор и смеси во внутренние полости микроструктурированного оптического волокна и детектируют спектры пропускания, которые сравнивают со спектрами модельных образцов, и при попадании спектральных данных тестируемых растворов в соответствующую группу точек модельных образцов судят о наличии или отсутствии взаимодействия.