АНТИТЕЛА ПРОТИВ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ (ФРН), ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ IN VIVO Российский патент 2015 года по МПК C07K16/22 C07K16/18 C12N5/10 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 A61P25/00 

Уровень техники

Фактор роста нервов (ФРН) - это секретируемый белок, который был обнаружен более 50 лет назад как молекула, способствующая выживанию и дифференцировке чувствительных и симпатических нейронов. Бета-цепь ФРН полностью отвечает за активность ФРН, стимулирующую рост нервов. Бета-цепь образует гомодимеры и входит в состав более крупного белкового комплекса. ФРН является членом семейства нейротрофических факторов, известных как нейротрофины. ФРН с высокой аффинностью связывается с киназой рецептора тропомиозина, называемой TrkA. ФРН также способен связываться с рецептором, известным как p75^NTR, членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей, который также взаимодействует с другими нейротрофинами. Структура и функция ФРН рассматриваются, например, в работе Sofroniew, M.V. et al. (2001) Annu. Rev. Neurosci. 24:1217-1281; Weismann, С.and de Vos, A.M. (2001) Cell. Mol. Life Sci. 58:748-759; Fahnestock, M. (1991) Curr. Top.Microbiol. Immunol. 165:1-26.

Хотя первоначально ФРН был идентифицирован по его способности обеспечивать выживание и дифференцировку нейронов, появляется все больше свидетельств того, что это влияние на развитие является лишь одним аспектом биологии ФРН. В частности, было показано участие ФРН в передаче и поддержании персистентной или хронической боли. Например, продемонстрировано, что как местное, так и системное введение ФРН вызывает гипералгезию и аллодинию (Lewin, G.R. etal. (1994) ему. J. Neurosci, 6:1903-1912). Внутривенная инфузия ФРН человеку вызывает миалгию во всем теле, в то время как местное введение вызывает гипералгезию и аллодинию в области инъекции, в дополнение к системным эффектам (Apfel, S.C. et al. (1998) Neurology 51_:695-702). Кроме того, при некоторых формах раковых заболеваний избыток ФРН способствует росту и инфильтрации нервных волокон с индукцией раковой боли (Zhu, Z. et al. (1999) J. din. Oncol. 17:241-228).

Участие ФРН в механизмах хронической боли привело к значительной заинтересованности в терапевтических подходах, основанных на ингибировании эффектов ФРН (см., например, Saragovi, H.U. and Gehring, К. (2000) Trends Pharmacol. Sci. 21:93-98). Например, растворимую форму рецептора TrkA применяли для блокирования активности ФРН, что, как было показано, существенно подавило образование невром, ответственных за невропатическую боль, без повреждения тел клеток нейронов с патологическими изменениями (Kryger, G.S. et al, (2001) J. Hand Surg. (Am.) 26:635-644).

Другой способ нейтрализации активности ФРН заключается в применении антител против ФРН, примеры которых были описаны (см., например, публикации РСТ №№ WO 2001/78698, WO 2001/64247, WO 2002/096458, WO 2004/032870, WO 2005/061540, WO 2006/131951, WO 2006/110883, патент США №7 449 616, публикации США №№ US 20050074821, US 20080033157, US 20080182978 и US 20090041717). В моделях невропатической боли у животных (например, перевязка нервного ствола или спинального нерва) системная инъекция нейтрализующих антител против ФРН предотвращает как аллодинию, так и гипералгезию (Ramer, M.S. and Bisby, M.A. (1999) Eur. J. Neurosci. 11:837-846; Ro, L.S. et al. (1999) Pain 79:265-274). Более того, обработка нейтрализующим антителом против ФРН вызывает существенное ослабление боли в модели боли, связанной с раковыми заболеваниями, у мышей (Sevcik, M.A. et al. (2005) Pain 115:128-141).

Таким образом, в свете вышеизложенного, требуются дополнительные антагонисты ФРН.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение направлено на создание антител против ФРН, обладающих повышенной стабильностью in vivo. В частности, настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит мутацию, предпочтительно мутацию в шарнирной области, и при этом антитело демонстрирует неожиданно длинный терминальный период полувыведения, такой как терминальный период полувыведения у яванского макака по меньшей мере 15 дней и в типичном случае - в диапазоне от примерно 15 до примерно 22 дней (или в диапазоне от 15 дней до 22 дней), или в диапазоне от примерно 15 дней до 28 дней (или в диапазоне от 15 дней до 28 дней), или в диапазоне от примерно 21 дня до примерно 28 дней (или в диапазоне от 21 до 28 дней). Это стабилизированное антитело против ФРН (например, антитело со стабилизированной шарнирной областью) также демонстрирует терминальный период полувыведения у крыс по меньшей мере 8 дней, в типичном случае - в диапазоне от примерно 8 до примерно 9 дней (или в диапазоне от 8 до 9 дней). В других вариантах воплощения стабилизированное антитело против ФРН (например, антитело со стабилизированной шарнирной областью) может обладать средним терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней, или по меньшей мере 10 дней, по меньшей мере 15 дней, по меньшей мере 20 дней, по меньшей мере 25 дней, по меньшей мере 30 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 30 дней (или в диапазоне от 10 до 40 дней или в диапазоне от 15 до 30 дней). В других вариантах воплощения стабилизированное антитело против ФРН (например, антитело со стабилизированной шарнирной областью) может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Предпочтительно, мутация в консервативной области IgG4 является мутацией в шарнирной области. Еще более предпочтительно, мутация в шарнирной области в составе консервативной области IgG4 содержит мутацию серина в позиции аминокислоты, соответствующей позиции аминокислоты 108 в последовательности ID №: 9 (которая демонстрирует аминокислотную последовательность дикого типа консервативной области IgG4 человека). В соответствии с этим, настоящее изобретение направлено на создание антитела против фактора роста нервов (ФРН), содержащего консервативную область IgG4 человека, а именно - консервативную область IgG4 человека, которая включает мутацию в шарнирной области, включающую мутацию серина в позиции аминокислоты, соответствующей позиции аминокислоты 108 в последовательности ID №: 9. Более предпочтительно, серии в позиции аминокислоты, соответствующей позиции аминокислоты 108 в последовательности ID №: 9, заменен на пролин. В предпочтительном варианте воплощения консервативная область IgG4 человека в составе антитела против ФРН содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10. В качестве варианта, в этом документе описаны другие возможные мутации, стабилизирующие IgG4.

Предпочтительным антителом против ФРН по изобретению является антитело PG110, аминокислотная последовательность тяжелой цепи которого представлена в ПОСЛ. ID №: 13 и аминокислотная последовательность легкой цепи которого представлена в ПОСЛ. ID №: 16. В соответствии с этим. настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом антитело содержит тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 13 и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 16. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом антитело содержит тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью ПОСЛ. ID №: 11, и легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью ПОСЛ. ID №: 14. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, содержащего тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 13, при этом антитело имеет терминальный период полувыведения у яванского макака по меньшей мере 15 дней (и в типичном случае - в диапазоне от примерно 15 до примерно 22 дней, или в диапазоне от 15 дней до 22 дней, или в диапазоне от примерно 15 дней до 28 дней, или в диапазоне от 15 до 28 дней, или в диапазоне от примерно 21 дня до примерно 28 дней, или в диапазоне от 21 до 28 дней, и/или имеет терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней (или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или по меньшей мере 30 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 30 дней, или в диапазоне от 10 до 40 дней или в диапазоне от 15 до 30 дней). Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель). Предпочтительно, тяжелую цепь кодирует нуклеотидная последовательность ПОСЛ. ID №: 11. Предпочтительно, антитело содержит легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 16. Предпочтительно, легкую цепь кодирует нуклеотидная последовательность ПОСЛ. ID №:14.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1 (которая демонстрирует вариабельную область тяжелой цепи антитела PG110). В другом варианте воплощения антитело против ФРН содержит вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2 (которая демонстрирует вариабельную область легкой цепи антитела PG110). В другом варианте воплощения антитело против ФРН содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2. В другом варианте воплощения антитело против ФРН конкурирует за связывание ФРН с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно (где ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5 демонстрируют CDR 1, 2 и 3, соответственно, в составе вариабельной области тяжелой цепи антитела PG110), В другом варианте воплощения антитело против ФРН содержит вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно (где ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8 демонстрируют CDR 1, 2 и 3, соответственно, в составе вариабельной области легкой цепи антитела PG110). В другом варианте воплощения антитело против ФРН содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, и содержит вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно.

Предпочтительно, антитело против ФРН обладает одним или несколькими следующими функциональными свойствами:

а) связывается с ФРН человека, но не связывается с нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF) человека, нейротрофином 3 (NT-3) человека или нейротрофином 4 (NT-4) человека;

б) связывается с ФРН человека или крысы с K_D, равной 100 пМ или менее;

в) ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR;

г) ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1;

д) ингибирует ФРН-зависимое выживание ганглиев заднего корешка спинного мозга цыпленка;

е) ингибирует ФРН-зависимое разрастание аксонов клеток PC 12.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению не демонстрирует синдром рикошета при введении субъекту. Например, размер дозировки и частота введения доз для антитела могут быть выбраны таким образом, что антитело не демонстрирует синдром рикошета при введении субъекту.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению способно облегчать боль у субъекта в течение длительного периода времени, например, в течение по меньшей мере примерно одной недели, или по меньшей мере примерно двух недель, или по меньшей мере примерно четырех недель, или по меньшей мере примерно восьми недель, или по меньшей мере примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от примерно одной недели до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от примерно четырех недель до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от примерно восьми недель до примерно двенадцати недель, или в течение по меньшей мере одной недели, или по меньшей мере двух недель, или по меньшей мере четырех недель, или по меньшей мере восьми недель, или по меньшей мере двенадцати недель, или по меньшей мере от одной до двенадцати недель, или по меньшей мере от четырех до двенадцати недель, или по меньшей мере от восьми до двенадцати недель после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту.

В частности, в предпочтительном воплощении настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, которое обладает комбинированными полезными особенностями продленного терминального периода полувыведения и пролонгированного периода облегчения боли. В соответствии с этим, настоящее изобретение также направлено на создание антитела против ФРН, содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит мутацию (предпочтительно мутацию в шарнирной области), при этом антитело имеет терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней, или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или по меньшей мере 30 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 30 дней (или в диапазоне 10-40 дней или в диапазоне 15-30 дней), и при этом антитело облегчает боль на период длительностью от по меньшей мере примерно одной недели до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от одной недели до двенадцати недель, или по меньшей мере от примерно четырех недель до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от четырех недель до двенадцати недель после введения разовой дозы антитела человеку (или по меньшей мере одна неделя, или по меньшей мере две недели, или по меньшей мере четыре недели, или по меньшей мере восемь недель, или по меньшей мере двенадцать недель, или от одной до двенадцати недель, или от четырех до двенадцати недель, или от восьми до двенадцати недель после введения разовой дозы антитела человеку). Предпочтительно, мутация в шарнирной области содержит мутацию серина в позиции аминокислоты, соответствующей позиции аминокислоты 108 в последовательности ID №: 9, предпочтительно, замену серина на пролин в позиции аминокислоты, соответствующей позиции аминокислоты 108 в последовательности ID №: 9. Более предпочтительно, консервативная область IgG4 человека включает аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10. В различных вариантах воплощения антитело может демонстрировать одно или несколько функциональных свойств, описанных в этом документе. В предпочтительном варианте воплощения антитело конкурирует за связывание ФРН с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против фактора роста нервов (ФРН), содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10, и при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с K_D, равной 100 пМ или менее, ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее. Предпочтительно, антитело обладает средним терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней, или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или по меньшей мере 30 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 30 дней (или в диапазоне от 10 до 40 дней или в диапазоне от 15 до 30 дней). Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель). Антитело может дополнительно демонстрировать одно или несколько добавочных функциональных свойств, таких как связывание с ФРН человека, но отсутствие связывания с нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF) человека, нейротрофином 3 (NT-3) человека или нейротрофином 4 (NT-4) человека; ингибирование ФРН-зависимого выживания ганглиев заднего корешка спинного мозга цыпленка; и/или ингибирование ФРН-зависимого разрастания аксонов клеток PC 12. Предпочтительно, антитело облегчает боль у субъекта в течение по меньшей мере примерно от одной недели до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от примерно четырех недель до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от примерно восьми недель до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от одной недели до двенадцати недель, или по меньшей мере от четырех недель до двенадцати недель, или по меньшей мере от восьми до двенадцати недель (или по меньшей мере одной недели, или по меньшей мере четырех педель, или по меньшей мере восьми недель, или по меньшей мере двенадцати недель, или от одной до двенадцати недель, или от четырех до двенадцати недель, или от восьми до двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. Предпочтительно, антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, или антитело содержит вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, или антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно. Предпочтительно, антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, или антитело содержит вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2 или антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, или антитело конкурирует за связывание ФРН с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2.

В различных предпочтительных вариантах воплощения настоящее изобретение направлено на создание антител против ФРН, имеющих следующие особенности:

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, и (iii) консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10, при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, и (iii) консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10, при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, и (iii) консервативную область IgG4 человека, включающую мутацию в шарнирной области, при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, и (iii) консервативную область IgG4 человека, включающую мутацию в шарнирной области, при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, и (iii) консервативную область, включающую мутацию в шарнирной области, при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, и (iii) консервативную область, включающую мутацию в шарнирной области, при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10, при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с kd, равной 100 пМ или менее, ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее, и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее, и при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, и (iii) консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10, при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с K_D, равной 100 пМ или менее, ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее.

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, и (iii) консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10, при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с K_D, равной 100 пМ или менее, ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее.

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, и (iii) консервативную область IgG4 человека, включающую мутацию в шарнирной области, при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с K_D, равной 100 пМ или менее, ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее, и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее.

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, и (iii) консервативную область TgG4 человека, включающую мутацию в шарнирной области, при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с kd, равной 100 пМ или менее, ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее, и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее.

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, и (iii) консервативную область, включающую мутацию в шарнирной области, при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с K_D, равной 100 пМ или менее, ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее, и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее.

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, и (iii) консервативную область, включающую мутацию в шарнирной области, при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с K_D, равной 100 пМ или менее, ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее, и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее.

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека включает мутацию, и при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека включает мутацию, и при этом антитело имеет терминальный период полувыведения у яванского макака по меньшей мере 15 дней. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом прлувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель).

В различных вариантах воплощения антитело против ФРН по изобретению может являться, например, химерным, гуманизированным антителом или антителом человека, или антителом, в котором были удалены потенциальные эпитопы Т-клеток.

Другой особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на создание фармацевтической композиции, содержащей антитело против ФРН по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Еще одной особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на создание способа ослабления или ингибирования связанного с ФРН заболевания или состояния у субъекта, а именно способа, включающего введение субъекту антитела против ФРН по изобретению. Неограничивающие примеры связанных с ФРН заболеваний и состояний включают боль при воспалении, послеоперационную боль, невропатическую боль, боль при переломах, боль в суставах при подагре, постгерпетическую невралгию, боль при онкологических заболеваниях, боль при остеоартрите или ревматоидном артрите, ишиалгию, боли, ассоциированные с кризисом серповидно-клеточной анемии, головной болью, дисменореей, эндометриозом, костно-мышечную боль, хроническую боль в нижней части спины, фибромиалгию, растяжения, висцеральную боль, кисты яичника, простатит, цистит, интерстициальный цистит, боль в области послеоперационного рубца, мигрень, невралгию тройничного нерва, боль от ожогов и/или ран, боль, ассоциированную с травмой, боль, ассоциированную с заболеваниями скелетно-мышечной системы, анкилозирующий спондилоартрит, вокругсуставные патологии, боль, вызванную метастазами в кости, боль, вызванную ВИЧ, эритромелалгию или боль, вызванную панкреатитом или камнями в почках. Другие примеры связанных с ФРН заболеваний и состояний включают злокачественную меланому, ксеродерматоз и астму, такую как неконтролируемая астма с тяжелой гиперчувствительностью дыхательных путей, и хронический кашель. В частности, предпочтительные заболевания и состояния для лечения в соответствии со способами по изобретению включают боль при воспалении (в частности, боль, вызванную остеоартритом или ревматоидным артритом), костно-мышечную боль (в частности, хроническую боль в нижней части спины), невропатическую боль (в частности, диабетическую невропатию), боль при онкологических заболеваниях и боль, вызванную метастазами в кости, интерстициальный цистит/ синдром болезненного мочевого пузыря, боль, ассоциированную с хроническим небактериальным простатитом, боль, ассоциированную с эндометриозом и/или фибромами матки и послеоперационную боль.

Антитело может вводиться, например, внутривенно, подкожно (например, с применением шприца-ручки или подкожного имплантата), внутримышечно или внутрисуставно, при этом другие пригодные способы введения описаны в этом документе. Предпочтительно, антитело вводят в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 мг/кг до 3 мг/кг или в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 мг/кг до 30 мг/кг. Антитело может вводиться, например, в дозе, находящейся в диапазоне от примерно 3 мкг/кг до примерно 3000 мкг/кг, при этом предпочтительные дозировки включают от 100 мкг/кг до 300 мкг/кг. В других вариантах воплощения антитело вводят в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 мг/кг до 30 мг/кг, или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 30 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 20 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 10 мг/кг, при этом другие пригодные диапазоны дозировок и доз описаны в этом документе. Дополнительно, могут применяться рецептуры антитела с фиксированной дозой.

Антитело может вводиться отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными фармацевтическими агентами. Например, второй фармацевтический агент, такой как НПВС, анальгетик (например, опиоидный анальгетик), местный анестетик, проводниковая анестезия, фенольная блокада, терапевтическое антитело, противосудорожное средство, антидепрессант, местный капсаицин, стероид или антивирусный агент могут вводиться в комбинации с антителом против ФРН по изобретению. В частности, предпочтительные вторые фармацевтические агенты для комбинированного лечения совместно с антителом по изобретению включают опиоидные анальгетики, такие как морфин и т.п. Другие предпочтительные вторые фармацевтические агенты для комбинированного лечения включают ингибиторы TrkA и ингибиторы протеинкиназы С (РКС).

В предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа ослабления или ингибирования боли у субъекта, а именно, способа, включающего введение субъекту антитела против фактора роста нервов (ФРН), содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10, при этом антитело облегчает боль у субъекта в течение по меньшей мере от четырех до двенадцати недель (или по меньшей мере от одной до двенадцати недель, или по меньшей мере от восьми до двенадцати недель, или от четырех до двенадцати недель, или от одной до двенадцати недель, или от восьми до двенадцати недель, или в течение по меньшей мере одной недели, или по меньшей мере четырех недель, или по меньшей мере восьми недель, или по меньшей мере двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. Предпочтительно, антитело против ФРН содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно. Предпочтительно, антитело против ФРН содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2. Предпочтительно, тип боли выбран из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологических заболеваниях, боли из-за метастазов в кости, интерстициального цистита, синдрома болезненного мочевого пузыря, боли, ассоциированной с хроническим небактериальным простатитом, боли, ассоциированной с эндометриозом, боли, ассоциированной с фибромами матки и послеоперационной боли. Предпочтительно, антитело против ФРН вводят в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 до 3 мг/кг или в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 мг/кг до 30 мг/кг. Предпочтительно, антитело вводят внутривенно или подкожно. Предпочтительно, антитело обладает терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней (или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или по меньшей мере 30 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне от примерно 15 до примерно 30 дней, или в диапазоне от 10 до 40 дней или в диапазоне от 15 до 30 дней).

В другом предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа ослабления или ингибирования связанного с фактором роста нервов (ФРН) заболевания или состояния у субъекта таким образом, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета, а именно, способа, включающего введение субъекту антитела против ФРН, содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека включает мутацию в шарнирной области, и при этом антитело обладает терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней (или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, иж по меньшей мере 30 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне от примерно 15 до примерно 30 дней, или в диапазоне от 10 до 40 дней или в диапазоне от 15 до 30 дней), и при этом антитело вводят в такой дозировке и с такой частотой, чтобы избежать у субъекта возникновения синдрома рикошета. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель). Предпочтительно, консервативная область IgG4 человека содержит мутацию в позиции аминокислоты, соответствующей позиции аминокислоты 108 в ПОСЛ. ID №: 9. Предпочтительно, серии в позиции аминокислоты, соответствующей позиции аминокислоты 108 в ПОСЛ. ID №: 9, заменен на пролин. Предпочтительно, консервативная область IgG4 человека включает аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10. Предпочтительно, антитело против ФРН содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно. Предпочтительно, антитело против ФРН содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2. Предпочтительно, антитело конкурирует за связывание ФРН с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2. Предпочтительно, связанное с ФРН заболевание или состояние является болью, выбранной из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологических заболеваниях, боли из-за метастазов в кости, интерстициального цистита, синдрома болезненного мочевого пузыря, боли, ассоциированной с хроническим небактериальным простатитом, боли, ассоциированной с эндометриозом, боли, ассоциированной с фибромами матки и послеоперационной боли. Предпочтительно, антитело против ФРН вводят в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 до 3 мг/кг или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 30 мг/кг. Предпочтительно, антитело вводят внутривенно или подкожно.

Другой особенностью является то, что изобретение направлено на создание применения антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для применения с целью ослабления или ингибирования связанного с ФРН заболевания или состояния у субъекта. Неограничивающие примеры связанных с ФРН заболеваний и состояний включают те, что перечисленные выше. Предпочтительным связанным с ФРН заболеванием или состоянием является боль. Предпочтительно, тип боли выбран из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологических заболеваниях, боли из-за метастазов в кости, интерстициального цистита, синдрома болезненного мочевого пузыря, боли, ассоциированной с хроническим небактериальным простатитом, боли, ассоциированной с эндометриозом, боли, ассоциированной с фибромами матки и послеоперационной боли.

Еще одной особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на использование антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата, применяемого с целью ослабления или ингибирования боли у субъекта таким образом, чтобы облегчение или ингибирование боли у субъекта длилось в течение по меньшей мере примерно от одной недели до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от примерно четырех недель до примерно двенадцати недель, или по меньшей мере от примерно восьми недель до примерно двенадцати недель (или в течение от одной до двенадцати недель, или от четырех до двенадцати недель, или от восьми до двенадцати недель, или по меньшей мере одной недели, или по меньшей мере двух недель, или по меньшей мере четырех недель, или по меньшей мере восьми недель, или по меньшей мере двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту.

Другой особенностью является то, что изобретение направлено на создание применения антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата, применяемого с целью ослабления или ингибирования связанного с ФРН заболевания или состояния у субъекта таким образом, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета. В частности, антитело вводят в такой дозировке и с такой частотой, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета.

Другой особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на создание молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые цепи и/или легкие цепи антител против ФРН по изобретению, а также векторов (например, экспрессионных векторов), содержащих такие вектора, клеток-хозяев, содержащих такие векторы и способов для экспрессии антител против ФРН с применением клеток-хозяев по изобретению.

Еще одной особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на создание способа ослабления или ингибирования связанного с фактором роста нервов (ФРН) заболевания или состояния у субъекта таким образом, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета. Способ включает введение субъекту антитела против ФРН, содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека включает мутацию (предпочтительно, мутацию в шарнирной области), и при этом антитело обладает терминальным периодом полувыведения у яванского макака по меньшей мере 15 дней, более предпочтительно по меньшей мере 21 день, и при этом антитело вводят в такой дозировке и с такой частотой, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета. В другом варианте воплощения настоящего изобретения антитело обладает терминальным периодом полувыведения у яванского макака в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 22 дней (или 15-22 дней), или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 28 дней (или 15-28 дней), или в диапазоне от примерно 21 дней до примерно 28 дней (или 21-28 дней). В другом варианте воплощения антитело имеет терминальный период полувыведения у крысы по меньшей мере 8 дней. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения, антитело обладает средним терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней (или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или по меньшей мере 30 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне от примерно 15 до примерно 30 дней, или в диапазоне от 10 до 40 дней или в диапазоне от 15 до 30 дней). Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель). Предпочтительные мутации включают те, что описанные выше. Предпочтительные антитела включают те, что имеют последовательности и/или дополнительные функциональные свойства как описано выше. Неограничивающие примеры связанных с ФРН заболеваний и состояний включают таковые, перечисленные выше.

Изобретение также направлено на создание применения антитела протез ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для применения с целью ослабления или ингибирования связанного с ФРН заболевания или состояния у субъекта таким образом, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета.

Наборы, содержащие антитело против ФРН по изобретению, также описаны в этом документе. Например, набор может содержать антитело против ФРН и руководство по применению антитела для лечения связанного с ФРН заболевания или состояния.

Краткое описание графических материалов

На фигуре 1 представлен график, демонстрирующий связывание PG110 с фактором роста нервов (ФРН) человека и отсутствие связывания с нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF) человека, нейротрофином 3 (NT-3) человека или нейротрофином 4 (NT-4) человека, согласно данным ELISA.

На фигуре 2А представлен график, демонстрирующий ингибирование связывания ФРН с рецептором TrkA антителом PG110, согласно данным эксперимента по связыванию радиоактивно меченного лиганда.

На фигуре 2В представлен график, демонстрирующий ингибирование связывания ФРН с рецептором p75^NTR антителом PG110, согласно данным эксперимента по связыванию радиоактивно меченного лиганда.

На фигуре 3А представлен график, демонстрирующий ингибиторный эффект антитела PG110 на пролиферацию клеток TF-1, стимулированных ФРН человека.

На фигуре 3В представлен график, демонстрирующий ингибиторный эффект антитела PG110 на пролиферацию клеток TF-1, стимулированных ФРН крысы.

На фигуре 3С представлен график, демонстрирующий ингибиторный эффект антитела PG110 на пролиферацию клеток TF-1, стимулированных ФРН мыши.

На фигуре 4 представлен график, демонстрирующий эффект лечения антителом PG110 на повреждения кожи у крыс.

Детальное описание изобретения

Изобретение относится к антителам против фактора роста нервов, которые обладают повышенной стабильностью in vivo, что очевидно, например, из неожиданно длительного терминального периода полувыведения у яванских макаков. Антитела по изобретению включают модификацию консервативной области IgG4 человека в составе антитела путем внесения мутации в консервативную область IgG4, предпочтительно в шарнирную область консервативной области.

С целью упрощения понимания настоящего изобретения сначала приводятся определения некоторых терминов. Дополнительные определения изложены в тексте детального описания.

I. Определения

Термины "фактор роста нервов" или "ФРН" используются в этом документе как взаимозаменяемые и включают варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитело, специфичное к ФРН человека, может в некоторых случаях демонстрировать перекрестную реактивность с ФРН видов, отличных от человека. В других вариантах воплощения антитело, специфичное к ФРН человека, может быть полностью специфично к ФРН человека и может не демонстрировать видоспецифичную или иного типа перекрестную реактивность. Термин "ФРН человека" означает последовательность ФРН человека, такую как содержащая аминокислотную последовательность цепи ФРН-р человека, форма предшественника для которой имеет номер доступа в базе Genbank NP_002497, и кодируется нуклеотидной последовательностью с номером доступа в базе Genbank NM 002506.

Последовательность цепи ФРН-Р человека может отличаться от таковой ФРН-Р человека, приведенной в Genbank с номером доступа NP_002497, например, наличием консервативных замен или замен в неконсервативных областях, при этом ФРН-Р человека имеет в существенной степени ту же биологическую функцию, что и ФРН-Р человека из Genbank с номером доступа NP_002497. Термин "ФРН крысы" означает последовательность ФРН крысы, такую как содержащая аминокислотную последовательность цепи ФРН-Р крысы, форма предшественника для которой имеет номер доступа в базе Genbank XP_227525, и кодируется нуклеотидной последовательностью с номером доступа в базе Genbank XP_227525. Термин "ФРН мыши" означает последовательность ФРН крысы, такую как содержащая аминокислотную последовательность цепи ФРН-Р мыши, форма предшественника для которой имеет номер доступа в базе Genbank NP_038637, и кодируется нуклеотидной последовательностью с номером доступа в базе Genbank NM_013609.

Термин "рецептор TrkA", используемый в этом документе означает рецептор для ФРН, также известный специалистам в данной области как тропомиозин-рецепторная киназа А и нейротрофная рецепторная тирозинкиназа 1 типа (NTRK1). Приведенные в качестве неограничивающих примеров последовательности рецептора TrkA человека включают аминокислотные последовательности, приведенные в базе Genbank с номерами доступа NP_0010123 31 (изоформа 1), NP_002520 (изоформа 2) и NP_001007793 (изоформа 3).

Термин "рецептор p75^NTR", используемый в этом документе означает рецептор нейротрофина с молекулярной массой приблизительно 75 кДа, который связывается с ФРН и другими нейротрофинами, рецептор, который описан, например, в работе Bothwell, M. (1996) Science 272:506-507. Указанной в качестве неограничивающего примера последовательностью рецептора p75^NTR человека является аминокислотная последовательность, приведенная в базе Genbank с номером доступа NP_002498, кодируемая нуклеотидной последовательностью, приведенной в базе Genbank с номером доступа NM_002507.

Термин "терминальный период полувыведения", используемый в этом документе в отношении антител против ФРН означает количество времени, необходимое для того, чтобы концентрация антитела, измеряемая в сыворотке субъекта, которому было введено антитело, снизилась наполовину при условии завершения всасывания и распределения антитела. При использовании группы субъектов, в качестве меры терминального периода полувыведения антитела может применяться показатель геометрического среднего терминального периода полувыведения у субъектов.

Термин "фармакологический период полувыведения", используемый в этом документе в отношении антител против ФРН означает среднее количество времени поддержания эффекта лекарственного средства in vivo (среднее время удержания для эффекта лекарственного средства). Его можно вычислить как соотношение площади под кривой эффективности в начальный момент, скорректированной относительно базовой линии, (AUMEC) к площади зависимости накопленного и скорректированного относительно базовой линии эффекта лекарственного средства от времени (площадь под кривой эффективности, AUBC), используя следующую формулу:

При использовании группы субъектов, в качестве меры фармакологического периода полувыведения антитела может применяться показатель геометрического среднего фармакологического периода полувыведения у субъектов.

Термин "мутация в шарнирной области", используемый в этом документе означает мутацию, такую как точечная мутация, замена, вставка или делеция, в шарнирной области консервативного домена иммуно глобулина.

Термин "ингибирование", используемый в этом документе означает статистически значимое снижение биологической активности, в том числе полную блокировку активности. Например, "ингибирование" может означать снижение биологической активности примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%.

Термины "антитело" или "иммуноглобулин", используемые в этом документе в качестве взаимозаменяемых включают целое антитело и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е., "антигенсвязывающую часть") или его единичные цепи, которые сохраняют повышенную стабильность in vivo, как описано в этом документе. "Антитело" содержит по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (обозначаемой в этом документе с помощью аббревиатуры V_H) и консервативной области тяжелой цепи. Консервативная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3 Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (обозначаемой в этом документе с помощью аббревиатуры V_L) и консервативной области легкой цепи. Консервативная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области V_H и V_L могут дополнительно подразделяться на гипервариабельные области, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая область V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Консервативные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами организма = - хозяина, в том числе с различными клетками иммунной системы (например, с эффекторными клетками) и с первым компонентом (Clq) классической системы комплемента.

Термин "моноклональное антитело", используемое в этом документе означает антитело, полученное из популяции в существенной мере однородных антител, т.е., индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций естественного происхождения, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, так как вырабатываются против единичного антигенного сайта. Дополнительно, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые в типичном случае содержат различные антитела, выработанные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело выработано против единичной детерминанты на антигене. Моноклональные антитела могут быть приготовлены с применением способов, известных специалистам в данной области, например, гибридомного способа, как описано в работе Kohler et al. (1975) Nature, 256:495, с помощью трансгенных животных, как описано, например, в работе Lonberg, etal. (1994) Nature 368(6474); 856-859), методов рекомбинантных ДНК (см., например, патент США №4 816 567) или с применением фаговых библиотек антител и способов, описанных, например, в работах Clarkson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al,J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991). Моноклональные антитела включают химерные антитела, антитела человека и гуманизированные антитела и могут являться природными или полученными рекомбинантными способами.

Термин "рекомбинантное антитело" означает антитела, которые приготовлены, экспрессированы, созданы или выделены с применением рекомбинантных способов, такие как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), являющегося трансгенным или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулинов (например, генов иммуноглобулинов человека), или из гибридомы, полученной из такого животного, (б) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (в) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител (например, содержащей последовательности антител человека) с применением фагового дисплея и (г) антитела, приготовленные, экспрессированные созданные или выделенные любыми иными способами, включающими сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов (например, генов иммуноглобулинов человека) с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела могут содержать вариабельные и консервативные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулинов человека гаметического типа. Однако в некоторых воплощениях такие рекомбинантные антитела человека могут подвергать мутагенезу in vitro, и вследствие этого аминокислотные последовательности областей V_H и V_L рекомбинантных антител являются последовательностями, которые хоть и происходят от гаметических последовательностей V_H и V_L человека, могут не существовать в природе в составе набора гаметических антител человека in vivo.

Термин "химерный иммуноглобулин" или антитело означает иммуноглобулин или антитело, у которого вариабельные области имеют происхождение из первого биологического вида, и у которого консервативные области имеют происхождение из второго биологического вида. Химерные иммуноглобулины или антитела могут быть сконструированы, например, путем генетической инженерии, из сегментов генов иммуноглобулинов, принадлежащих разным биологическим видам.

Термин "гуманизированное антитело" или "гуманизированный иммуноглобулин" означает антитело или иммуноглобулин, который содержит по меньшей мере одну гуманизированную цепь иммуноглобулина или антитела (т.е., по меньшей мере одну гуманизированную легкую или тяжелую цепь). Термин "цепь гуманизированного антитела" или "цепь гуманизированного иммуноглобулина" (т.е., "легкая цепь гуманизированного иммуноглобулина" или "тяжелая цепь гуманизированного иммуноглобулина") означает цепь иммуноглобулина или антитела (т.е., легкую или тяжелую цепь, соответственно), которая включает вариабельную область, содержащую вариабельную каркасную область, в существенной степени происходящую из иммуноглобулина или антитела человека, и области, определяющие комплементарность (CDR) (например, по меньшей мере одну CDR, предпочтительнее две CDR, более предпочтительно три CDR), в существенной степени происходящие из иммуноглобулина или антитела, принадлежащего виду, отличному от человека, и дополнительно включает консервативные области (например, по меньшей мере одну консервативную область или ее часть, в случае легкой цепи, и предпочтительно три консервативные области в случае тяжелой цепи). Термин "гуманизированная вариабельная область" (например, "гуманизированная вариабельная область легкой цепи" или "гуманизированная вариабельная область тяжелой цепи") означает вариабельную область, включающую вариабельную каркасную область, в существенной степени происходящую из иммуноглобулина или антитела человека, и области, определяющие комплементарность (CDR), в существенной степени происходящие из иммуноглобулина или антитела, принадлежащих виду, отличному от человека.

Предполагается, что термин "антитело человека", используемый в этом документе включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых и каркасная область, области CDR происходят из последовательностей иммуноглобулинов гаметического типа человека, как описано, например, в работе Kabat et al. (См. Kabat, et al. (1991) Sequences of pro ferns of Immmological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Кроме того, если антитело содержит консервативную область, консервативная область также происходит из последовательностей иммуноглобулинов гаметического типа человека. Антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов гаметического типа человека (например, мутации, введенные с применением случайного или сайт-специфичного мутагенеза in vitro или путем соматических мутаций in vivo). Однако подразумевается, что термин "антитело человека", используемый в этом документе не включает антитела, в которых последовательности CDR, происходящие из антител гаметического типа, принадлежащих другому виду млекопитающих, такому как мышь, были внедрены в каркасные последовательности антитела человека.

"Выделенное антитело" при использовании в этом документе означает антитело, в существенной степени свободное от других антител, обладающих иными антигенными специфичностями (например, выделенной антитело, которое специфично связывается с ФРН, в существенной степени свободное от антител, которые специфично связываются с антигенами, отличными от ФРН). Кроме того, выделенное антитело в типичном случае в существенной степени свободно от другого клеточного материала и/или химических соединений.

При использовании в этом документе термины "специфичное связывание", "специфично связывается", "селективное связывание" и "селективно связывается" означают, что антитело или его антигенсвязывающая часть демонстрируют существенную аффинность к определенному антигену или эпитопу и, обычно, не демонстрируют существенную перекрестную реактивность в отношении других антигенов и эпитопов. "Существенное" или предпочтительное связывание включает связывание с аффинностью по меньшей мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ М^-1 или 10¹⁰ М^-1. Более предпочтительными являются аффинности более чем 10⁷ M^-1, предпочтительно более чем 10⁸ М^-1. Предполагается, что значения, являющиеся промежуточными по отношению к указанным в этом документе, находятся в пределах объема настоящего изобретения, и предпочтительная аффинность связывания может быть указана как диапазон аффинностей, например, от 10⁶ до 10¹⁰ М^-1, предпочтительно от 10⁷ до 10¹⁰ М^-1, более предпочтительно от 10⁸ до 10¹⁰ М^-1. Антитело, которое "не демонстрирует существенную перекрестную реактивность" - это антитело, которое не будет в существенной степени связываться с нежелательным объектом (например, нежелательным белковым объектом). Специфичное или селективное связывание может быть определено с применением любого признанного в данной области способа для определения такого связывания, включая, например, анализ графиков Скэтчарда и/или анализ конкурентного связывания.

Предполагается, что термин "K_D", используемый в этом документе означает равновесную константу диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген или аффинности антитела к антигену. В одном из вариантов воплощения, антитело по настоящему изобретению связывается с антигеном (например, ФРН) с аффинностью (K_D), равной примерно 100 пМ или менее (т.е., или лучше) (например, примерно 90 пМ, или примерно 80 пМ, или примерно 70 пМ, или примерно 60 пМ, или примерно 50 пМ, или примерно 40 пМ, или примерно 30 пМ), согласно измерениям, проведенным с применением анализа методом поверхностного плазменного резонанса или анализа клеточного связывания. В предпочтительном варианте воплощения антитело связывается с ФРН с аффинностью (K_D), находящейся в диапазоне примерно 25-35 пМ.

Предполагается, что термин "K_ass", используемый в этом документе означает константу скорости ассоциации для ассоциации антитела в комплекс антитело/антиген.

Предполагается, что термин "K_diss", используемый в этом документе означает константу скорости диссоциации для диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Термин "IC₅₀", используемый в этом документе означает концентрацию антитела, которая ингибирует ответ, как при анализе in vitro, так и при анализе in vivo, до уровня, равного 50% от максимального ингибиторного ответа, т.е., среднего между максимальным ингибиторным ответом и ответом при отсутствии обработки.

Предполагается, что термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый в этом документе включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительно является двуцепочечной ДНК. Предполагается, что термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", используемый в этом документе в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или части антител (например, V_H, V_L, CDR3), связывающиеся с ФРН, означает молекулу нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело или часть антитела, свободна от других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела, которые связываются с антигенами, отличными от ФРН, при этом эти другие последовательности могут в природе фланкировать данную нуклеотидную последовательность в геномной ДНК человека.

Термин "функционально присоединенный" означает, что последовательность нуклеиновой кислоты расположили таким образом, что возникла функциональная связь этой последовательности с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для сигнальной последовательности или секреторной лидерной последовательности функционально присоединена к ДНК для полипептида, если она экспрессируется в виде пре-белка, который участвует в секреции полипептида;

промотор или энхансер функционально присоединен к кодирующей последовательности, если он оказывает влияние на транскрипцию последовательности;

или сайт связывания рибосомы функционально присоединен к кодирующей последовательности, если он расположен таким образом, чтобы способствовать трансляции. В общем случае, "функционально присоединенный" означает, что соединенные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторной лидерной последовательности, смежными и находящимися в одной рамке считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Присоединение достигается с помощью лигирования по стандартным рестрикционным сайтам. Если такие сайты отсутствуют, применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии со стандартными способами. Нуклеиновая кислота "функционально присоединена", когда ее расположили таким образом, что возникла функциональная связь этой последовательности с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер, является функционально присоединенным к кодирующей последовательности, если он оказывает влияние на транскрипцию последовательности. По отношению к последовательностям, регулирующим транскрипцию, функционально присоединенные означает, что соединенные последовательности ДНК являются смежными и, если требуется соединить две кодирующие белок области, они - смежные и находятся в одной рамке считывания. По отношению к последовательностям областей переключения, термин функционально присоединенный указывает, что последовательности способны оказывать влияние на рекомбинацию на этапе переключения.

Предполагается, что термин "вектор", используемый в этом документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, к которой она была присоединена. Одним из типов вектора является "плазмида", что означает замкнутую двуцепочечную ДНК-петлю, в состав которой могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Еще одним типом векторов является вирусный вектор, при этом дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их внедрили (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после внедрения в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, к которым они были функционально присоединены. Такие векторы в этом документе называют "рекомбинантными экспрессионными векторами" (или просто "экспрессионными векторами"). В общем случае, экспрессионные векторы, полезные для применения в методиках рекомбинантных ДНК, часто имеют форму плазмид. Термины "плазмида" и "вектор" могут использоваться как взаимозаменяемые. Однако подразумевается, что настоящее изобретение включает такие иные формы экспрессионных векторов, как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденосателлитные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Подразумевается, что термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин"), используемый в этом документе означает клетку, в которую был внедрен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что предполагается, что такие термины относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но и к потомкам такой клетки. Из-за того, что некоторые модификации могут возникать в последующих поколениях в результате мутаций или влияния факторов внешней среды, такие потомки могут, фактически, не быть идентичны родительской клетке, но тем не менее остаются включенными в объем термина "клетка-хозяин" при использовании в этом документе.

Термины "лечение", "обработка" и "лечить", используемые в этом документе относятся к терапевтическим или профилактическим способам, описанным в этом документе. Способы "лечения" включают введение субъекту антитела по настоящему изобретению, например, субъекту со связанным с ФРН заболеванием или состоянием, с целью профилактики, излечения, отсрочки, снижения тяжести или уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов заболевания или состояния.

Термин "связанное с ФРН заболевание или состояние", используемый в этом документе означает заболевание или состояние, в котором активность ФРН участвует в возникновении одного или нескольких симптомов заболевания или состояния, ассоциирована с ними или опосредует или способствует им.

Используемый в этом документе термин "субъект" включает любого человека или представителя вида животных, отличного от человека. В одном из вариантов воплощения субъект является человеком. Термин "животное, отличное от человека" включает всех позвоночных, например, млекопитающих или не млекопитающих, таких как все приматы, кроме человека, овца, собака, корова, куры, амфибии, рептилии у т.д.

Используемый в этом документе термин "синдром рикошета" означает пониженную эффективность связывающих ФРН агентов, таких как антитело против ФРН, наблюдаемую у субъекта после начального периода эффективности после разового или повторного введения. Например, лечение с применением антитела против ФРН может первоначально ослабить боль, например, возникшую из-за воспаления или повреждения нерва или иной этиологии, после чего следует период пониженной анальгезирующей эффективности, во время которого боль со временем становится почти столь же интенсивной или более интенсивной, чем до лечения. Еще в одном примере антитело против ФРН может демонстрировать начальную эффективность у субъекта в течение некоторого периода времени после разового или повторного введения, такого как период длиной одна неделя после введения (например, дни 1-7 после введения), после чего следует период пониженной эффективности, такой как период от 1 до 2 недель после введения (например, дни 7-14 после введения). За периодом "синдрома рикошета" может следовать период восстановления эффективности антитела против ФРН. Например, может наблюдаться двухфазный профиль анальгезии после разового или повторного введения антитела против ФРН, с промежуточным периодом пониженной эффективности или даже чрезмерно повышенного болевого ощущения. Этот синдром рикошета можно оценить, например, в ходе клинических исследований боли, в экспериментальных моделях боли и/или других моделях эффективности подавления ФРН. Синдром рикошета может быть ассоциирован, например, с усилением боли у субъекта и/или более выраженными нежелательными явлениями (такими как аномальная чувствительность, в диапазоне от аллодинии до дизестезии, парестезии и гипер- или гипоэстезии) во время периода синдрома рикошета. Не ограничиваясь каким-то одним механизмом, синдром рикошета может быть вызван изменением экспрессии ФРН, изменением экспрессии или передачи сигнала рецепторов TrkA или р75 или любым другим механизмом, который приводит к кратковременному снижению эффективности после разового или повторного введения антитела против ФРН после начального периода эффективности.

Различные особенности настоящего изобретения описаны более подробно в следующих подразделах.

II. Антитела по изобретению

А. Повышенная стабильность in vivo

Антитела против ФРН по изобретению характеризуются наличием повышенной стабильности in vivo, что очевидно из длительного терминального периода полувыведения, наблюдаемого in vivo. He ограничиваясь каким-то одним механизмом, полагают, что удлиненный терминальный период полувыведения антитела является результатом пониженной скорости клиренса антитела, а не повышения объема распределения антитела. Антитела по изобретению содержат консервативную область IgG4 человека, которая содержит мутацию. Предпочтительной мутацией является мутация в шарнирной области. Предпочтительно, мутация в шарнирной области содержит мутацию серина в позиции аминокислоты 108 в последовательности ID №: 9 (при этом ПОСЛ. ID №: 9 демонстрирует аминокислотную последовательность дикого типа консервативной области IgG4 человека). Более предпочтительно, мутация в шарнирной области содержит мутацию с заменой серина в позиции аминокислоты 108 в последовательности ID №: 9 на пролин. В предпочтительном варианте воплощения консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10.

Антитело против ФРН по изобретению демонстрирует неожиданно длинный терминальный период полувыведения, такой как терминальный период полувыведения у яванского макака по меньшей мере 15 дней и в типичном случае - в диапазоне от примерно 15 до примерно 22 дней (или в диапазоне от 15 до 22 дней), или в диапазоне от примерно 15 дней до 28 дней (или в диапазоне от 15 до 28 дней), или в диапазоне от примерно 21 дня до примерно 28 дней (или в диапазоне от 21 до 28 дней). Это стабилизированное антитело против ФРН также демонстрирует терминальный период полувыведения у крыс по меньшей мере 8 дней, в типичном случае - в диапазоне от примерно 8 до примерно 9 дней (или в диапазоне от 8 до 9 дней). Как описано более подробно в примере 4, PG110, антитело против ФРН по изобретению, демонстрирует средний терминальный период полу-выведения в яванских макаках по меньшей мере 15 дней и, в типичном случае, еще более продолжительный. Например, в исследовании на яванских макаках наблюдали средний терминальный период полувыведения в диапазоне от примерно 15 до примерно 22 дней. В другом исследовании на яванских макаках наблюдали средний терминальный период полувыведения в диапазоне от примерно 21 до примерно 28 дней. Дополнительно, PG110 демонстрирует средний терминальный период полувыведения у крыс от примерно 8 до примерно 9 дней. Дополнительно, так как специалистам в данной области известно, что терминальный период полувыведения для IgG у человека примерно в два раза больше, чем у обезьян, предсказано, что антитела против ФРН по изобретению, такие как PG110, будут обладать терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней, или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или, более предпочтительно, по меньшей мере 30 дней или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней (или в диапазоне 10-40 дней), или в диапазоне от примерно 15 до примерно 30 дней (или в диапазоне 15-30 дней). Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель). Как более подробно описано в примере 8, было показано, что антитело против ФРН по изобретению имеет средний фармакологический период полувыведения у человека, попадающий в указанные выше диапазоны.

Терминальный период полувыведения PG110 у яванских макаков существенно длиннее, чем период полувыведения, о котором сообщали специалисты в данной области для других антител IgG4 у яванских макаков. Например, сообщалось о периоде полувыведения примерно 40-90 часов (примерно 1,6-3,8 дней) у яванских макаков для CDP571, антитела IgG4 против TNF (см. Stephens, S. et al. (1995) Immunol. 85:668-674). Схожим образом, сообщалось о периоде полувыведения примерно 3 дня у яванских макаков для натализумаба, антитела IgG4 против интегрина (см. Refusal CHMP Assessment Report for Natalizumab, European Medicines Agency, London, 15 November 2007, Doc. Ref. EMEA/CHMP/8203/2008).

Предпочтительной мутацией в шарнирной области, применяемой в изобретении, является замена серина на пролин в позиции 108 в ПОСЛ. ID №: 9. Эта мутация была описана ранее специалистами в данной области (см. Angal, S. et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108), и, как сообщалось, она делает невозможной гетерогенность молекул IgG4, в частности, образование полумолекул антител, содержащих одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Соответственно, замена на аминокислоту, отличную от пролина, в позиции 108 ПОСЛ. ID №: 9 также включена в объем настоящего изобретения, при этом замена вызывает тот же эффект, что и замена Ser на Pro, в предотвращении гетерогенности молекул IgG4 (например, образования полумолекул антител). Способность мутации в положении 108 предотвращать гетерогенность молекул IgG4 можно оценить, как описано в работе Angal et al. (1993), см. выше.

Вдобавок к этому или в качестве варианта, была описана модификация в позиции 108 ПОСЛ. ID №: 9, отличная от мутации в шарнирной области IgG, которая повышала аффинность взаимодействия FcRn-IgG, что приводило к увеличению периода полувыведения модифицированного IgG. Примеры таких дополнительных иди альтернативных модификаций включают мутации по одному или нескольким остаткам консервативных областей IgG, соответствующим: Thr250, Met252, Ser254, Thr256, Thr307, Glu308, Met428, His433 и/или Asn434 (как дополнительно описано в работах Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Petkova, S.B. ef al. (2006) Int. Immunol. 18:17591769; Hinton, P.R. et al. (2004)./. Biol. Chem. 279:6213-6216; Kamei, D.T. et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:748-760; Vaccaro, C. et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:1283-1288; Hinton, P.R. etal. (2006) J. Immunol. 176:346-356).

Дополнительно, в качестве альтернативы мутациям в шарнирной области, были описаны другие стабилизирующие модификации консервативной области lgG4. Например, в других вариантах воплощения мутация консервативной области TgG4 человека включает замену области СН3 из lgG4 на область СН3 из IgGI, замену областей СН2 и СН3 из lgG4 на области СН2 и СН3 из IgG 1 или замену аргинина в позиции 409 консервативной области lgG4 (в соответствии с нумерацией по Kabat) на лизин, как дополнительно описано в публикации патента США 20080063635. В других вариантах воплощения мутация консервативной области TgG4 человека включает замену Arg409, Phe405 или Lys370 (в соответствии с нумерацией по Kabat), такую как замена Arg409 на Lys, Ala, Thr, Met или Leu, или замена Phe405 на Ala, Val, Gly или Leu, как дополнительно описано в публикации РСТ WO 2008/145142.

Требуемая мутация может быть внесена в домен консервативной области lgG4 человека с применением стандартных методик рекомбинантных ДНК, таких как сайт-направленный мутагенез или опосредованный ПЦР мутагенез нуклеиновой кислоты, кодирующей консервативную область lgG4 человека. Дополнительно, ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела, может быть вставлена в экспрессионный вектор, кодирующий мутантную консервативную область lgG4 человека, таким образом, чтобы вариабельная область и консервативная область были функционально связаны, в результате чего создается вектор, кодирующий полноразмерную тяжелую цепь иммуноглобулина, в которой консервативная область является мутантной консервативной областью lgG4 человека. После этого экспрессионный вектор можно применять для экспрессии полноразмерной тяжелой цепи иммуноглобулина с помощью стандартных способов экспрессии рекомбинантных белков. Например, антитело против ФРН по изобретению может быть сконструировано, как дополнительно подробно описано в примере 1.

Терминальный период полувыведения антитела можно определить с применением стандартных способов, известных специалистам в данной области. Например, после введения антитела субъекту (например, яванскому макаку, крысе линии Спрейг-Даули), могут быть получены пробы крови в различных временных точках после введения и определена концентрация антитела в сыворотке из проб крови с применением известных специалистам в данной области методов определения концентрации антител (таких как анализ ELISA). Вычисление терминального периода полувыведения антитела можно проводить с применением известных фармакокинетических методов, например, с помощью компьютерной системы и программного обеспечения, созданных для вычисления фармакокинетических параметров (неограничивающим примером которых является система для фармакокинетического анализа компании SNBL USA с программным обеспечением WinNonlin).

В. Вариабельные области антитела

Предпочтительными вариабельными областями антитела для применения в антителе против ФРН по изобретению являются вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела PG110. Вариабельная область тяжелой цепи PG110 показана в ПОСЛ. ID №: 1 и вариабельная область легкой цепи PG110 показана в ПОСЛ. ID №: 2. Соответственно, в одном из вариантов воплощения антитело против ФРН по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1. В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению содержит вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2. В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2.

Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи PG110 (вариабельная и консервативная области) показана в ПОСЛ. ID №: 13. Эта тяжелая цепь может быть приготовлена из предшественника тяжелой цепи, который содержит лидерную или сигнальную последовательность, такого как аминокислотная последовательность, показанная в ПОСЛ. ID №: 12. Предшественник тяжелой цепи с ПОСЛ. ID №: 12 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в ПОСЛ. ГО№:11.

Полноразмерная аминокислотная последовательность легкой цепи PG110 (вариабельная и консервативная области) показана в ПОСЛ. ID №: 16. Эта легкая цепь может быть приготовлена из предшественника легкой цепи, который содержит лидерную или сигнальную последовательность, такого как аминокислотная последовательность, показанная в ПОСЛ. ID №: 15. Предшественник легкой цепи с ПОСЛ. ID №: 15 кодируется нуклеотидной последовательностью, показанной в ПОСЛ. ID №: 14.

Соответственно, в другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, содержащего тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 13, при этом антитело имеет период полувыведения из сыворотки у яванского макака по меньшей мере 15 дней. В другом варианте воплощения настоящего изобретения период полувыведения из сыворотки у яванского макака может находиться в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 22 дней (или в диапазоне 15-22 дней). В другом варианте воплощения период полувыведения из сыворотки у крысы может составлять по меньшей мере 8 дней, или находиться в диапазоне от примерно 8 дней до примерно 9 дней (или в диапазоне 8-9 дней). В еще одном варианте воплощения период полувыведения из сыворотки у человека может составлять по меньшей мере 10-30 дней, или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 40 дней, или находиться в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней (или в диапазоне 10-40 дней), или в диапазоне от 15 до 30 дней (или в диапазоне 15-30 дней). Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель). Предпочтительно, тяжелую цепь кодирует нуклеотидная последовательностью ПОСЛ. ID №: 11. Предпочтительно, легкая цепь антитела включает аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 16. Предпочтительно, легкую цепь кодирует нуклеотидная последовательностью ПОСЛ. ID №: 14.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, содержащего тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 13 и легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 16.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, содержащего тяжелую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью ПОСЛ. ID №: 11, и легкую цепь, кодируемую нуклеотидной последовательностью ПОСЛ. ID №: 14.

С учетом того, что специфичность связывания PG110 обеспечивают области, определяющие комплементарность (CDR) вариабельного домена, в другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению содержит области CDR тяжелой цепи PG110, легкой цепи PG110 или обеих цепей. CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи PG110 показаны в ПОСЛ. ID. №№: 3, 4 и 5, соответственно. CDR 1, 2 и 3 легкой цепи PG110 показаны в ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно. Соответственно, в одном из вариантов воплощения антитело против ФРН по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно. В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению содержит вариабелъную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно. В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, и содержит вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению может содержать вариабельные области тяжелой и легкой цепей, включающие аминокислотные последовательности, гомологичные вариабельным областям тяжелой и/или легкой цепей PG110, и при этом антитела сохраняют повышенную стабильность in vivo, демонстрируемую PG110. Например, вариабельная область тяжелой цепи антитела против ФРН может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична, более предпочтительно по меньшей мере на 97% гомологична или еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% гомологична аминокислотной последовательности ПОСЛ. ID №: 1. Вариабельная область легкой цепи антитела против ФРН может содержать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% гомологична, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологична, более предпочтительно по меньшей мере на 97% гомологична или еще более предпочтительно по меньшей мере на 99% гомологична аминокислотной последовательности ПОСЛ. ID №: 2.

При использовании в этом документе процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями эквивалентен проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией от количества идентичных позиций, общих для обеих последовательностей (т.е., % гомологии = количество идентичных позиций/суммарное количество позиций ×100), с учетом количества пропусков и длины каждого пропуска, которые необходимо внести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно проводить с применением математического алгоритма. Например, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с применением алгоритма, разработанного Е. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), который был использован в программе ALIGN (версия 2.0), с применением матрицы сравнения аминокислотных остатков РАМ120, штрафа за длину пропуска, равного 12, и штрафа за длину пропуска, равного 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с применением алгоритма, предложенного Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), который использован в программе GAP в составе пакета программного обеспечения GCG (доступного по адресу http://www.gcg.com), с применением матрицы Blossum 62 или матрицы РАМ250, штрафа за пропуск, равного 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и штрафа за длину, равного 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению может содержать вариабельные области тяжелой и легкой цепей, включающие аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепей PG110, но при в последовательность(и) были внесены одна или несколько консервативных замен, хотя антитело сохраняет повышенную стабильность in vivo, демонстрируемую PG110. Например, вариабельная область тяжелой цепи антитела против ФРН может содержать аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ПОСЛ. ID №: 1, за исключением 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен по сравнению с ПОСЛ. ID №: 1. Вариабельная область легкой цепи антитела против ФРН может содержать аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности ПОСЛ. ID №: 2, за исключением 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен по сравнению с ПОСЛ. ID №: 2.

Предполагается, что при использовании в этом документе термин "консервативная аминокислотная замена" означает аминокислотные модификации, которые не влияют или не изменяют существенно параметры связывания или стабильности антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Такие консервативные модификации включают аминокислотные замены, вставки и делеции. Модификации могут быть введены в антитело по настоящему раскрытию с применением стандартных методик, известных специалистам в данной области, таких как сайт-направленный мутагенез и опосредованный ПНР мутагенез. Консервативными аминокислотными заменами являются такие аминокислотные замены, при которых данный аминокислотный остаток заменяется на аминокислотный остаток, имеющий схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожую боковую цепь, определены в соответствующей области знаний. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), разветвленными у бета-атома углерода боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, ристидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков в составе вариабельных областей PG110 могут быть заменены на другие аминокислотные остатки из того же семейства, выделенного на основании свойств боковой цепи, и измененное антитело может быть испытано на сохранение функции с применением методов функционального анализа, описанных в этом документе.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению содержит антигенсвязывающие области (т.е., вариабельные области), которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело PG110, или которые перекрестие конкурируют с PG110 за связывание с ФРН. Соответственно, в одном из вариантов воплощения антитело против ФРН по изобретению конкурирует за связывание с ФРН с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2.

Такие перекрестно конкурирующие антитела можно идентифицировать на основании их способности перекрестно конкурировать с PG110 при стандартном анализе связывания с ФРН. Например, можно применять стандартный анализ ELISA, в котором рекомбинантный белок ФРН (например, ФРН-Р человека) иммобилизован на планшете, одно из антител флуоресцентно меченное, и оценивается способность немеченых антител конкурентно подавлять связывание меченого антитела. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом для оценки способности антител к перекрестной конкуренции можно применять BIAcore-анализ. Пригодные способы анализа связывания, которые могут применяться для испытания способности антитела конкурировать за связывание с ФРН с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, дополнительно подробно описаны в примере 2.

В других вариантах воплощения антитело против ФРН по изобретению демонстрирует одно или несколько функциональных свойств антитела PG110. Например, антитело против ФРН по изобретению может демонстрировать одно или несколько из следующих функциональных свойств:

а) связывается с ФРН человека, но не связывается с нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF) человека, нейротрофином 3 (NT-3) человека или нейротрофином 4 (NT-4) человека;

б) связывается с ФРН человека или крысы с kd, равной 100 пМ или менее;

в) ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR;

г) ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1;

д) ингибирует ФРН-зависимое выживание ганглиев заднего корешка спинного мозга цыпленка;

е) ингибирует ФРН-зависимое разрастание аксонов клеток PC 12.

Эти функциональные свойства можно оценить с применением анализа in vitro, подробно изложенных в примерах 2 и 3. По отношению к специфичному связыванию антитела к ФРН человека при использовании в этом документе термин "не связывается с нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF), нейротрофином 3 (NT-3) человека или нейротрофином 4 (NT-4) человека" означает, что наблюдаемый количественный показатель связывания антитела с BDNF, NT-3 или NT-4 при стандартном анализе связывания (например, ELISA или другой пригодный метод анализа in vitro, как описано в примерах) сопоставим с фоновым уровнем связывания (например, для контрольного антитела), например, с превышением уровня фона не более чем в 2 раза, или связывание с BDNF, NT-3 или NT-4 составляет менее 5% при сравнении со связыванием с ФРН человека (при этом уровень связывания с ФРН человека устанавливают в качестве 100% связывания).

В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против фактора роста нервов (ФРН), содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10 (или при этом консервативная область IgG4 человека содержит мутацию серина в позиции аминокислоты 108 в ПОСЛ. ID №: 9, предпочтительно замену серина на пролин в позиции 108), и при этом антитело связывается с ФРН человека или крысы с K_D, равной 100 пМ или менее (или, в соответствии с другим вариантом, с K_D, равной 300 пМ или менее, 200 пМ или менее, 150 пМ или менее, 75 пМ или менее или 50 пМ или менее), ингибирует связывание ФРН с TrkA или p75^NTR с IC₅₀, равной 250 пМ или менее (или, в соответствии с другим вариантом, с IC₅₀, равной 500 пМ или менее, 400 пМ или менее, 300 пМ или менее или 200 пМ или менее), и ингибирует ФРН-зависимую пролиферацию клеток TF-1 с IC₅₀, равной 50 нг/мл или менее (или, в соответствии с другим вариантом, с IC₅₀, равной 150 нг/мл или менее, 100 нг/мл или менее, 75 нг/мл или менее или 40 нг/мл или менее), Предпочтительно, антитело обладает средним терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней, или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или по меньшей мере 30 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней (или в диапазоне 10-40 дней), или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 30 дней (или в диапазоне 15-30 дней). Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может обладать средним фармакологическим периодом полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель (или в диапазоне от четырех до шести недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до семи недель (или в диапазоне от четырех до семи недель), или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель (или в диапазоне от четырех до восьми недель). Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может демонстрировать средний терминальный период полувыведения у яванского макака по меньшей мере 15 дней и в типичном случае - в диапазоне от примерно 15 до примерно 22 дней (или в диапазоне от 15 до 22 дней), или в диапазоне от примерно 15 дней до 28 дней (или в диапазоне от 15 до 28 дней), или в диапазоне от примерно 21 дня до примерно 28 дней (или в диапазоне от 21 до 28 дней). Дополнительно или в соответствии с другим вариантом антитело может демонстрировать терминальный период полувыведения у крыс по меньшей мере 8 дней, в типичном случае - в диапазоне от примерно 8 до примерно 9 дней (или в диапазоне от 8 до 9 дней). Антитело может дополнительно демонстрировать одно или несколько добавочных функциональных свойств, таких как связывание с ФРН человека, но отсутствие связывания с нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF) человека, нейротрофином 3 (NT-3) человека или нейротрофином 4 (NT-4) человека;

ингибирование ФРН-зависимого выживания ганглиев заднего корешка спинного мозга цыпленка; и/или ингибирование ФРН-зависимого разрастания аксонов клеток PC 12. Предпочтительно, антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере от примерно одной недели до примерно двенадцати недель после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. Предпочтительно, антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, и антитело содержит вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, и антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID. №№: 6, 7 и 8, соответственно. Предпочтительно, антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, или антитело содержит вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2 или антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2, или антитело конкурирует за связывание ФРН с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению не вызывает синдром рикошета при введении субъекту (например, антитело вводят в такой дозировке и с такой частотой, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета). О синдроме рикошета, при котором антитело против ФРН демонстрирует пониженную эффективность у субъекта после начального периода эффективности после разового или повторного введения, сообщалось в ходе как исследований на модельных животных, так и клинических исследований других антител против ФРН. Например, о таком эффекте, названном "феноменом рикошета", сообщалось для антител против ФРН крысы в модели хронического сдавливания (CCI) на крысах (Ro, L-S. et al. (1999) Pain 79:265-274). Дополнительно, сообщалось о клинических исследованиях боли с применением антитела против ФРН танезумаб (также известного как RN624, Е3, CAS регистр.№88026657-9), в которых период повышенного проявления нежелательных явлений, таких как чувствительность к прикосновению и чувство покалывания, наблюдался после начального анальгезирующего периода (см. презентацию доклада Hefti, Franz F., Rinat Neuroscience, LSUHSC, Shreveport, Louisiana, сделанного 26 сентября 2006 г.) Не ограничиваясь каким-то одним механизмом, полагают, что продолжительный терминальный период полувыведения антител против ФРН по изобретению позволяет им избежать индукции синдрома рикошета. Таким образом, другие преимущества антител против ФРН по изобретению включают более стабильную и продолжительную активность in vivo, по сравнению с другими прототипными антителами против ФРН. С учетом продолжительного терминального периода полувыведения антител против ФРН по изобретению, можно применять более низкие дозировки (по сравнению с другими антителами против ФРН), и антитело можно применять с более частыми интервалами, если это необходимо, таким образом, дозировки и режимы лечения могут быть выбраны так, что у субъекта не возникает синдром рикошета.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению способно облегчать боль у субъекта в течение длительного периода, например, антитело способно облегчать боль в течение по меньшей мере от примерно одной недели до примерно двенадцати недель (или в течение от одной недели до двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В одном из вариантов воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно одна неделя (или по меньшей мере одна неделя) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно две недели (или по меньшей мере две недели) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно четыре недели (или по меньшей мере четыре недели) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно восемь недель (или по меньшей мере восемь недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно двенадцать недель (или по меньшей мере двенадцать недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере от примерно четырех недель до примерно двенадцати недель (или от четырех недель до двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере от примерно восьми недель до примерно двенадцати недель (или от восьми недель до двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту.

Способность антитела облегчать боль у субъекта можно оценить с применением методов анализа, принятых в данной области. Пригодные модели на животных для оценки длительности облегчения боли антителами против ФРН описаны, например, в публикации РСТ №WO 2006/131951 и публикации патента США 20080182978. Неограничивающие примеры таких моделей на животных включают модель невропатической боли, вызванной хроническим сдавливанием седалищного нерва, модель послеоперационной боли, включающая рассечение передней лапы, модель боли при ревматоидном артрите, включающая артрит, индуцированный полным адъювантом Фрейнда (CFA), и модели боли при онкологическом заболевании, такие как описаны в работах Halvorson, K.G. et al. (2005) Cancer Res. 65:9426-9435 и Sevcik, М.А. et al. (2005) Pain 115:128-141. Дополнительно, облегчение боли можно оценивать клинически у человека, и длительность облегчения боли можно определить на основании сообщений пациента(ов), получающих лечение антителом против ФРН, о степени боли.

В других вариантах воплощения антитело против ФРН по изобретению может содержать вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела против ФРН, описанного специалистами в данной области. Например, вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи антитела против ФРН, описанного в публикации РСТ №WO 2001/78698, публикации РСТ №WO 2001/64247, публикации РСТ №WO 2002/096458, публикации РСТ №WO 2004/032870, РСТ публикации РСТ №WO 2004/058184, публикации РСТ №WO 2005/061540, публикации РСТ №WO 2005/019266, публикации РСТ №WO 2006/077441, публикации РСТ №WO 2006/131951, публикации РСТ №WO 2006/110883, публикации РСТ №WO 2009/023540, патенте США №7 449 616;

публикации патента США №US 20050074821, публикации патента США №US 20080033157, публикации патента США №US 20080182978 или публикации патента США №US 20090041717, могут применяться в антителе против ФРН по изобретению.

В других вариантах воплощения антитело против ФРН по изобретению может содержать вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела против ФРН, которое приготовлено с применением стандартного, известного специалистам в данной области, способа получения моноклональных антител, такого как стандартный способ гибридизации соматических клеток, описанный в работе Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495 для создания моноклональных антител, не принадлежащих человеку (антител, которые после этого могут быть гуманизированы), а также способов с применением библиотек в формате фагового дисплея или способов с применением трансгенных животных, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека. Способы с применением библиотек в формате фагового дисплея для отбора антител описаны, например, в работах McCafferty et al, Nature, 348:552-554 (1990), Clarkson et al. Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al, J. MolBiol, 222:581-597 (1991) и Hoet et al (2005) Nature Biotechnology 23, 344-348; патентах США №№5 223 409; 5 403 484 и 5 571 698, принадлежащих Ladner et al; патентах США №№5 427 908 и 5 580 717, принадлежащих Dower et al; патентах США №№5 969 108 и 6 172 197, принадлежащих McCafferty et al; и патентах США №№5 885 793; 6 521 404; 6 544 731; 6 555 313; 6 582 915 и 6 593 081, принадлежащих et al. Способы применения трансгенных животных, экспрессирующих гены иммуноглобулинов человека, для получения антител описаны, например, в работах Lonberg, etal. (1994) Nature 368(6474):856-859; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. NY. Acad. Sci. 764:536-546; патентах США №№5 545 806; 5 569 825; 5 625 126; 5 633 425; 5 789 650; 5 877 397; 5 661 016; 5 814 318; 5 874 299 и 5 770 429; все принадлежат Lonberg и Кау; патенте США №5 545 807, принадлежащем Surani et al, публикациях РСТ №№WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 и WO 99/45962, все принадлежат Lonberg и Kay; публикации РСТ WO 02/43478, принадлежащей Ishida et al, патентах США №№5 939 598; 6 075 181; 6 114 598; 6 150 584 и 6 162 963, принадлежащих Kucherlapati et al.

В различных вариантах воплощения антитело против ФРН по изобретению может являться химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом человека. Дополнительно, антитело может быть антителом, в котором были удалены потенциальные эпитопы Т-клеток. Способы удаления потенциальных эпитопов Т-клеток для снижения потенциальной иммуногенности антитела были описаны в данной области (см., например, публикацию патента США №20030153043, принадлежащую Can et al).

Антитело или часть антитела по изобретению может быть производной другой функциональной молекулы или быть с ней соединено (например, с другим пептидом или белком). Соответственно, предполагается, что антитела или части антител по изобретению включают производные и иным способом модифицированные формы антител PG110, описанных в этом документе. Например, антитело или часть антитела по изобретению может быть функционально присоединена (путем химического соединения, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иначе) к одной или нескольким другим молекулам, таким как другое антитело (например, биспецифичное антитело или диатело), детектируемый агент, цитотоксичный агент, фармацевтический агент и/или белок или пептид, способный опосредовать ассоциацию антитела или части антитела с другой молекулой (такой как коровая область стрептавидина или полигистидиновая метка).

Один тип дериватных антител получают поперечной сшивкой двух или нескольких антител (одного и того же типа или разных типов, например, для создания биспецифичных антител). Пригодные агенты для поперечной сшивки включают таковые, являющиеся гетеробифункциональными, имеющие две различные реакционно-способные группы, разделенные соответствующим спейсером (например, m-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир), или гомобифункциональными (например, дисукцинимидила суберат). Такие линкеры доступны для приобретения в компании Pierce Chemical Company, Рокфорд, Иллинойс, США.

Полезные детектируемые агенты, с которыми могут быть получены производные антитела или части антитела по изобретению, включают флуоресцентные соединения. Примеры флуоресцентных детектируемых агентов включают флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталенсульфонила хлорид, фикоэритрин и т.п. Также может быть получена производная антитела с детектируемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкозооксидаза и т.п. Когда антитело получено как производная с детектируемым ферментом, его детектируют с помощью внесения дополнительных реагентов, которые используются ферментом с образованием детектируемого продукта реакции. Например, когда присутствует детектируемый агент пероксидаза хрена, добавление водорода пероксида и диаминобензидина ведет к проявлению окрашенной реакции, которую можно детектировать. Также антитело может являться производной с биотином, и детектироваться путем опосредованного измерения уровня связывания авидина или стрептавидина.

III. Получение антител

Еще одна особенность настоящего раскрытия относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют антитела по раскрытию. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целой клетке, в клеточном лизате или в частично очищенной или в существенной степени очищенной форме. Нуклеиновая кислота является "выделенной" или "в существенной степени очищенной", когда она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, с применением стандартных способов, включая обработку щелочью/ДСН, зональное центрифугирование в растворе CsCl, колоночную хроматографию, агарозный гель-электрофорез и другие хорошо известные специалистам в данной области способы. См. F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеиновая кислота по настоящему раскрытию может являться, например, ДНК или РНК и может содержать или не содержать интронные последовательности. В предпочтительном варианте воплощения нуклеиновая кислота является молекулой кДНК. Нуклеиновые кислоты по настоящему раскрытию могут быть получены с применением стандартных методик молекулярной биологии.

Предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность ПОСЛ. ID №: 11. Другая предпочтительная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит нуклеотидную последовательность ПОСЛ. ID №: 14.

После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты V_H и V_L, с этими фрагментами ДНК можно производить дополнительные манипуляции с применением стандартных методик рекомбинантных ДНК, например, превращать гены вариабельных областей в гены полноразмерных цепей антител таким образом, что вариабельная область функционально связана с консервативной областью (см. например, пример 1). Предполагается, что термин "функционально связан" при использовании в данной контексте означает, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые этими двумя фрагментами ДНК, находятся в одной рамке считывания.

Антитела могут быть получены в клетке-хозяине с применением способов, известных специалистам в данной области (например, Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Например, для экспрессии антител, ДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, могут быть вставлены в экспрессионные векторы таким образом, чтобы гены были функционально связаны с последовательностями, контролирующими транскрипцию и трансляцию. Предполагается, что в этом контексте термин "функционально связанный" означает, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию и расположенные в пределах вектора, выполняют функции, для которых они предназначены, по регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и последовательности, контролирующие экспрессию, выбраны таким образом, чтобы они были совместимы с экспрессией в применяемой клетке-хозяине. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в разные вектора, или, что более типично, оба гена вставляют в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антител вставляют в экспрессионный вектор с применением стандартных способов (например, дотирования комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе, или лигирование тупых концов, если рестрикционные сайты отсутствуют). Дополнительно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, чтобы сигнальный пептид был присоединен в одной рамке считывания с N-конца гена цепи антитела. Сигнальный пептид может являться сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е., сигнальным пептидом белка, отличного от иммуноглобулина).

Помимо генов цепей антител рекомбинантные экспрессионные векторы в типичном случае несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антител в клетке-хозяине. Предполагается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы, контролирующие экспрессию (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антител. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в работе Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Специалисту в данной области понятно, что конструкция экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, желательный уровень экспрессии белка и т.д. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах, принадлежащих млекопитающим, включают вирусные элементы, которые обеспечивают высокие уровни экспрессии белков в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные от цитомегаловируса (CMV), вакуолизирующего обезьяньего вируса 40 (SV40), аденовируса (например, аденовирусный основной поздний промотор (AdMLP) и вируса полиомы. В соответствии с другим вариантом, могут применяться невирусные регуляторные последовательности, такие как промотор гена убиквитина или промотор гена β-глобина. Дополнительно, регуляторные элементы, состоящие из последовательностей из других источников, такие как промоторная система SRa, которая содержит последовательности из раннего промотора SV40 и длинного концевого повтора вируса Т-клеточной лейкемии 1 типа (Takebe, Y. et al. (1988) Mol, Cell. Biol. 8:466-472).

Помимо генов цепей антител и регуляторных последовательностей, рекомбинантные экспрессионные векторы могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, регулирующие репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, ориджины репликации), и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был внедрен вектор (см., например, патенты США №№4 399 216, 4 634 665 и 5 179 017, все принадлежат Axel et al.). Например, в типичном случае ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным веществам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был внедрен вектор. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr- клетках с селекцией/амплификацией в присутствии метотрексата) и ген пео (для селекции в присутствии G418).

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионный вектор(ы), кодирующий тяжелую и легкую цепи, трансфецируют в клетку-хозяина с применением стандартных способов. Подразумевается, что различные формы термина "трансфекция" включают широкое разнообразие способов, стандартно применяемых для внедрения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацию, кальций-фосфатную преципитацию, трансфекцию с применением ДЭАЭ-декстрана и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках, и наиболее предпочтительно - в клетках-хозяевах, принадлежащих млекопитающим, является наиболее предпочтительной, так как такие эукариотические клетки, и, в частности, клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, обеспечат сборку и секрецию должным образом свернувшегося и иммунологически активного антитела. Сообщалось, что прокариотическая экспрессия генов антител неэффективна для получения высокого выхода активного антитела (Boss, M.A. and Wood, С.R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Предпочтительные клетки-хозяева, принадлежащие млекопитающим, для экспрессии рекомбинантных антител по настоящему раскрытию включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (в том числе клетки dhfr^- CHO, описанные в работе Uriaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, использованные с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в работе R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Еще одной предпочтительной системой экспрессии является система экспрессии генов с GS, описанная в WO 87/04462 (принадлежащей Wilson), WO 89/01036 (принадлежащей Bebbington) и ЕР 338 841 (принадлежащем Bebbington). Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антител, внедрены в клетки-хозяева, принадлежащие млекопитающим, антитела получают, культивируя клетки-хозяева в течение периода времени, достаточного для прохождения экспрессии антитела в клетках-хозяевах, или, более предпочтительно, секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела можно извлечь из культуральной среды с применением стандартных способов очистка белков.

В предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание экспрессионного вектора, кодирующего антитело против ФРН, при этом вектор содержит нуклеотидную последовательность ПОСЛ. ID №: 11, кодирующую тяжелую цепь антитела, и нуклеотидную последовательность ПОСЛ. ID №: 14, кодирующую легкую цепь антитела. Предпочтительный экспрессионный вектор по изобретению содержит ген GS (глутаминсинтетазы). В еще одном предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание клетки-хозяина, содержащей экспрессионный вектор по изобретению. Предпочтительной клеткой-хозяином по изобретению является клетка СНО (яичника китайского хомячка). В еще одном предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа экспрессии антитела против ФРН, включающего культивирование клетки-хозяина, которая содержит экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность ПОСЛ. ID №: 11 (кодирующую тяжелую цепь антитела) и нуклеотидную последовательность ПОСЛ. ID №: 14 (кодирующую легкую цепь антитела), таким образом, что экспрессируется антитело против ФРН, содержащее тяжелую цепь, кодируемую ПОСЛ. ID №: 11, и легкую цепь, кодируемую ПОСЛ. ID №: 14.

Еще одной особенностью является то, что изобретение относится к способу получения антитела против ФРН, которое несет мутацию в консервативной области антитела (например, мутацию в шарнирной области), способу, включающему внесение соответствующей мутации в консервативную область, например, с применением стандартных методик рекомбинантных ДНК. Например, настоящее изобретение направлено на создание способа получения антитела против ФРН, при этом антитело содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно, (ii) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR 1, 2 и 3, имеющие аминокислотные последовательности ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно, и (iii) консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10 (и, например, при этом антитело имеет средний терминальный период полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней), или, дополнительно или в соответствии с другим вариантом, имеет средний фармакологический период полувыведения у человека по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 35 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до шести недель, или в диапазоне от четырех до шести недель, или в диапазоне от по меньшей мере от четырех до семи недель, или в диапазоне от четырех до семи недель, или в диапазоне от по меньшей мере четырех до восьми недель, или в диапазоне от четырех до восьми недель), при этом способ получения антитела включает внесение мутации с заменой серина в позиции аминокислоты 108 в ПОСЛ. ID №: 9 на пролин с созданием консервативной области IgG4 человека, содержащей аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10. Предпочтительно, вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1. Предпочтительно, вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 2. Предпочтительно, тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 13. Предпочтительно, легкая цепь включает аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 16.

IV. Фармацевтические композиции

Еще одной особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на создание композиций, например, фармацевтической композиции, содержащей антитело по изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. В предпочтительных воплощениях фармацевтические композиции пригодны для введения внутривенно, подкожно (например, с помощью шприца-ручки) или внутрисуставно, при этом другие пригодные способы введения описаны в этом документе. В одном из вариантов воплощения композиция может включать комбинацию множества (например, двух или нескольких) антител по изобретению, например, антител, которые связываются с различными эпитопами на ФРН.

При использовании в этом документе, "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой и все растворители, соли, диспергирующие среды, агенты для нанесения оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотоничные и отсрочивающие всасывание агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. В зависимости от способа введения, активное вещество может быть покрыто оболочкой из материала, защищающего активное вещество от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать это вещество.

"Фармацевтически приемлемая соль" означает соль, которая сохраняет требуемую биологическую активность исходного соединения и не вызывает какие-либо нежелательные токсикологические эффекты (см., например, Berge, S.M., et al. (1977)./. Pharm. Sci. 66:1-19). Примеры таких солей включают соли, образующиеся при добавлении кислоты, и соли, образующиеся при добавлении основания. Соли, образующиеся при добавлении кислоты, включают соли, являющиеся производными нетоксичных неорганических кислот, таких как хлористоводородная, азотная, фосфорная, серная, бромистоводородная, йодистоводородная, фосфористая и т.п., а также нетоксичных органических кислот, таких как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенил-замещенные карбоновые кислоты, гидроксикарбоновые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и т.п. Соли, образующиеся при добавлении основания, включают соли, являющиеся производными щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, магний, кальций и т.п., а также нетоксичных органических аминов, таких как N,N'-дибензилэтилендиамин, N-метилглюкамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, этилендиамин, прокаин и т.п.

Фармацевтические композиции могут вводиться отдельно или в составе комбинированной терапии, т.е., в комбинации с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию по настоящему изобретению с по меньшей мере одним или несколькими дополнительными фармацевтическими агентами. Например, по меньшей мере один или несколько дополнительных фармацевтических агентов могут вводиться отдельно или могут быть также включены в композицию. В предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению вводят в комбинации со вторым фармацевтическим агентом, при этом, второй фармацевтический агент выбран из группы, состоящей из НПВС, анальгетиков (включая опиоидные анальгетики и атипичные анальгетики), местных анестетиков, препаратов для проводниковой анестезии, препаратов для фенольной блокады, терапевтических антител, стероидов, противосудорожных средств, антидепрессантов, местного капсаицина и противовирусных агентов. В частности, предпочтительным классом вторых фармацевтических агентов для применения с целью облегчения боли являются опиоидные анальгетики. Дополнительно или в соответствии с другим вариантом, второй режим лечения может быть скомбинирован с применением антитела по изобретению, например, для облегчения боли. Примеры таких вторых режимов лечения включают лучевую терапию (например, в случае боли при онкологических заболеваниях), хирургические процедуры (например, абляционные (с применением игл) процедуры на гассеровом ганглии и области, расположенной позади тройничного узла, при невралгии тройничного нерва), гипноз и иглоукалывание.

Примеры НПВС включают ацетилированные салицилаты, в том числе аспирин; неацетилированные салицилаты, в том числе салсалат, дифлунисал; производные уксусной кислоты, в том числе этодолак, диклофенак, индометацин, кеторолак, набуметон; производные пропионовой кислоты, в том числе фенопрофен, флурбипрофен, ибупрофен, кетопрофен, напроксен, напроксен натрия, оксапрозин; фенаматы, в том числе меклофенамовая кислота, мефенамовая кислота; фенилбутазон, пироксикам; ингибиторы СОХ-2, в том числе целекоксиб, эторикоксиб, валдекоксиб, рофекоксиб, лумиракоксиб. Примеры анальгетиков включают парацетамол (ацетаминофен), трамадол, капсаицин (местный), опиоидные анальгетики и атипичные анальгетики. Примеры опиоидных анальгетиков включают морфин, кодеин, тебаин, гидроморфон, гидрокодон, оксикодон, оксиморфон, дезоморфин, диацетилморфин, никоморфин, дипропионилморфин, бензилморфин, этилморфин, фентанил, петидин, метадон, трамадол и пропоксифен. Примеры атипичных анальгетиков включают трициклические антидепрессанты, карбазепин, габапентин, прегабалин, дулоксетин и кофеин. Примеры стероидов включают внутрисуставные кортикостероиды (LAC) и преднизолон. Примеры терапевтических антител включают антитела против TNF, такие как Ремикейд® и Хумира®, и антитела против CD20, такие как Ритуксан® и Арзерра™. Примеры противовирусных агентов включают ацикловир и осельтамивира фосфат (Тамифлю®).

В предпочтительном варианте воплощения комбинированная терапия может включать антитело против ФРН по настоящему изобретению с по меньшей мере одним или несколькими ингибиторами TrkA (например, соединениями, которые являются антагонистами активности TrkA). Ингибиторы TrkA могут действовать, например, путем внеклеточного взаимодействия с рецептором TrkA, или путем внутриклеточного взаимодействия с компонентами передачи сигнала от TrkA (например, путем ингибирования киназной активности TrkA). Неограничивающие примеры внеклеточных ингибиторов TrkA включают антитела против TrkA (такие как гуманизированные антитела против TrkA, описанные в публикации патента США №20090208490 и публикации патента США №20090300780) и пептидные миметики ФРН, являющиеся антагонистами TrkA (такие как описаны в работе Debeir, Т. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:4067-4072). Неограничивающие примеры внутриклеточных ингибиторов TrkA включают способные проникать в клетку пептиды, являющиеся антагонистами функции TrkA (например, как описано в работах Hirose, M. et al. (2008) J. Pharmacol. Sci. 106:107-113; Ueda, К. et al. (2010) J. Pharmacol. Sci., March 30, 2010 issue) ингибиторы в виде малых молекул, такие как ингибиторы киназы TrkA (например, как описано в работах Wood, E.R. et al. (2004) Bioorg. Mod. Chem. Lett. 14:953-957; Tripathy, R. et al. (2008) Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:3551-3555). Другие неограничивающие примеры ингибиторов TrkA включают ARRY-470 и ARRY-872 (Array Biopharma).

В еще одном предпочтительном варианте воплощения комбинированная терапия может включать антитело против ФРН по настоящему изобретению с по меньшей мере одним или несколькими ингибиторами протеинкиназы С (РКС) (например, соединениями, которые являются антагонистами активности РКС).

Композиция по настоящему изобретению может вводиться с применением различных способов, известных специалистам в данной области. Специалисту в данной области будет понятно, что путь и/или способ введения будет меняться в зависимости от требуемых результатов. Предпочтительно, носитель пригоден для внутривенного, интраартикулярного, подкожного, внутримышечного, парентерального, внутриопухолевого, интраназального, интравезикулярного, внутрисуставного, перорального, мукозного, подъязычного, спинального или эпидермального ведения или инсталляции в полости тела (например, брюшную полость, плевральную полость, придаточные полости носа) или на поверхность глаза, или введения в легкие ингаляционным путем. Для конкретных путей введения может быть выбрано применение пригодных изделий для доставки. Например, для подкожного или внутримышечного введения может применяться шприц-ручка (например, такой, который позволяет самостоятельно производить введение). Такие шприцы-ручки, также называемые инжекторами, известны специалистам в данной области, в том числе такие, которые содержат жидкую дозу антитела (например, шприц-ручка разового использования, применяемый для введения Хумира®) и, более предпочтительно, такие, которые содержат дозу антитела в виде сухого вещества, которую восстанавливают в жидкую форму непосредственно перед инъекцией. Также для подкожного введения могут применяться подкожные имплантаты. Дополнительно, чрескожная доставка может достигаться применением местного трансдермального (чрескожного) пластыря (например, лейкопластыря). Чрескожная доставка также может быть достигнута с применением инъекции сухого порошка (такой как инъекция с применением инжекторов, доступных для приобретения у компании Glide Pharma). Дополнительно, для доставки в легкие (например, при лечении астмы или хронического кашля), может применяться распыляемый раствор в небулайзере.

Активные соединения могут быть приготовлены с носителями, которые обеспечат защиту соединения от быстрого высвобождения, такими как рецептуры с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких рецептур запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области. См., например. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Для введения соединения по изобретению с применением некоторых путей введения может потребоваться покрытие соединения оболочкой, или совместного введения соединения с материалом, предотвращающим его инактивацию. Например, соединение может быть введено субъекту в соответствующем носителе, например, в липосомах, или в разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают раствор натрия хлорида и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии камеди из кукурузных волокон типа вода-в-масле и масло-в-воде, а также стандартные липосомы (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol, 7:27).

Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного приема. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных субстанций известно специалистам в данной области. За исключением случаев, когда какая-либо стандартная среда или агент несовместимы с активным соединением, их применение в фармацевтических композициях по изобретению рассматривается как входящее в объем изобретения. Вспомогательные активные соединения также могут внедряться в композиции.

Терапевтические композиции в типичном случае должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиции могут быть приготовлены в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, пригодной для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может быть растворителем или диспергирующей средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их пригодными смесями. Требуемая текучесть может поддерживаться, например, с помощью применения оболочки, например, из лецитина, поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительно включить в композицию изотоничные агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол, или натрия хлорид. Длительное всасывание инъекционных композиций может быть достигнуто включением в композицию агента, который замедляет всасывание, например, солей моностеарата и желатина.

Стерильные инъекционные растворы можно приготовить добавлением активного соединения в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, согласно требованиям, с последующей стерилизацией с применением микрофильтрации. В общем случае, дисперсии приготавливают добавлением активного соединения в стерильный носитель, содержащий основную диспергирующую среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и замораживание-высушивание (лиофилизация), в результате которых получают порошок активного вещества в смеси с дополнительным требуемым ингредиентом из их раствора, ранее простерилизованного фильтрацией.

Режимы дозирования корректируют для обеспечения оптимального требуемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, может быть введена разовая ударная доза, несколько разделенных доз могут быть введены в течение определенного времени или доза может быть пропорционально снижена или повышена, в соответствии с потребностями в конкретной терапевтической ситуации. Типичная разовая доза (которую могут вводить в соответствии с режимом дозирования как описано дополнительно ниже) может находиться в диапазоне от примерно 0,1 мкг/кг до 1 мкг/кг или до 3 мкг/кг или до 30 мкг/кг или до 300 мкг/кг или до 3000 мкг/кг (3 мг/кг) или до 30 мг/кг или до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, описанных в этом документе. Например, антитело против ФРН может быть введено в дозе примерно 1 мкг/кг, примерно 10 мкг/кг, примерно 20 мкг/кг, примерно 50 мкг/кг, примерно 100 мкг/кг, примерно 200 мкг/кг, примерно 300 мкг/кг, примерно 400 мкг/кг, примерно 500 мкг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 2 мг/кг или примерно 3 мг/кг. В предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН вводят в дозе, находящейся в диапазоне от примерно 3 мкг/кг до примерно 3000 мкг/кг. В другом предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН вводят в дозе 100 мкг/кг. В другом предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН вводят в дозе 200 мкг/кг. В другом предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН вводят в дозе 300 мкг/кг. В другом предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН вводят в дозе 400 мкг/кг.

Для повторных введений в течение нескольких дней, недель или месяцев, или дольше, в зависимости от состояния, лечение длится до наступления требуемого подавления симптомов или до достижения достаточного терапевтического уровня (например, уменьшения боли). Приводимый в качестве примера режим дозирования включает введение начальной дозы в диапазоне примерно от 3 мкг/кг до 500 мкг/кг, с последующей ежемесячной поддерживающей дозой примерно от 3 мкг/кг до 500 мкг/кг антитела против ФРН. В другом варианте воплощения настоящего изобретения дозу, равную примерно 200 мкг/кг, вводят однократно каждый месяц. В другом варианте воплощения настоящего изобретения дозу, равную примерно 400 мкг/кг, вводят однократно один раз в два месяца. Однако могут быть полезны другие режимы дозирования, в зависимости от характера фармакокинетического распада, которого желает достигнуть практикующий врач. Например, в некоторых вариантах воплощения предполагается введение доз от одного до четырех раз в неделю. Однако, с учетом большой длительности облегчения боли антителами против ФРН, может применяться менее частое введение доз. В некоторых вариантах воплощения, антитело против ФРН вводят однократно каждую неделю, однократно каждые 2 недели, однократно каждые 3 недели, однократно каждые 4 недели, однократно каждые 5 недель, однократно каждые 6 недель, однократно каждые 7 недель, однократно каждые 8 недель, однократно каждые 9 недель, однократно каждые 10 недель, однократно каждые 15 недель, однократно каждые 20 недель, однократно каждые 25 недель, однократно каждые 26 недель или дольше. В некоторых вариантах воплощения антитело против ФРН вводят однократно каждый 1 месяц, однократно каждые 2 месяца, однократно каждые 3 месяца, однократно каждые 4 месяца, однократно каждые 5 месяцев, однократно каждые 6 месяцев или дольше.

Как дополнительно обсуждается в примере 6, в предпочтительном воплощении антитело против ФРН по изобретению вводят (например, человеку) внутривенно в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 мг/кг до 0,2 мг/кг, предпочтительно 0,15 мг/кг, однократно каждые 12 недель. В другом предпочтительном воплощении антитело против ФРН по изобретению вводят (например, человеку) подкожно в дозе, находящейся в диапазоне от 0,2 мг/кг до 0,4 мг/кг, предпочтительно 0,3 мг/кг, однократно каждые двенадцать недель. В других вариантах воплощения, антитело против ФРН по изобретению вводят в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 мг/кг до 3 мг/кг, или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 30 мг/кг, или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 30 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 20 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 10 мг/кг.

Особенным преимуществом является разработка рецептуры парентеральных композиций в форме единиц дозирования для облегчения введения и однородности дозирования. Форма единицы дозирования при использовании в этом документе означает физически разделенные единицы, приготовленные как единичные дозировки для субъектов, получающих лечение; каждая единица содержит заранее установленное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для форм единиц дозирования по изобретению обусловлена и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который требуется достичь, и (б) ограничений, присущих области приготовления таких активных соединений для лечения чувствительности у пациентов. Например, неограничивающие примеры форм единиц дозирования включают 0,2 мг (соответствует дозе 3 мкг/кг для пациента с массой тела примерно 70 кг), 2 мг (соответствует дозе 30 мкг/кг для пациента с массой тела примерно 70 кг) и 7 мг (соответствует дозе 100 мкг/кг для пациента с массой тела примерно 70 кг).

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, натрия бисульфат, натрия метабисульфит, натрия сульфит и т.п.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбил пальмитат, бутилгидроксианизол (ВНА), бутилгидрокситолуол (ВИТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) металл-хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и т.п.

В одном варианте рецептуры могут быть представлены в форме единиц дозирования и могут быть приготовлены любым способом, известным специалистам в области фармации. Форма единицы дозирования при использовании в этом документе означает физически разделенные единицы, приготовленные как единичные дозировки для субъектов, получающих лечение; при этом каждая единица содержит заранее установленное количество активного соединения, рассчитанное для получения требуемого терапевтического эффекта, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Количество активного вещества, которое может быть скомбинировано с материалом носителя для получения разовой лекарственной формы, будет изменяться в зависимости от субъекта, получающего лечение, и конкретного способа введения. Количество активного вещества, которое может быть скомбинировано с материалом носителя для получения разовой лекарственной формы, в общем случае будет равно количеству композиции, которое дает терапевтический эффект. В общем случае, исходя из ста процентов, это количество будет находиться в диапазоне от примерно 0,001 процента до примерно девяноста процентов активного вещества, предпочтительно от примерно 0,005 процента до примерно 70 процентов, наиболее предпочтительно от примерно 0,01 процента до примерно 30 процентов.

Фразы "парентеральное введение" и "введенный парентерально" при использовании в этом документе означают способы введения, отличные от энтералъного и местного введения, обычно с применением инъекции, и включающие, в частности, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсульную, внутриглазничную, интракардиальную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, субкапсульную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.

Примеры пригодных водных и неводных носителей, которые могут применяться в фармацевтических композициях по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их пригодные смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Требуемая текучесть может поддерживаться, например, с помощью применения материалов для оболочки, например, лецитина, поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и применения поверхностно-активных веществ.

Эти композиции могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. В частности, примеры адъювантов, которые хорошо известны специалистам в данной области, включают, например, неорганические адъюванты (такие как соли алюминия, например, алюминия фосфат и алюминия гидроксид), органические адъюванты (например, сквален), адъюванты на основе масел, виросомы (например, виросом, которые содержат мембран-связанный гемагглготинин и нейраминидазу, полученные от вируса гриппа).

Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено как методами стерилизации, см. выше, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлоробутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательно включение в композиции изотоничных агентов, таких как сахара, натрия хлорид и т.п. Дополнительно, длительное всасывание инъекционной лекарственной формы может быть достигнуто включением агентов, которые замедляют всасывание, таких как, алюминия моностеарат и желатин.

Когда соединения по настоящему изобретению вводят в качестве лекарственных средств человеку или животным, их могут давать отдельно или в составе фармацевтической композиции, содержащей, например, от 0,001 до 90% (более предпочтительно от 0,005 до 70%, например, от 0,01 до 30%) активного вещества в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

Независимо от выбранного пути введения, соединения по настоящему изобретению, которые могут применяться в пригодной гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению приготовляются по рецептурам в фармацевтически приемлемых лекарственных формах с применением стандартных способов, известных специалистам в данной области.

Фактические уровни дозировок активных веществ в фармацевтических композициях по настоящему изобретению могут быть изменены таким образом, чтобы получить количество активного вещества, которое эффективно для достижения требуемого терапевтического ответа применительно к конкретному пациенту, композиции и способу введения, и при этом не является токсичным для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций по настоящему изобретению, или их сложного эфира, соли или амида, путь введения, время введения, скорость выведения конкретного применяемого соединения, длительность лечения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, массу тела, состояние, общее состояние здоровья и предшествующую историю болезни пациента, получающего лечение, а также факторы, хорошо известные специалистам в области медицины. Врач или ветеринар, обладающий стандартными специальными знаниями, может легко определить и прописать эффективное количество требуемой фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар мог бы начать с доз соединения по изобретению, применяемого в фармацевтической композиции, находящихся на уровне ниже, чем требуется для достижения нужного терапевтического эффекта и постепенно повышать дозировку до достижения требуемого эффекта. В общем случае, пригодная ежедневная доза композиции по изобретению будет равна количеству соединения, которое представляет наименьшую дозу, эффективную для получения терапевтического эффекта. Такая эффективная доза в общем случае будет зависеть от факторов, описанных выше.

Терапевтические композиции могут вводиться с применением изделий медицинского назначения, известных специалистам в данной области. Например, в предпочтительном воплощении терапевтическая композиция по изобретению может вводиться с применением безыгольного изделия для подкожного введения, такого как изделия, раскрытые в патентах США №№5 399 163, 5 383 851, 5 312 335, 5 064 413, 4 941 880,4 790 824 или 4 596 556. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей, полезных для настоящего изобретения, включают: Патент США №4 487 603, в котором описан имплантируемый микроинфузионный насос для дозирования лекарственных препаратов с контролируемой скоростью; патент США №4 486 194, в котором описано терапевтическое изделие для введения лекарственных препаратов через кожу; патент США №4 447 233, в котором описан медицинский инфузионный насос для доставки лекарственных препаратов при определенной скорости инфузии; патент США №4 447 224, в котором описаны имплантируемые инфузионные аппараты с регулируемым потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США №4 439 196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственных средств с многокамерными отделениями; и патент США №4 475 196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственных средств. Множество других имплантатов, систем доставки и модулей известны специалистам в данной области,

В некоторых воплощениях моноклональные антитела по изобретению могут быть включены в рецептуру, обеспечивающую требуемое распределение in vivo. Например, гемоэнцефалический барьер (ГЭБ) не пропускает многие высоко гидрофильные соединения. Для обеспечения прохождения терапевтических соединений по изобретению через ГЭБ (если требуется) может быть разработана рецептура, где они помещены, например, в липосомы. Информацию о способах получения липосом см., например, патенты США 4 522 811; 5 374 548 и 5 399 331. Липосомы могут содержать один или несколько остатков, которые селективно транспортируются в специфичные клетки или органы, таким образом усиливая направленную доставку лекарственного средства (см., например, V.V. Ranade (1989) J. din. Pharmacol. 29:685). Примеры нацеливающих остатков включают фолат и биотин (см., например, патент США 5416016, принадлежащий Low et al.); маннозиды (Umezawae/o/., (19SS) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); антитела (P.G. Bloeman etal. (1995) FEBSLett. 357:140; M. Owais etal. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); рецептор поверхностно-активного белка A (Briscoe et al, (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), различные виды которых могут включать рецептуры по изобретению, а также компоненты молекул по изобретению; р120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); см. также К. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

V. Способы применения антител по изобретению

Еще одной особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на создание способа лечения, например, ослабления или ингибирования, связанного с ФРН заболевания или состояния у субъекта, а именно, способа, включающего введение субъекту антитела против ФРН по изобретению. Предпочтительно, антитело против ФРН применяют для ослабления или смягчения боли, например, боли, ассоциированной с заболеванием или состоянием, при котором развитие или сохранение боли опосредовано, по меньшей мере частично, ФРН. Неограничивающие примеры связанных с ФРН заболеваний и состояний включают боль при воспалении, боль после хирургического вмешательства, послеоперационную боль (включая зубную боль), невропатическую боль, периферическую невропатию, диабетическую невропатию, боль при переломах, боль в суставах при подагре, постгерпетическую невралгию, боль при онкологических заболеваниях, боль при остеоартрите или ревматоидном артрите, ишиалгию, боли, ассоциированные с кризисом серповидно-клеточной анемии, головные боли (например, мигрени, тензионные головные боли, приступы головной боли), боли при дисменорее, эндометриозе, фиброме матки, костно-мышечную боль, хроническую боль в нижней части спины, фибромиалгию, растяжения, висцеральную боль, кисты яичника, простатит, синдром хронической тазовой боли, цистит, интерстициальный цистит, синдром болезненного мочевого пузыря и/или болевой синдром мочевого пузыря, боль, ассоциированную с хроническим небактериальным простатитом, боль в области послеоперационного рубца, мигрень, невралгию тройничного нерва, боль от ожогов и/или ран, боль, ассоциированную с травмой, боль, ассоциированную с заболеваниями скелетно-мышечной системы, анкилозирующий спондилоартрит, вокруг-суставные патологии, боль, вызванную метастазами в кости, боль, вызванную ВИЧ, эритромелалгию или боль, вызванную панкреатитом или камнями в почках, злокачественной меланомой, ксеродерматозом, астмой (например, неконтролируемой астмой с тяжелой гиперчувствительностью дыхательных путей) и хроническим кашлем, демиелинизирующими заболеваниями, хроническим алкоголизмом, инсультом, таламический болевой синдром, боль, вызванная токсинами, боль, вызванная химиотерапией, фибромиалгия, воспалительные нарушения кишечника, синдром раздраженной толстой кишки, воспалительные нарушения глаза, нарушения, связанные с воспаленным или нестабильным мочевым пузырем, псориаз, кожные заболевания с воспалительными компонентами, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит, неврит, коллагеновые (васкулярные) болезни, состояния хронического воспаления, боль при воспалении и ассоциированную гипералгезию или аллодинию, невропатическую боль, ассоциированную с гипералгезией или аллодинией, диабетическую невропатическую боль, каузалгию, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, повреждение или дисфункцию эпителиальных тканей, нарушения подвижности внутренних органов дыхательной мочеполовой, желудочно-кишечной или сосудистой систем, аллергические кожные реакции, прурит, витилиго, общие желудочно-кишечные нарушения, колит, язву желудка, язву двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит, бронхиальные нарушения, диспепсию, желудочно-пищеводный рефлюкс, панкреатит и висцералгию.

Дополнительно, выявлено участие ФРН в прогрессии онкологических заболеваний, таких как рак простаты, рак щитовидной железы, рак легких, пролактинома и меланома. Соответственно, в другом варианте воплощения связанное с ФРН заболевание или состояние, которое можно лечит с применением антитела против ФРН по изобретению, является онкологическим заболеванием, предпочтительно раком простаты, раком щитовидной железы, раком легких, пролактиномой или меланомой. Таким образом, в другом варианте воплощения настоящее изобретение также направлено на создание способа лечения онкологического заболевания у субъекта, предпочтительно рака простаты, рака щитовидной железы, рака легких, пролактиномы или меланомы, включающего введение антитела против ФРН по изобретению субъекту.

Дополнительно, в другом варианте воплощения связанное с ФРН заболевание или состояние может являться ВИЧ/СПИД. Блокирование ФРН с применением антитела против ФРН по изобретению может блокировать инфицированные ВИЧ макрофаги, тем самым обеспечивая лечение ВИЧ/СПИД. Соответственно, в другом варианте воплощения настоящее изобретение также направлено на создание способа лечения ВИЧ/СПИД у субъекта, включающего введение антитела против ФРН по изобретению субъекту.

В частности, предпочтительные заболевания и состояния для лечения в соответствии со способами по изобретению включают боль при воспалении (в частности, боль, вызванную остеоартритом или ревматоидным артритом), костно-мышечную боль (в частности, хроническую боль в нижней части спины), боль при онкологических заболеваниях, невропатическую боль (в частности, боль при диабетической невропатии), боль, вызванную метастазами в кости, интерстициальный цистит/ синдром болезненного мочевого пузыря, боль, ассоциированную с хроническим небактериальным простатитом, боль, вызванную эндометриозом и/или фибромами матки, и послеоперационную боль.

Боль и/или симптомы, ассоциированные с эндометриозом и/или фибромой матки, могут включать дисменорею; хроническую неменструальную тазовую боль; диспареунию; дисхезию; гиперменорею; боль в нижней части живота или спины; бесплодие и недостаточность репродуктивной функции; дизурию; вздутие и боль при мочеиспускании; тошноту, рвоту и/или диарею. Симптомы также могут включать симптомы, связанные с эндометриоидными повреждениями и фибромами, расположенными вне перитонеальной полости, включая, например, такие проявления синдрома торакального эндометриоза как кровохарканье, пневмоторакс или гемоторакс, и такие проявления лейомиоза легких как диспноэ и затемнение в легких.

В частности, в предпочтительном воплощении антитело против ФРН по изобретению применяют для лечения боли. Предпочтительно, тип боли, подвергаемой лечению, выбран из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологическом заболевании и боли при эндометриозе и/или фиброме матки. Соответственно, в предпочтительном варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа лечения боли у субъекта, включающего введение антитела против ФРН по изобретению субъекту таким образом, что боль у субъекта подвергается лечению. Предпочтительно, боль выбрана из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологическом заболевании и боли при эндометриозе и/или фиброме матки. Соответственно, в одном из вариантов воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа лечения боли при остеоартрите у субъекта, включающего введение антитела против ФРН по изобретению таким образом, что боль при остеоартрите у субъекта подвергается лечению. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа лечения хронической боли в нижней части спины у субъекта, включающего введение антитела против ФРН по изобретению таким образом, что хроническая боль в нижней части спины у субъекта подвергается лечению. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа лечения боли при диабетической невропатии у субъекта, включающего введение антитела против ФРН по изобретению таким образом, что боль при диабетической невропатии у субъекта подвергается лечению. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа лечения боли при онкологическом заболевании у субъекта, включающего введение антитела против ФРН по изобретению таким образом, что боль при онкологическом заболевании у субъекта подвергается лечению. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа лечения боли при эндометриозе и/или фиброме матки у субъекта, включающего введение антитела против ФРН по изобретению таким образом, что боль при эндометриозе и/или фиброме матки у субъекта подвергается лечению.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, как описано в этом документе, для лечения связанного с ФРН заболевания. Неограничивающие примеры связанных с ФРН заболеваний или состояний включают таковые, перечисленные выше. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, как описано в этом документе, для лечения боли. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, как описано в этом документе, для лечения боли, выбранной из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологическом заболевании и боли при эндометриозе и/или фиброме матки. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, как описано в этом документе, для лечения боли при остеоартрите. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, как описано в этом документе, для лечения хронической боли в нижней части спины. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, как описано в этом документе, для лечения боли при диабетической невропатии. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, как описано в этом документе, для лечения боли при онкологическом заболевании. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН, как описано в этом документе, для лечения боли при эндометриозе и/или фиброме матки.

В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа ослабления или ингибирования боли у субъекта, а именно, способа, включающего введение субъекту антитела против фактора роста нервов (ФРН), содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10, при этом антитело облегчает боль у субъекта в течение по меньшей мере от примерно четырех до примерно двенадцати недель (или по меньшей мере от четырех до двенадцати недель, или в течение по меньшей мере четырех недель, или по меньшей мере восьми недель, или по меньшей мере двенадцати недель, или от одной до двенадцати недель, или от четырех до двенадцати недель, или от восьми до двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. Предпочтительно, боль выбрана из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологическом заболевании и боли при эндометриозе и/или боли при фиброме матки. Предпочтительно, антитело против ФРН вводят в дозе, находящейся в диапазоне от примерно 0,1 мг/кг до 3 мг/кг, или от 0,1 мг/кг до 3 мг/кг, или от примерно 0,1 мг/кг до примерно 30 мг/кг, или от 0,1 мг/кг до 30 мг/кг или в одном из остальных диапазонов дозировок, описанных в этом документе.

В некоторых вариантах воплощения настоящее изобретение направлено на создание способа ослабления или ингибирования связанного с фактором роста нервов (ФРН) заболевания или состояния у субъекта таким образом, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета, способа, включающего введение субъекту антитела против ФРН, содержащего консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека включает мутацию в шарнирной области в позиции 108 аминокислоты ПОСЛ. ID №: 9, при этом антитело обладает терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней (или по меньшей мере 10 дней, или по меньшей мере 15 дней, или по меньшей мере 20 дней, или по меньшей мере 25 дней, или по меньшей мере 30 дней, или по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне 10-40 дней, или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 30 дней, или в диапазоне 15-30 дней), при этом антитело вводят субъекту в такой дозировке и с такой частотой, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета. Предпочтительно, серии в позиции аминокислоты 108 в ПОСЛ. ID №: 9, заменен на пролин. Предпочтительно, консервативная область IgG4 человека включает аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 10. Предпочтительно, антитело конкурирует за связывание ФРН с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность ПОСЛ. ID №:

2. Предпочтительно, связанное с ФРН заболевание или состояние выбрано из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологическом заболевании и боли при эндометриозе и/или боли при фиброме матки. Предпочтительно, антитело против ФРН вводят в дозе, находящейся в диапазоне от примерно 0,001 мг/кг до примерно 30 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 мг/кг до 3 мг/кг, или в одном из остальных диапазонов дозировок, описанных в этом документе. Более предпочтительно, для того, чтобы избежать синдрома рикошета, антитело вводят в более низком диапазоне дозировок, например, в диапазоне от 0,001 мг/кг до 1 мг/кг, или в диапазоне от 0,001 мг/кг до 1 мг/кг или в диапазоне от 0,001 мг/кг до 0,5 мг/кг или в диапазоне от 0,001 мг/кг до 0,3 мг/кг, или в диапазоне от 0,01 мг/кг до 1 мг/кг или в диапазоне от 0,01 мг/кг до 0,5 мг/кг или 0,01 мг/кг до 0,3 мг/кг. Более предпочтительно, для того, чтобы избежать синдрома рикошета, антитело вводят в более низком диапазоне дозировок (как указано выше) и с боле частыми интервалами, например, один раз в неделю, или один раз каждые две недели, или один раз каждые четыре недели.

Изобретение также направлено на создание применения антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для применения с целью ослабления или ингибирования связанного с ФРН заболевания или состояния у субъекта. Неограничивающие примеры связанных с ФРН заболеваний или состояний включают таковые, перечисленные выше. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения боли. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения боли, выбранной из группы, состоящей из боли при остеоартрите, хронической боли в нижней части спины, боли при диабетической невропатии, боли при онкологическом заболевании и боли при эндометриозе и/или фиброме матки. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения боли при остеоартрите. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения хронической боли в нижней части спины. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения боли при диабетической невропатии. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения боли при онкологическом заболевании. В другом варианте воплощения настоящее изобретение направлено на создание антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для лечения боли при эндометриозе и/или фиброме матки. В предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН вводят в дозе, находящейся в диапазоне от примерно 3 мкг/кг до примерно 3000 мкг/кг, или в дозе 100 мкг/кг, или в дозе 300 мкг/кг. В другом предпочтительном воплощении антитело против ФРН по изобретению вводят (например, человеку) внутривенно в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 мг/кг до 0,2 мг/кг, предпочтительно 0,15 мг/кг, однократно каждые 12 недель. В другом предпочтительном воплощении антитело против ФРН по изобретению вводят (например, человеку) подкожно в дозе, находящейся в диапазоне от 0,2 мг/кг до 0,4 мг/кг, предпочтительно 0,3 мг/кг, однократно каждые двенадцать недель. В других вариантах воплощения, антитело против ФРН по изобретению вводят в дозе, находящейся в диапазоне от 0,1 мг/кг до 3 мг/кг, или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 30 мг/кг, или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, или в диапазоне от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 30 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 20 мг/кг, или в диапазоне от 1 мг/кг до 10 мг/кг. Однако другие пригодные диапазоны доз и дозы указаны выше в разделе, касающемся фармацевтических композиций.

В предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН вводят внутривенно. В другом предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН вводят подкожно или внутрисуставно. Однако другие пригодные пути введения указаны выше в разделе, касающемся фармацевтических композиций.

В предпочтительном варианте воплощения антитело против ФРН по изобретению облегчает боль у субъекта, которому антитело вводят в течение длительного периода. Например, в одном из вариантов воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере от примерно одной недели до примерно двенадцати недель (или от по меньшей мере одной недели до двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно одна неделя (или по меньшей мере одна неделя) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно две недели (или по меньшей мере две недели) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно четыре недели (или по меньшей мере четыре недели) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно восемь недель (или по меньшей мере восемь недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере примерно двенадцать недель (или по меньшей мере двенадцать недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В одном из вариантов воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере от примерно четырех недель до примерно двенадцати недель (или от четырех недель до двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту. В другом варианте воплощения антитело облегчает боль на период длительностью по меньшей мере от примерно восьми недель до примерно двенадцати недель (или от восьми недель до двенадцати недель) после введения разовой дозы антитела против ФРН субъекту.

В другом варианте воплощения антитело против ФРН вводят вместе со вторым фармацевтическим агентом или вторым режимом лечения. Антитело и второй агент или антитело и второй режим лечения могут вводиться или проводиться одновременно или, в соответствии с другим вариантом, сначала может вводиться антитело, после чего следует второй фармацевтический агент или второй режим, или сначала могут вводиться или проводиться второй фармацевтический агент или режим, после чего следует антитело. Неограничивающие примеры пригодных вторых фармацевтических агентов и вторых режимов лечения указаны выше в разделе, касающемся фармацевтических композиций. В частности, рассматриваемыми вторыми фармацевтическими агентами для применения в комбинации с антителом по изобретению являются опиоидные анальгетики. Другими предпочтительными вторыми фармацевтическими агентами для применения в комбинации с антителом по изобретению являются ингибиторы TrkA (например, внеклеточные ингибиторы TrkA или внутриклеточные ингибиторы TrkA, как подробно описано в разделе, касающемся фармацевтических композиций) и ингибиторы протеинкиназы С (РКС).

Еще одной особенностью является то, что настоящее изобретение направлено на создание способа ослабления или ингибирования связанного с фактором роста нервов (ФРН) заболевания или состояния у субъекта таким образом, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета, способа, включающего введение субъекту антитела против ФРН по изобретению, такого как антитело против ФРН, содержащее консервативную область IgG4 человека, при этом консервативная область IgG4 человека включает мутацию (предпочтительно, мутацию в шарнирной области), и при этом антитело обладает терминальным периодом полувыведения у яванского макака по меньшей мере 15 дней. В другом варианте воплощения антитело может иметь терминальный период полувыведения у яванского макака в диапазоне от примерно 15 до примерно 22 дней (или в диапазоне от 15 до 22 дней), или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 28 дней (или в диапазоне от 15 до 28 дней), или в диапазоне от примерно 21 дня до примерно 28 дней (или в диапазоне от 21 до 28 дней). В другом варианте воплощения антитело имеет терминальный период полувыведения у крысы по меньшей мере 8 дней. В другом варианте воплощения антитело обладает средним терминальным периодом полувыведения у человека по меньшей мере 10-30 дней (или по меньшей мере 10 дней, по меньшей мере 15 дней, по меньшей мере 20 дней, по меньшей мере 25 дней, по меньшей мере 30 дней, по меньшей мере 40 дней, или в диапазоне от примерно 10 дней до примерно 40 дней, или в диапазоне 10-40 дней, или в диапазоне от примерно 15 дней до примерно 30 дней, или в диапазоне 15-30 дней). Предпочтительные мутации включают мутации, описанные подробно в этом документе ранее. Предпочтительные антитела включают антитела против ФРН с последовательностями и/или имеющие функциональные свойства, описанные подробно в этом документе ранее. Неограничивающие примеры связанных с ФРН заболеваний или состояний включают таковые, описанные подробно в этом документе ранее. Изобретение также предусматривает применение антитела против ФРН по изобретению для получения лекарственного препарата для применения с целью ослабления или ингибирования связанного с ФРН заболевания или состояния у субъекта таким образом, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета (например, антитело вводят в такой дозировке и с такой частотой, чтобы избежать возникновения у субъекта синдрома рикошета).

VI. Изделия

Также в объем настоящего изобретения входят наборы, содержащие антитела по изобретению, которые необязательно включают руководство по применению для лечения связанного с ФРН заболевания или состояния. Эти наборы могут содержать этикетку, указывающую предполагаемое применение содержимого набора. Термин этикетка включает любую надпись, маркетинговые материалы или записанные материалы, поставляемые на или с набором, или иначе сопутствующие набору.

Например, настоящее изобретение также направлено на создание упакованной фармацевтической композиции, при этом антитело PG110 (содержащее тяжелую цепь как указано в ПОСЛ. ID №: 13 и легкую цепь как указано в ПОСЛ. ID №: 16), или его производные формы, как описано в этом документе, упакованы в составе набора или изделия. Набор или изделие по изобретению содержит материалы, полезные для лечения, включая профилактику, лечение и/или диагностику связанного с ФРН заболевания или состояния у субъекта. В предпочтительных воплощениях связанное с ФРН заболевание или состояние является болью при воспалении (в частности, болью, вызванной остеоартритом или ревматоидным артритом), костно-мышечной болью (в частности, хронической болью в нижней части спины), невропатической болью (в частности, болью при диабетической невропатии), болью при онкологических заболеваниях (в частности, болью, вызванной метастазами в кости), болью, ассоциированной с эндометриозом и/или фибромами матки, и послеоперационной болью. Набор или изделие содержит контейнер и этикетку или листовку-вкладыш или печатный материал, нанесенный на контейнер или сопровождающий его, который сообщает информацию, относящуюся к применению антитела PG110 для лечения связанного с ФРН заболевания или состояния, описанного в этом документе.

Набор или изделие означает упакованный продукт, содержащий компоненты, с которыми вводят антитело PG110 для лечения связанного с ФРН заболевания или состояния. Набор предпочтительно содержит коробку или контейнер, в который помещены компоненты набора, и также может включать протокол для введения антитела PG110 и/или "листовку-вкладыш". В коробку или контейнер помещены компоненты по изобретению, которые предпочтительно находятся в пластиковых, полиэтиленовых, полипропиленовых, этиленовых или пропиленовых емкостях. Например, пригодные контейнеры для антитела PG110 включают, среди прочего, бутыли, флаконы, шприцы, шприцы-ручки и т.д.

Термин "листовка-вкладыш" при использовании в этом документе относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических изделий, содержащим информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предостережениях, относящихся к применению таких терапевтических изделий. В одном из вариантов воплощения листовка-вкладыш по изобретению информирует читателя, включая субъекта, например, покупателя, который будет вводить PG110 для лечения, что антитело PG110 предназначено для лечения связанного с ФРН заболевания или состояния, описанного в этом документе. В одном из вариантов воплощения листовка-вкладыш описывает конкретную терапевтическую пользу антитела PG110, в том числе облегчение боли. В другом варианте воплощения листовка-вкладыш может включать описание дозировки антитела PG110. В другом варианте воплощения листовка-вкладыш может включать описание пути и частоты введения антитела PG110. В другом варианте воплощения листовка-вкладыш по изобретению может также предоставлять субъекту, который будет принимать антитело PG110, информацию относительно комбинированных применений для целей как безопасности, так и эффективности. Например, в некоторых воплощениях набор дополнительно содержит вторую фармацевтическую композицию, включающую дополнительное терапевтическое средство, упакованную совместно или продвигаемую на рынке совместно, с руководством по введению обоих агентов для лечения связанного с ФРН заболевания или состояния. В частности, предпочтительные заболевания и состояния для лечения с применением наборов по изобретению включают боль при воспалении (в частности, боль, вызванную остеоартритом или ревматоидным артритом), костно-мышечную боль (в частности, хроническую боль в нижней части спины), невропатическую боль (в частности, диабетическую невропатию), боль при онкологических заболеваниях и боль, вызванную метастазами в кости, боль, ассоциированную с эндометриозом и/или фибромами матки и послеоперационную боль.

Другие воплощения настоящего изобретения описаны в следующих примерах. Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не должны истолковываться как дополнительно лимитирующие. Содержание списков последовательностей, фигуры и все ссылки, патенты и опубликованные заявки на патент, цитируемые в настоящей заявке, специально включено в этот документ в качестве ссылки.

Примеры

Пример 1; Конструирование антитела против ФРН, PG110, с мутантной шарнирной областью IgG4

В этом примере мутантную форму гуманизированного антитела против ФРН создали с помощью внесения замены серина на пролин в шарнирной области в состав консервативной области IgG4.

Были применены вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела против ФРН alphaD11. Гуманизированное антитело alphaD11 подробно описано в публикациях РСТ WO 2005/061540 и WO 2006/131951. Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи alphaD11 (Hu-alphaD11 V_H) показана в ПОСЛ. ID №: 1. Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи alphaD11 (Hu-alphαD11 V_L) показана в ПОСЛ. ID №: 2. Области CDR1, 2 и 3 в составе Hu-alphaD11 V_H показаны в ПОСЛ. ID №№: 3, 4 и 5, соответственно. Области CDR1, 2 и 3 в составе HualphaD11 V_L показаны в ПОСЛ. ID №№: 6, 7 и 8, соответственно.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей Hu-alphaD11 V_H была присоединена к 3'-концу консервативной области IgG4-Pro (Lonza Biologic) (которая кодирует мутацию, соответствующую замене аминокислотного остатка 108 в консервативной последовательности с серина на пролин). Сигнальная последовательность, полученная из IgGI мыши, была присоединена к 5'-концу для получения полной последовательности кДНК для тяжелой цепи Hu-alphaD11. Аминокислотная последовательность дикого типа консервативной области IgG4 человека показана в ПОСЛ. ID №: 9, а аминокислотная последовательность мутантной консервативной области IgG4 человека показана в ПОСЛ. ID №: 10. В составе ПОСЛ. ID №№: 9 и 10 аминокислота, которая заменена с серина (в ПОСЛ. ID №: 9) на пролин (в ПОСЛ. ID №: 10), расположена в позиции аминокислоты 108.

Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей Hu-alphaD11 V_L, была присоединена к 3'-концу консервативной области каппа человека (поставляемой компанией Lonza Biologies), и сигнальная последовательность, полученная из IgGI мыши, была присоединена к 5'-концу для получения полноразмерной последовательности, кодирующей вариабельную область легкой цепи.

Так как антитело должно было экспрессироваться в клетках яичника китайского хомячка (клетках СНО), провели оптимизацию кодона (Geneart; с применением программного обеспечения GeneOptimizer™), что включало адаптацию последовательностей антитела к отклонению от равномерности в использовании. кодонов, характерному для генов Cricetulus griseus (китайского хомячка). Дополнительно, избегали областей очень высокого (>80%) или очень низкого (<30%) содержания GC, где это было возможно. В ходе процесса оптимизации избегали цис-действующих последовательностей следующих мотивов: внутригенные ТАТА-боксы, chi-сайты и сайты присоединения рибосомы; участки АТ-богатых или GC-богатых последовательностей; последовательности элементов ARE, INS, CRS (вовлеченных в репликацию вектора в бактериях); повторяющихся последовательностей и вторичных структур РНК; (криптических) донорных и акцепторных сайтов сплайсинга и точек разветвления; заданных внутригенных сайтов узнавания для ферментов рестрикции (Eco RI, Hind III, Pvu I и Not I). Оптимизация последовательности генов антитела, включая оптимизацию использования кодонов, и экспрессия генов антитела в клетках СНО дополнительно подробно описаны в заявке РСТ WO 2006/122822, принадлежащей компании Lonza Biologies PLC.

Оптимизированные последовательности тяжелой и легкой цепей (включающие сигнальную последовательность) клонировали в GS-вектора рЕЕ6.4 и рЕЕ12.4, соответственно (поставляемые компанией Lonza Biologies), с получением двух векторов, содержащих по одному гену (SGV). После этого сконструировали вектор, содержащий два гена (DGV), путем лигирования полной экспрессионной кассеты из вектора тяжелой цепи в вектор легкой цепи с созданием единого вектора, экспрессирующего полные гены как тяжелой, так и легкой цепей, а также ген GS (глутаминсинтетазы).

Полученное в результате мутантное антитело назвали PG110. Нуклеотидная последовательность полной тяжелой цепи PG110 (включающей сигнальную последовательность, вариабельную область и мутантную консервативную область IgG4) показана в ПОСЛ. ID №: 11. Аминокислотная последовательность полной тяжелой цепи PG110 (включающей сигнальную последовательность, вариабельную область и мутантную консервативную область IgG4) показана в ПОСЛ. ID №: 12, при этом аминокислотные остатки 1-19 составляют сигнальную последовательность, а аминокислотные остатки 20-141 составляют вариабельную область. Аминокислотная последовательность зрелой тяжелой цепи PG110, без сигнальной последовательности (включающей вариабельную область и мутантную консервативную область IgG4) показана в ПОСЛ. ID №: 13.

Нуклеотидная последовательность полной легкой цепи PG 110 (включающей сигнальную последовательность, вариабельную область и консервативную область каппа) показана в ПОСЛ. ID №: 14. Аминокислотная последовательность полной легкой цепи PG110 (включающей сигнальную последовательность, вариабельную область и консервативную область каппа) показана в ПОСЛ. ID №: 15, при этом аминокислотные остатки 1 -20 составляют сигнальную последовательность, а аминокислотные остатки 21-127 составляют вариабельную область. Аминокислотная последовательность зрелой легкой цепи PG110, без сигнальной последовательности (включающей вариабельную область и консервативную область каппа) показана в ПОСЛ. ID №: 16.

Для проверки экспрессии антитела PG110 вектором DGV, кодирующим тяжелую и легкую цепи антитела PG110, временно трансфецировали клетки СНОК1 SV (поставляемые компанией Lonza Biologies). Клетки (0,125×10⁶ жизнеспособных клеток на лунку) посеяли на 24-луночные планшеты в среде на основе DMEM с добавлением 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота и 6 мМ L-глутамина и инкубировали в течение ночи при 37°С (инкубатор с 10% CO₂). Перед трансфекцией среду для посева заменили на 800 мкл свежей среды и инкубировали клетки в течение 1 ч при 37°С.

Для каждой трансфекции 5 мкл PG110 DGV ресуспендировали в 100 мкл среды для трансфекции (OptiMEM, Invitrogen). В качестве позитивного контроля использовали вектор, кодирующий другой антитело IgG4/Kanna, и в качестве негативного контроля использовали буфер без вектора. Для каждой трансфекции 5 мкл реагента Lipofectamine-2000 (Invitrogen) разбавили в 100 мкл среды для трансфекции. После 5 мин инкубации при комнатной температуре ДНК и разбавленный реагент Lipofectamine объединили, перемешали и оставили при температуре окружающей среды на 20 мин. После этого данную смесь объемом 205 мкл добавили в лунку 24-луночного планшета, содержащую клетки. Клетки инкубировали в течение 68-72 ч при 37°С. Собрали супернатант культуры и осветлили центрифугированием перед проведением количественного определения присутствия антитела.

Количественное определение в среде от трансфецированных клеток проводили с помощью стандартного метода ELISA для собранных IgG. Он включает связывание проб и стандартов на 96-луночном планшете, покрытом антителами против IgG Fc человека. Связанный аналит выявляли с применением антитела против каппа-цепи человека, конъюгированного с пероксидазой хрена, и хромогенного субстрата тетраметилбензидина. Развитие окраски было пропорционально количеству собранного антитела, присутствующему в пробе. Стандартные пробы приготавливали из коммерчески приобретенного исходного раствора антитела IgG4/каппа. Результаты продемонстрировали, что DGV, кодирующий тяжелую и легкую цепи PG110, был способен экспрессировать собранное антитело.

Пример 2: Параметры связывания мутантного антитела PG110 против ФРН

В этом примере исследовали специфичность связывания и кинетику связывания PG110, мутантного антитела против ФРН, приготовленного как описано в примере 1.

А. Специфичность связывания

Профиль селективности связывания PG110 с нейротрофинами человека определяли с применением твердофазного иммуноферментного анализа связывания (ELISA). Планшеты для ELISA покрыли 100 нг/лунку ФРН человека (R&D Systems, кат. №256-GF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) (R&D Systems, кат. №248-BD), нейротрофина 3 (NT3) (R&D Systems, кат. №267-N3) или нейротрофина 4 (NT4) (R&D Systems, кат. №268-N4). PG110 добавили в покрытые нейротрофинами лунки в концентрации, находящейся в диапазоне от 3 пМ до 3 нМ. После отмывки (PBS в 0,5% (по объему) Tween 20, рН 7,3), связывание PG110 детектировали с помощью биотинилированного антитела против IgG человека (Rockland Immunochemical Inc., кат. №609-1602), конъюгированного со стрептавидин-связанной щелочной фосфатазой (Sigma Aldrich, кат. № S2890), с последующим развитием цветной реакции путем добавления 4-метилумбеллиферилфосфата (Sigma Aldrich, кат. № М3168). Продукт реакции количественно оценивали с помощью флуориметра (возбуждение при 360 нм; испускание при 440 нм).

Результаты резюмированы в графике на фигуре 1. Связывание PG110 в покрытых ФРН человека лунках демонстрировало концентрационную зависимость, с концентрацией, соответствующей половине максимального связывания, равной 726 пМ (получена в результате определения в трех повторах на одном планшете для анализа). В противовес этому, не наблюдалось заметного связывания PG110 с анализируемыми лунками, покрытыми BDNF, NT3 или NT4 человека, которые в ином случае давали детектируемый ответ при использовании в качестве позитивного контроля антител, специфичных к этим нейротрофинам. Эти результаты демонстрируют, что PG 110, при испытании в концентрации вплоть до 3 нМ in vitro, специфично связывается с ФРН человека и не показывает перекрестной реактивности по отношению к родственным нейротрофинам.

Б. Кинетика связывания

BIAcore-анализ использовали для оценки кинетики связывания при взаимодействии между PG110 и либо рекомбинантным ФРН крысы (rrNGF), либо рекомбинантным ФРН человека (rhNGF).

Рекомбинантный бета-фактор роста нервов человека (rhNGF) (R&D Systems, кат.№256 GF/CF) или рекомбинантный бета-фактор роста нервов крысы (rrNGF) (R&D Systems, кат.No. 556 GF/CF) ковалентно иммобилизовали на сенсорных чипах СМ5 (GE Healthcare, ранее Biacore AB, Упсала, Швеция) через первичные аминогруппы с использованием набора для аминосшивки (GE Healthcare), с HBSEP (10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES), 150 мМ NaCl, 3 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и 0,005% Tween® 20, рН 7,4) в качестве электродного буфера. Поверхность сенсорного чипа активировали введением смеси 400 мМ N-(3-диметиламинопропил)-М'-этилкарбодиимида (EDC) и 100 мМ N-гидроксисукцинимида (NHS) (1:1, по объему) в течение 7 мин при скорости потока 10 мкл/мин. Р-ФРН (рекомбинантный человека или рекомбинантный крысы) разбавляли до 200 нг/мл в 10 мМ натрия ацетате, рН 4,0, и разбавленный раствор вносили на активированную поверхность и выдерживали в течение различных периодов времени для получения различной плотности поверхности. Для количественного анализа взаимодействий плотность поверхности 60 RU приготовили внесением 50 мкл разбавленного Р-ФРН (время контакта 5 мин). Не прореагировавшие сложноэфирные группы NHS дезактивировали с помощью 70 мкл (время контакта 7 мин) раствора этаноламина (1 М, рН 8,5).

Параметры экспериментов, проведенных с иммобилизованным ФРН, были следующими: электродный буфер: HBSEP, содержащий 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина; скорость потока: 25 мкл/мин; температура: 37°С; плотность лиганда: 60 RU/60 RU (для rhNGF/rrNGF); аналит: концентрации PG110: 2 нМ, 4 нМ, 8 нМ, 17 нМ, 33 нМ и 66 нМ в электродном буфере; время контакта: 240 сек; время диссоциации: 600 сек; регенерация: 2×1 мин. 10 мМ глицин, рН 1,5.

Оценку данных и кинетики проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5.01, GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) и программного обеспечения BIAevaluation (версия 4.0.1, GE Healthcare), вписывая данные в модель связывания Ленгмюра 1:1.

Результаты резюмированы ниже в таблице 1 (где K_ass означает константу скорости ассоциации, K_diss означает константу скорости диссоциации и K_D означает равновесную константу диссоциации). Данные приведены как среднее ± (стандартная ошибка среднего) для 3 отдельных определений.

Таблица 1 Кинетические константы взаимодействия PG110 с иммобилизованным ФРН Аналит Лиганд K_ass (л.моль^-1 с^-1) K_diss (с^-1) K_D PG110 rhNGF 1,6×10⁶±3,5×10³ 1, 2 ×10^-5±3,0×10^-6 72±2 пМ PG110 rrNGF 1,7×10⁵±2,0×10³ 1,5×10^-5±5,6×10^-6 92±34 пМ

Результаты исследования показали, что взаимодействия PG110 с ФРН характеризовались высокой аффинностью связывания, и не наблюдалось существенного различия в аффинности (K_D) для обоих видоспецифичных гомологов (принадлежащих человеку и крысе).

Дальнейший анализ кинетики связывания проводили с применением материала PG110 Fab, полученного фрагментацией PG110 на папаин-сефарозе (Thermo Scientific). Иммобилизацию rhNGF проводили с применением HBSEP в качестве электродного буфера при 25°С. Поверхности сенсорных чипов активировали введением смеси 200 мМ EDC и 50 мМ NHS (1:1, по объему) в течение 7 мин при скорости потока 10 мкл/мин. rhNGF разбавили до 500 нг/мл в 10 мМ натрия ацетате, рН 4,0, и 20 мкл (время контакта 2 мин) разбавленного раствора вносили на активированные поверхности каждой из трех ячеек для получения уровней иммобилизации 93,1,100,3 и 88,7 RU. Не прореагировавшие сложноэфирные группы NHS дезактивировали с помощью 70 мкл (время контакта 7 мин) этаноламина (1 М, рН 8,5).

Серии концентраций PG110 Fab (0,39, 0,78, 1,56, 3,13, 6,25,12,5 и 25 нМ), в 250 мкл пропускали над свеже-иммобилизованными rhNGF поверхностями при скорости потока 50 мкл/мин, 37°С в электродном буфере HPSEP, содержащем 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. За диссоциацией следили в течение 30 мин, и после завершения анализа взаимодействия была достигнута регенерация с помощью одного введения (30 мкл) 10 мМ глицина, рН 1,5. Дополнительно, для более точного определения очень медленной k_diss наблюдали за диссоциацией одной высокой концентрации (100 нМ) PG110 Fab в течение 8 ч на каждой поверхности с rhNGF и использовали данные для количественной оценки константы скорости диссоциации (k_diss). Данные были вписаны в модель связывания Ленгмюра 1:1 с применением k_diss, определенной по показаниям длительного измерения диссоциации. Для оценки воспроизводимости кинетических констант анализ проводили в трех повторах на трех свеже-иммобилизованных поверхностях. Вычисленные кинетические константы резюмированы в таблице 2.

Таблица 2: Кинетические константы взаимодействия PG110 Fab с иммобилизованным рекомбинантным ФРН человека Аналит Уровень иммобилизации K_ass (л.моль^-1 с^-1) K_diss (с^-1) K_D PG110 Fab 93,1 3,6×10⁵ 1,1×10^-5 31,3 пМ 100,3 3,6×10⁵ 1, 2 ×10^-5 32,7 пМ 88,7 4,4×10⁵ 1, 2 ×10^-5 27,8 пМ Среднее   3,8×10⁵±0,5×10⁵ 1,1×10^-5±0,06×10^-5 30,6±0,25 пМ

Пример 3: Функциональныехарактеристики мутантного антитела PG110 против ФРН

В этом примере различные функциональные характеристики PG110, мутантного антитела против ФРН, приготовленного как описано в примере 1, исследовали с применением анализа in vitro.

А. Ингибирование связывания ФРН с рецепторами TrkA и p75^NTR Исследования по связыванию радиоактивно меченных лигандов проводили для сравнения ингибиторного эффекта PG110 на связывание ФРН с рецепторами TrkA и p75^NTR человека. Клетки НЕК293, экспрессирующие полноразмерные рецепторы человека - либо TrkA, либо p75^NTR, инкубировали с 2 нМ ¹²⁵I-ФРН в присутствии PG110 в конечной концентрации 0,01-100 нМ. Немеченый ФРН (с различными концентрациями от 0 до 1 мкМ) также вносили в реакционные смеси. Реакции проводили в высоких плоскодонных одноразовых пробирках РТ1276 (Thermo Life Sciences). На первом этапе радиоактивно меченый ФРН, немеченый ФРН и антитело and PG110 смешивали и инкубировали в пробирках в течение 10 мин при комнатной температуре, при встряхивании, в буфере для связывания (1 × PBS, 0,9 мМ CaCl₂, 0,5 мМ MgCl₂, 0,1% БСА фракция V, 0,1% (мас./об.) глюкоза). После этого добавили 200 мкл приготовленных клеток (разбавленных до 5×10⁵ клеток/мл). После дополнительных 30 мин инкубации при комнатной температуре с энергичным встряхиванием, каждую реакцию разделили на три пластиковые пробирки (полиэтиленовые микропробирки вместимостью 0,4 мл, Sarstedt 72.700), добавив в каждую пробирку по 100 мкл реакционной смеси. Каждая микропробирка уже содержала 200 мкл 150 мМ раствор сахарозы в буфере для связывания. Затем эти пробирки центрифугировали при 20 000 × g при 4°С в течение 30 сек, чтобы осадить клетки. Сахароза обеспечивает градиент плотности, который служит для отделения любого вытесненного радиоактивно меченного ФРН. После этого пробирки заморозили в бане из сухого льда в этаноле. Затем заостренные части этих замороженных пробирок поместили в отдельные пластиковые пробирки (Naiad Ltd) для подсчета с применением мини-счетчика гамма-излучения LKB Wallac с целью количественного определения ¹²⁵I-ФРН, связанного с клетками.

Результаты проиллюстрированы графиками на фигурах 2А и 2В, при этом эффект PG110 на связывание ФРН с TrkA показан на фигуре 2А, и эффект PG110 на связывание ФРН с p75^NTR показан на фигуре 2В. Ингибирование PG110 связывания ¹²⁵I-ФРН с рецепторами TrkA и p75^NTR носило характер концентрационной зависимости, с геометрическим средним (95% доверительный интервал) значений IC₅₀, равным 170 (88-331) пМ и 206 (86-491) пМ, соответственно (в обоих случаях n=3). Контрольное антитело с тем же изотипом не ингибировало связывание ¹²⁵I-ФРН ни с одним из рецепторов. Эти результаты демонстрируют, что PG110 эффективно блокирует взаимодействие связывания ФРН человека с обоими его рецепторами in vitro.

Б. Количественная оценка пролиферации клеток TF-1

TF-1 - это линия клеток эритромиелоза человека, которые экспрессируют TrkA человека и пролиферируют в ответ на ФРН. В данных экспериментах клетки TF-1 культивировали присутствии 10 нг/мл рекомбинантного ФРН человека, крысы или мыши, с возрастающими концентрациями антитела PG110, и количественно оценивали пролиферацию клеток через 40 ч с применением колориметрического метода анализа, основанного на метаболическом восстановлении желтой соли тетразолия МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида] до пурпурного формазана.

Перед использованием в этом анализе клетки TF-1 культивировали в течение 1 недели в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотку плодов крупного рогатого скота (FBS) с 2 нг/мл ГМ-КСФ (R&D Systems, кат. №215-GM-50). Клетки промывали, ресуспендировали в RPMI-1640+10% FBS до концентрации 300 000 клеток/мл и повторно высевали на 96-луночные микропланшеты (15 000 клеток/лунку в 50 мкл). Не менее чем через 60 мин после добавления на 96-луночные планшеты для анализа клетки обработали рекомбинантным ФРН человека, крысы или мыли (10 нг/мл) в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS (50 мкл/лунку) и содержащей антитело PG110. Среду, содержащую ФРН и испытуемое антитело, готовили в виде 2-кратного раствора относительно концентрации в пробе для анализа по меньшей мере за 30 мин до ее добавления к предварительно высеянным клеткам. Испытуемое антитело применяли для анализа в диапазоне концентраций от 0,6 нг/мл до 24 мкг/мл. В анализ были включены контрольные лунки, которые содержали либо только среду, либо клетки TF-1 в отсутствие ФРН ("клеточная холостая проба"). Каждую обработку проводили трижды. После 40 ч инкубационного периода (37°С, 5% CO₂), проводили количественную оценку пролиферации с применением набора для определения пролиферации клеток с помощью МТТ (АТСС кат. №30-1010К). 10 мкл МТТ-реагента добавили перед дополнительной инкубацией в течение 4 ч при 37°С. После этого лунки инкубировали с реагентом, содержащим детергент (100 мкл/лунку; мягкое помешивание) в течение ночи при комнатной температуре в темноте. После этого зарегистрировали поглощение при 570 им. Конечные средние значения OD для трех повторов измерений вычисляли вычитанием среднего значения для клеточной холостой пробы.

Инкубация клеток TF-1 с ФРН в присутствии PG110 (0,6 нг/мл - 24 мкг/мл) привела к зависимому от концентрации ингибированию пролиферации клеток. Результаты проиллюстрированы графиками на фигурах 3А-3С, где на фигуре 3А показан эффект обработки PG110 на пролиферацию клеток TF-1, стимулированных ФРН человека, на фигуре 3В показан эффект обработки PG110 на пролиферацию клеток TF-1, стимулированных ФРН крысы, и на фигуре 3С показан эффект обработки PG110 на пролиферацию клеток TF-1, стимулированных ФРН мыши. PG110 продемонстрировало схожие эффективности в ингибировании всех трех испытанных гомологов ФРН, и значения IC₅₀ составили примерно 30 нг/мл. Значения IC₅₀ резюмированы ниже в таблице 3 (значения IC₅₀ выражены в нг/мл):

Таблица 3: Резюме по значениям IC₅₀ для PG110 при количественной оценке пролиферации клеток TF-1 Рекомбинантный ФРН человека Рекомбинантный ФРН крысы Рекомбинантный ФРН мыши Геом. среднее 95% доверительный n Геом. среднее 95% доверительный n Геом. среднее 95% доверительный n

  интервал     интервал     интервал   29,4 26,5-32,7 5 27,8 24,5-31,6 5 30,8 27,4-34,5 3

Количественная оценка пролиферации клеток TF-1 демонстрирует, что PG110 с равной эффективностью нейтрализует активацию рецепторов TrkA человека факторами ФРН как человека, так и грызунов.

В. Ингибирование ФРН-зависимого выживания ганглиев заднего корешка спинного мозга цыпленка

Для испытания способности PG110 ингибировать эффект ФРН на чувствительные нейроны применяли анализ in vitro с использованием первичных культур клеток ганглия заднего корешка (DRG), полученных от эмбриона курицы на 8 день. В этих условиях выживание DRG цыплят зависит от присутствия экзогенного ФРН, добавленного в культуральную среду.

Ганглии заднего корешка выделяли у эмбрионов курицы на 8 день и собирали в фалконовские пробирки вместимостью 50 мл (в 5 мл питательной смеси Хэма F-12+Glutamax I: GIBCO 31765027). В каждом эксперименте суммарное количество выделенных ганглиев составляло примерно 400, что приблизительно соответствует 20 эмбрионам. Далее ганглии трипсинизировали в течение 5 мин при 37°С (трипсин-ЭДТА Euroclone, ECB3052D) и диссоциировали с помощью шприца на 10 мл (с "желтой" иглой 20G) 4-5 раз перед центрифугированием в течение 3 мин при 800 об./мин.

После тщательного удаления содержащей трипсин среды клетки ресуспендировали в 10 мл свежей среды (питательная смесь Хэма F-12+Glutamax I), после чего повторили процедуру диссоциации и довели объем среды до достижения посевной концентрации 100 000-400 000 клеток/мл. Клетки высевали без обработке, в половине конечного объема среды, содержащей 20% сыворотку лошади (Euroclone ECS0091L), используя 24-луночные планшеты (Falcon 353047), которые были предварительно покрыты поли-b-лизином (100х=1 мг/мл раствор поли-b-лизина гидробромида; Sigma P2636), растворенным в дистиллированной воде (30 мин под УФ, после чего - 30 мин сушки в стерильном вытяжном шкафу).

После прикрепления клеток к стенкам лунок планшетов (30 мин в 5% СО₂-инкубаторе, 37°С), приготовили растворы либо ФРН, либо ФРН/антитело против ФРН в 2-кратной концентрации в половине конечного объема и добавили в каждую лунку для достижения нужной конечной концентрации (т.е., конечное % содержание сыворотки лошади=10%; конечная концентрация ФРН=5 нг/мл). В анализ были включены контрольные лунки, которые содержали клетки DRG в отсутствие ФРН. Каждое условие было испытано в двух повторах. После добавления смесей либо ФРН, либо ФРН/антитело против ФРН планшеты вернули в инкубатор (5% CO₂, 37°С). Подсчет количества клеток провели через 48 ч, подсчитывая клетки DRG, наблюдаемые вдоль вертикального диаметра каждой лунки (микроскоп Nikon TMS, 10Х увеличение). В подсчет включали только те клетки DRG, которые легко идентифицировались по их морфологическим характеристикам, т.е., округлые, яркие, светопреломляющие клетки с длинными аксонами.

Эффективность антитела PG110 в нейтрализации ФРН испытывали в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 25 мкг/мл для нейтрализации рекомбинантного ФРН человека (rhNGF), рекомбинантного ФРН крысы (rrNGF) или рекомбинантного ФРН мыши (rmNGF). В этих экспериментах 100% ингибирование выживания было эквивалентно количеству клеток, подсчитанных при культивировании клеток без ФРН, в отсутствие антитела против ФРН. И наоборот, 0% ингибирование было эквивалентно количеству клеток, подсчитанных в случае, когда клетки обработали 5 нг/мл соответствующей изоформы ФРН, в отсутствие антитела против ФРН.

Инкубация клеток в присутствии PG110 (10 нг/мл - 25 мкг/мл) привела к зависимому от концентрации снижению выживания клеток, со значениями IC₅₀ от 10 до 50 нг/мл для всех видоспецифичных гомологов ФРН (n=1). Эти данные демонстрируют, что PG110 ингибирует активность ФРН в отношении чувствительных нейронов.

Г. Ингибирование разрастания аксонов клеток PC 12

PC 12 - это линия клеток феохромоцитомы крысы (опухоль, происходящая от хромаффинных клеток), которые экспрессируют рецепторы крысы TrkA и p75^NTR. При культивировании на покрытых коллагеном планшетах в присутствии ФРН клетки PC 12 дифференцируются в нейроны, подобный симпатическим, становясь плоскими и демонстрируя существенное разрастание (аксонов). Ингибирование ФРН-опосредованного разрастания аксонов использовали в качестве полуколичественного метода измерения in vitro способности PG110 ингибировать взаимодействие ФРН с рецепторами крысы TrkA и p75^NTR.

Клетки PC 12 (ECAAC 88022401) подвергли первичному воздействию (т.е., предварительно обработали ФРН) путем промывки 100 000 клеток бессывороточной средой (RPMI-1640 с Glutamax I, Gibco-Invitrogen 61870-010) и повторного посева на покрытые коллагеном пластиковые культуральные флаконы (коллаген I типа, BD 35-4236, использовали в виде рабочего раствора 0,5 мг/мл) в среде RPMI-1640 с Glutamax-I, содержащей 10% FBS и рекомбинантный ФРН крысы (R&D Systems, кат.№556-NG-100) (100 нг/мл). Перед посевом клетки аккуратно пропустили по меньшей мере 5 раз через иглу 21G для дезагрегации комков клеток. Среду, содержащую ФРН, удаляли и заменяли дважды в течение периода предварительной обработки длительностью 1 неделя.

В конце этого периода предварительно обработанные клетки PC 12 промыли бессывороточной средой и трипсинизировали (трипсин-ЭДТА Euroclone, ECB3052D) в течение 2-3 мин во влажном инкубаторе (5% CO₂, 37°С). Трипсин блокировали добавлением содержащей сыворотку среды, и клетки центрифугировали, промывали бессывороточной средой и ресуспендировали в среде RPMI-1640 с Glutamax-I, содержащей 10% FBS. Клетки аккуратно пропустили по меньшей мере 5 раз через иглу 21G для дезагрегации комков клеток перед повторным посевом на покрытые коллагеном чашки Петри при плотности 50 000 клеток/мл. Приготовили по три чашки для каждого анализируемого условия. Для испытания антитела приготовили 2Х инкубационную смесь (рекомбинантный ФРН крысы+антитело против ФРН) за 1 ч перед добавлением к предварительно посеянным клеткам. Конечная концентрация ФРН составляла 20 нг/мл, а антитело против ФРН испытывали в четырех разведениях:

20 мкг/мл, 2 мкг/мл, 200 нг/мл и 20 нг/мл.

Оценку индуцированного ФРН разрастания аксонов проводили через 72 ч. В этой временной точке удаляли среду и промывали клетки не содержащим кальция и магния PBS (GIBCO, 10010) и фиксировали в течение 30 мин раствором 4% формальдегида в PBS. Микроскопические снимки (при 20Х увеличении) получали с применением микроскопа Nikon Eclipse TE2000-E microscope и программного обеспечения Leica IM1000 Image Manager. Оценивали ингибирование разрастания аксонов, и оценки (++;+/-; -) присваивали на основании количества клеток, демонстрирующих фенотип недифференцированных клеток (что соответствует отсутствию явно выраженных аксонов).

Инкубация клеток в присутствии PG110 (20 нг/мл - 20 мкг/мл) ингибировала опосредованное ФРН разрастание аксонов, с очевидным полным ингибированием при 200 нг/мл, что свидетельствует о том, что PG110 является эффективным ингибитором взаимодействия между рекомбинантным ФРН крысы и нативными рецепторами нейротрофинов крысы.

Пример 4: Стабильность in vivo мутантного антитела против ФРН PG110

В этом примере определяли терминальный период полувыведения (T_1/2) антитела PG110 in vivo у крыс и яванских макаков.

А. Исследования на крысах

Крысам линии Спрейг-Даули вводили посредством 10-минутной внутривенной (IV) инфузии антитело PG110 в дозировке 3 мг/кг, 30 мг/кг или 100 мг/кг на 1 и 56 день исследования. Оценку токсикокинетических данных проводили с использованием средней концентрации в сыворотке во временных точках, у 6 животных в каждой точке в каждой группе. Номинальными временными точками отбора проб крови были: до введения препарата и 0,25,1, 3, 6 и 24 ч после введения препарата на 1 и 56 дне исследования, а также в точках 8, 96, 168, 336, 504, 672, 840, 1008 и 1176 ч после введения препарата на 1 дне исследования. Биоанализ проб сыворотки проводили в аналитической лаборатории Alta Analytical Laboratory с применением валидированного метода ELISA. Анализ фармакокинетических данных проводили с применением системы SNBL USA Pharmacokinetics Analysis System 2.0 и программного обеспечения WinNonlin Professional версия 4.0 (Pharsight Corp.)

После IV введения значения T_max (время достижения максимальной концентрации в сыворотке) находились в диапазоне от 0,25 до 1 ч, что соответствовало первым двум временным точкам отбора проб. У всех животных наблюдался двухфазный характер распределения с терминальными периодами полувыведения примерно от 8 до 9 дней. В частности, значения T_1/2, указанные в часах, для трех лечебных групп резюмированы ниже в таблице 4:

Таблица 4: Терминальный период полувыведения PG 110 у крыс линии Спрейг-Даули Уровень дозы f мг/кг) Терминальный период полувыведения (ч) 3 217 30 192 100 207

Таким образом, групповые средние значения периода полувыведения у крыс находились в диапазоне от 192 до 217 ч (8-9 дней).

Б. Первое исследование на макаках

Яванским макакам вводили посредством разовой, примерно 30-минутной внутривенной (IV) инфузии антитело PG110 в дозировке 3 мг/кг, 30 мг/кг или 100 мг/кг. Животные были разделены на самцов и самок; каждую дозу испытывали на 2 самцах и 2 самках (за исключением испытания дозы 30 мг/кг только на 1 самке). Номинальными временными точками отбора проб крови для получения данных токсикокинетического анализа были: сразу после введения препарата (в течение 2 мин после окончания инфузии), 0,25,1, 3, 6,24,48, 96,168,336,504,672, 840,1008,1176, 1344,1512 и 1680 ч после окончания инфузии. Биоанализ проб сыворотки проводили в аналитической лаборатории Alta Analytical Laboratory с применением валидированного метода ELISA. Анализ фармакокинетических данных проводили с применением системы SNBL USA Phannacokinetics Analysis System 2.0 и программного обеспечения WinNonlin Professional версия 4.0 (Pharsight Corp.)

После IV введения значения Тщах (время достижения максимальной концентрации в сыворотке), измеряемые от начала инфузии, находились в диапазоне от времени окончания инфузии до примерно 1,6 ч. У всех животных наблюдался двухфазный характер распределения (за исключением одной самки, получившей дозу 30 мг/кг, у которой наблюдалось резкое снижение во временное точке 504 ч), с терминальными периодами полувыведения примерно от 15 до 22 дней. В частности, значения T_1/2, указанные в часах, для шести лечебных групп резюмированы ниже в таблице 5:

Таблица 5: Терминальный период полувыведения PG110 у яванских макаков Уровень дозы (мг/кг) Пол Терминальный период полувыведения(ч) 3 Самки (n=2) 370 Самцы (n=2) 531 30 Самки (n=1) 471 Самцы (n=2) 450 100 Самки (n=2) 383 Самцы (n=2) 461

Таким образом, групповые средние значения периода полувыведения у яванских макаков находились в диапазоне от 370 до 531 ч (от 15 до 22 дней). Средние значения периода полувыведения были в общем случае больше у самцов, чем у самок, хотя, с учетом небольшого количества исследованных животных, не ясно, является ли это статистически значимым различием.

В. Второе исследование на макаках

Яванским макакам делали ежедневные внутривенные инфузии антитела PG110 в течение периода 4 недеж. Приблизительно 30-минутную внутривенную (IV) инфузию антитела PG110 в дозировке 3 мг/кг, 30 мг/кг или 100 мг/кг делали на 1, 8, 15 и 22 день. Животные были разделены на самцов и самок; каждую дозу испытывали на 3 самцах и 3 самках. Серийные пробы крови отбирали в следующих номинальных временных точках: до введения препарата, сразу после введения препарата (в течение 2 мин после окончания инфузии), 0,25, 1, 3, 6,24, и 168 ч после окончания инфузии на 1 и 22 день.

Дополнительные пробы отбирали у всех животных до введения препарата на 15 день и у животных, прошедших период восстановления, через 336, 504, 672, 840, 1008, 1176, 1344, 1512, 1680, 1848, 2016 и 2208 ч после введения последней дозы на 22 день. Указанное в часах время, начиная с 24 ч после инфузии, соответствует дням фармакокинетического анализа 1, 7,14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 и 92. Все фактические временные точки отбора проб крови конвертировали в формат относительно начала инфузии.

Биоанализ проб сыворотки на концентрацию PG110 проводили в аналитической лаборатории Alta Analytical Laboratory с применением валидированного метода ELISA. Анализ фармакокинетических данных проводили с применением системы SNBL USA Pharmacokinetics Analysis System 2.0 и программного обеспечения WinNonlin Professional версия 4.0 (Pharsight Corp.)

После IV введения групповые средние значения T_max (время достижения максимальной концентрации в сыворотке), измеряемые от начала инфузии, находились в диапазоне примерно от 0,6 ч до 2,6 ч. У всех животных наблюдался двухфазный характер распределения с терминальными периодами полувыведения примерно 21-28 дней (от 503 до 685 ч). В частности, значения T_1/2, указанные в часах, для шести лечебных групп резюмированы ниже в таблице 6:

Таблица 6. Терминальный период полувыведения PG110 у яванских макаков Уровень дозы (мг/кг) Пол Терминальный период полувыведения (ч) 3 Самки (n=3) 503 Самцы (n=3) 564 30 Самки (n=3) 511 Самцы (n=3) 619 100 Самки (n=3) 532* Самцы (n=3) 685 * на основании значений для n=2

Таким образом, групповые средние значения периода полувыведения у яванских макаков находились в диапазоне примерно от 21 до 28 дней. Средние значения периода полувыведения были в общем случае больше у самцов, чем у самок, хотя, с учетом небольшого количества исследованных животных, не ясно, является ли это статистически значимым различием.

Пример 5: Эффективность PG110 по сравнению с антителом-предшественником крысы

В данном примере проводили дополнительные эксперименты с применением количественной оценки пролиферации клеток TF-1 (как описано в примере 3 В выше) для сравнения эффективности антитела PG110 в нейтрализации ФРН с таковой его предшественника, αD11 крысы. Антитело αD11 крысы было поставлено в двух различных сериях, в одной концентрация исходного раствора была 0,73 мг/мл, и в другой концентрация исходного раствора была 0,63 мг/мл. Антитела PG110 и αD11 оценивали путем количественного определения пролиферации клеток TF-1, опосредованной ФРН человека или ФРН крысы, с применением набора для определения пролиферации клеток с помощью МТТ (АТСС кат. №30-1010К).

Перед применением для анализа клетки TF1 культивировали в течение одной недели в RPMI-1640 (АТСС кат. №30-2001), содержащей 10% сыворотку плодов крупного рогатого скота (FBS, Cambrex DEI 4-80 IF, лот 6SB0006) с 2 нг/мл ГМ-КСФ (R&D Systems, кат. №215-GM-50). Клетки промывали, ресуспендировали в RPMI-1640+10% FBS до концентрации 300 000 клеток/мл и повторно высевали на 96-луночные микропланшеты (15 000 клеток/лунку в 50 мкл).

Не менее чем через 60 мин после добавления на 96-луночные планшеты для анализа клетки обработали рекомбинантным ФРН либо человека, либо мыли (10 нг/мл) в культуральной среде (10% FBS в RPMI-1640; 50 мкл/лунку), содержащей антитело против ФРН. Среду, содержащую ФРН и испытуемое антитело, готовили в виде 2-кратного раствора относительно концентрации в пробе для анализа по меньшей мере за 30 мин до ее добавления к предварительно высеянным клеткам. Испытуемые антитела применяли для анализа в диапазоне концентраций от 0,6 нг/мл до 24 мкг/мл. В анализ во всех случаях включали контрольные лунки, которые содержали либо только среду, либо клетки TF-1 в отсутствие ФРН ("клеточная холостая проба"). Каждую обработку проводили трижды. После 40 ч периода инкубации (37°С, 5% СО₂), 10 мкл МТТ-реагента добавили перед дополнительной инкубацией в течение 4 ч при 37°С. После этого лунки инкубировали с реагентом, содержащим детергент (100 мкл/лунку; мягкое помешивание) в течение ночи при комнатной температуре в темноте. После этого зарегистрировали поглощение при 570 нм. Конечные средние значения OD для трех повторов измерений вычисляли вычитанием средних значений для клеточной холостой пробы. В качестве максимального ингибирования было принято среднее значение OD, наблюдаемое при культивировании клеток без ФРН, в отсутствие испытуемого антитела. В качестве нулевого уровня ингибирования было принято среднее значение OD, наблюдаемое при культивировании клеток при обработке 10 нг/мл ФРН, в отсутствие испытуемого антитела.

Ингибиторную эффективность антител против ФРН вычисляли как значения IC₅₀ (т.е., концентрацию антитела, необходимую для снижения ФРН-опосредованного пролиферативного ответа на 50%) с применением программного обеспечения GraphPad Prism версия 5.01. Кривые ингибирования наносили на графики каждую индивидуально для получения отдельных значений IC₅₀ для каждого испытуемого антитела в каждом эксперименте. Показатели пролиферации клеток нормировали относительно максимальных значений OD, полученных при данном количественном определении, в отсутствие добавленного испытуемого антитела. После этого нормированные количественные показатели ответа наносили на график зависимости от концентрации антитела с логарифмической шкалой и выводили значения IC₅₀ с помощью функции программы GraphPad Prism nonlinear вычерчивания нелинейной кривой по точкам "lg(концентрация ингибитора) относительно ответа - переменная крутизна".

Ингибиторный эффект PG110 в сравнении с его предшественником, антителом αD11 крысы, резюмирован ниже в таблице 7.

Таблица 7. Резюме значений IC₅₀ (нг/мл) при количественной оценке пролиферации клеток TF1 Антитело ФРН человека ФРН крысы Геом. среднее 95% доверительный интервал n Геом. среднее 95% доверительный интервал n PG110 27,0 25,8-28,3 2 26,2 13,6-50,4 2 αD11 крысы (серия 1) 63,7 35,7-114 3 44,8 31,4-64,1 3

αD11 крысы (серия 2) 107   1 54,9   1

Из результатов видно, что антитело PG110 обладает примерно в 2 раза более высокой эффективностью в нейтрализации активности ФРН, по сравнению с его предшественником, антителом αD11 крысы. Дополнительно, значения показателей эффективности, полученные для αD11 крысы, серия 2, предполагают, что эта серия может иметь более низкую эффективность, чем материал из серии 1.

Пример 6: Антитело против ФРН PG110 не вызывает синдром рикошета в модельной системе на животных

В данном примере применяли модель повреждения кожи у крыс для оценки активности моноклонального антитела PG110. Модель повреждения кожи у крыс разработана на основе наблюдений, показавших, что у крыс, получивших антитело против ФРН, развивается ответ в виде зуда, с дозо-зависимым увеличением количества наблюдаемых почесываний. Повреждение не было ассоциировано со снижением иннервации эпидермы. Дополнительно, у крыс наблюдалось быстрое восстановление после прекращения введения антитела. Активность, вызывающая повреждение кожи, наблюдали у грызунов, поведенческой особенностью которых является груминг. Не ограничиваясь каким-то одним механизмом, исследователи высказали гипотезу, что крысы, получившие антитело против ФРН, продолжают совершать груминг из-за нарушения обратной связи, необходимой для прекращения ответа в виде почесывания, что приводит к повреждению кожи. Далее, повреждениям кожи может быть дана количественная оценка как показатель активности антитела против ФРН у крыс.

В различных клинических исследованиях активности антител против ФРН (таких как гуманизированное антитело RN-642, дополнительно описанное в публикации патента США №20040237124 и работе Abdiche, Y.N. et al. (2008) Protein Sci. 17:1326-1335) сообщалось, что эффективность антитела снижается на некоторый период времени после введения дозы (например, на 14-21 день после введения дозы), после чего следует восстановление активности антитела. Имеются сообщения об усилении боли и/или усилении нежелательных явлений (таких как аномальная чувствительность, в диапазоне от аллодинии до чувства покалывания или пощипывания) в период после ведения дозы, когда активность антитела снижена. Это снижение активности антитела на некоторый период времени после введения дозы называется в этом документе "синдромом рикошета".

Для оценки эффекта антитела PG110 на груминг и почесывания у находящихся в сознании крыс самцам и самкам крыс линии Спрейг-Даули вводили моноклональное антитело PG110 (0,003, 0,01, 0,03, 0,3 или 3 мг/кг) в виде внутривенной ударной дозы или в виде контрольной дозы с носителем. Крысы получали одну дозу еженедельно в течение четырех недель. Критериями оценки были: количество эпизодов груминга и почесывания, температура тела, латентный период облизывания лап, латентный период прыжка (попытки избегания) и количество и оценка тяжести повреждений кожи в течение периода времени.

Результаты продемонстрировали, что не наблюдается повреждений кожи у крыс, которым вводили носитель, в то время как в группах крыс, которым вводили PG110, повреждения кожи наблюдались у всех животных при всех испытанных дозировках антитела. Дополнительно, количество и степень тяжести повреждений кожи повышались в течение времени и увеличивались с увеличением дозировок антитела. Количество эпизодов почесывания также было повышенным у животных, которым вводили антитело, но введение антитела не оказывало никакого влияния на груминг, температуру тела, латентный период облизывания лап или латентный период прыжка (попыток избегания).

Степень тяжести повреждений кожи количественно оценивали с применением оценки повреждений, которая равна количеству повреждений, умноженному на площадь (в мм) повреждений. Оценки повреждений с течением времени для обработки антителом PG110, в сравнении с носителем, показаны на графике фигуры 4. Результаты свидетельствуют, что получавшие PG110 крысы демонстрировали устойчивое повышение оценок повреждений с течением времени, в частности, при наибольших испытанных дозах (0,3 мг/кг и 3 мг/кг). То есть, антитело не вызывало существенного синдрома рикошета за период времени проведения эксперимента, что предполагает возможность выбора параметров дозировки и частоты введения для применения у человека таким образом, чтобы избежать синдрома рикошета.

Таким образом, резюмируя, модель повреждения кожи у крыс демонстрирует преимущество антитела против ФРН PG110, которое состоит в том, что антитело PG110 не вызывает заметный синдром рикошета, о котором сообщалось для других антител против ФРН, и это предполагает, что PG110 демонстрирует более стабильную и длительную активность т vivo. He ограничиваясь каким-то одним механизмом, полагают, что эта способность PG110 избегать синдрома рикошета in vivo связана с увеличенным терминальным периодом полувыведения, наблюдаемом у этого антитела.

Пример 7; Фармакокинетика PG110 у человека

Ожидается, что PG110 будет иметь период полувыведения у человека примерно 10-30 дней (диапазон от 10 до 40 дней) с многофазным характером распределения. Исходя из целевого значения C_min ~0,25 мкг/мл (диапазон от ~0.13 мкг/мл до 0,40 мкг/мл), ожидается, что для человека будут эффективны внутривенные дозы 10 мг (~0,15 мг/кг; диапазон от ~0,1 мг/кг [5 мг] до ~0,2 мг/кг [15 мг]) каждые 4-12 недель и подкожные дозы 20 мг (~0,3 мг/кг; диапазон от -0,2 мг/кг [15 мг] до ~0,4 мг/кг [30 мг]) каждые 4-12 недель.

Предсказанные значения фармакокинетических параметров для человека были основаны на данных о концентрации, полученных для двух видов (крыса и обезьяна). Прогнозирование фармакокинетики у человека проводили с применением множества способов, которые включают масштабирование фармакокинетических параметров обезьяны и крысы, фиксированное аллометрическое масштабирование и способы, основанные на доклинических и клинических данных, полученных для других моноклональных антител. Прогнозирование проводили как для моно-, так и для бифазного распределения.

Способ 1: Предсказанные значения фармакокинетических параметров для человека были основаны на 2-компонентной модели, соответствующей вычерченным по точкам профилям кривой концентрация PG110-время у двух видов (крыса и обезьяна). Фармакокинетические параметры PG110 для человека были предсказаны с применением аллометрического масштабирования с фиксированными экспонентами фармакокинетических параметров для обезьяны и крысы.

Для клиренса:

Для объема распределения;

Таблица 8. Предсказания значений фармакокинетических параметров для человека на основании аллометрического масштабирования с фиксированными экспонентами   V₁ мл/кг Клиренс CL мл/ч/кг V₂ мл/кг CL_D мл/ч/кг   Соответствующие модели фармакокинетические параметры Крыса 40,2 0,22 36,5 2,23 Обезьяна 29,3 0,10 31,1 1,78   Предсказанные фармакокинетические параметры для человека Предсказанные значения для человека на основании данных для крысы 40,2 0,034 36,5 0,35 Предсказанные значения для человека на основании данных для обезьяны 29,3 0,042 31,1 0,75 Среднее 34,7 0,038 33,8 0,55

После этого вычислили период полувыведения PG110 у человека на основании предсказанных значений CL и V₁ у человека, предсказанный период полувыведения PG110 у человека составил 26 дней.

Способ 2: Предсказанные значения фармакокинетических параметров для человека были основаны на данных, полученных для двух видов (крыса и обезьяна). Значения CL и V для человека были спрогнозированы с применением того же способа, что и в Способе 1. Период полувыведения PG110 для человека был предсказан с применением модифицированного аллометрического масштабирования с фиксированной экспонентой, равной 0,25:

Таблица 9. Предсказания значений фармакокинетических параметров для человека на основании модифицированного аллометрического масштабирования с фиксированной экспонентой   Клиренс CL (мл/ч/кг) V_ss (мл/кг) t_1/2(дни) Крыса Обезьяна Крыса Обезьяна Крыса Обезьяна Наблюдаемые для PG110 0,22 0,098 70 60 8,6 19.1 Предсказанные значения для человека 0,0343 0,0410 70 60 35,2 37 Предсказанные значения для человека (среднее) 0,0376 65 36

Предсказанный с применением способа 2 период полувыведения PG110 у человека составил 36 дней.

Способ 3: Прогнозирование фармакокинетики у человека на основании данных по PG110 для обезьяны и крысы и доклинических и клинических фармакокинетических параметрах, полученных для других моноклональных антител. Масштабирование проводили на основе периода полувыведения PG110, наблюдаемого у крыс и обезьян и соотношения крыса/человек и обезьяна/человек периодов полувыведения других моноклональных антител. Расчетные фармакокинетические параметры (клиренс, объем распределения и период полувыведения) других моноклональных антител у крысы и обезьяны сначала сравнили с таковыми, полученными в клинических исследованиях. Различия между крысой, обезьяной и человеком вычисляли как соотношение показателей крыса/человек и обезьяна/человек. После этого вычисляли фармакокинетические показатели PG110 для человека на основании его фармакокинетических параметров у крысы и обезьяны, с поправкой на соотношения крыса/человек и обезьяна/человек для других моноклональных антител. Предсказанный с применением способа 3 период полувыведения PG110 у человека составил 11-29 дней.

Таблица 10. Предсказания значений фармакокинетических параметров для человека на основании предшествующих экспериментов с другими моноклональными антителами   Клиренс CL (мл/ч/кг) V_ss (мл/кг) t_1/2 (дни)   R/H М/Н R/H М/Н R/H М/Н Антитело 1 1,35 1.88 1,33 0,53 0,93 0,69

Антитело 2 3,57 1,43 1,65 0,72 0,44 0,49 Антитело 3 1,58 1,46 1,35 0,71 1,05 0,78 Среднее 2,17 1.59 1,45 0,65 0,81 0,65                 Крыса Обезьяна Крыса Обезьяна Крыса Обезьяна Наблюдаемые для PG110 0,22 0,098 70 60 8,6 19,1 Предсказанные для человека значения 0,101 0,062 48,4 92,0 11 29 R/H: крыса/человек, М/Н: обезьяна/человек

Способ 4: Предсказанные значения фармакокинетических параметров для человека были основаны на 2-компонентной модели, соответствующей вычерченным по точкам профилям кривой концентрация PG110-время у двух видов (крыса и обезьяна). Фармакокинетические параметры PG110 для человека были предсказаны с применением аллометрического масштабирования с регрессией фармакокинетических параметров для обезьяны и крысы.

Для клиренса и объема распределения:

Log (фармакокинетический параметр)=а×Log (BW)+b

Линейную регрессию осуществляли на основании фармакокинетических параметров крысы и обезьяны и массы тела (BW) для оценки углового коэффициента (а) и точки пересечения с осью у (b). После этого вычисляли фармакокинетические параметры PG110 для человека, используя типичную массу тела человека (BW) и расчетные значения углового коэффициента и точки пересечения с осью y.

Таблица 11. Предсказания значений фармакокинетических параметров для человека на основании аллометрического масштабирования с регрессией   Масса тела (BW)кг LnBW кг V1 мл Клиренс CL мл/ч V2 мл CL_D мл/ч Крыса 0,25 -1,387 2,307 -2,907 2,210 -0,585 Обезьяна 5 1,609 4.988 -0,680 5,047 2,188 Расчетный угловой коэффициент и точка пересечения с осью у на основании линейной регрессии Угловой     0,8949 0,7432 0,947 0,9255

коэффициент Пересечение с осью y   3,5475 -1,8766 3,523 0,6982   Предсказанные фармакокинетические параметры для человека Человек 70 4,248 1555 3,600 1894 103

После этого вычислили период полувыведения PG110 у человека на основании предсказанных для человека фармакокинетических параметров. Предсказанный период полувыведения PG110 у человека составил 12 дней.

Исходя из результатов, полученных этими способами, ожидается, что PG110 будет иметь период полувыведения у человека примерно 15-30 дней (диапазон от 10 до 40 дней) с двухфазным характером распределения (предсказанные фармакокинетические параметры: V₁=2,5 л, CL=5,0 мл/ч, V₂=2,5 л, CL_D=40 мл/ч).

Пример 8; Лечение остеоартрита у человека с применением PG110

Было начато клиническое испытание на людях для проверки безопасности, переносимости и фармакокинетики PG110 у пациентов с болью, характерной для остеоартрита коленного сустава. Дизайн исследования и предварительные результаты описаны ниже.

В данном I фазы, одноцентровом, плацебо-контролируемом, двойном слепом, с разовой возрастающей дозой исследовании оценивали 6 (шесть) уровней дозы: 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3 и 1 мг/кг. Для каждого уровня дозы когорту из 7 пациентов с болью, характерной для остеоартрита коленного сустава, (всего 42 пациента) случайным образом разделили в соотношении 6:1 для получения активного лечения или плацебо. Каждому пациенту вводили разовую дозу PG110 или плацебо внутривенно в течение интервала времени 2 ч утром в день начала испытания (день 0) после легкого завтрака. Пациенты оставались в отделении клинической фармакологии (CPU) до истечения периода примерно 24 ч после начала инфузии (день 1) и совершали повторные визиты на 4, 7,14,21, 28, 56 и 84 день исследования.

Пробы крови для количественного определения PG110 отбирали в день начала исследования (день 0) (до введения препарата, через 1, 2, 3, 6 и 12 ч) и на 1,4, 7, 14, 21, 28, 56 и 84 день после введения препарата. Концентрацию PG110 в сыворотке определяли с применением валидированного метода количественного анализа ELISA. Также проводили количественное определение антител против PG110 в пробах, взятых в день 0 (до введения препарата), 14, 28, 56 и 84.

В данном исследовании проводили оценку фармакодинамических параметров, включая оценку боли пациентом, опросник для определения индекса остеоартрита Университетов Западного Онтарио и Макмастера (WOMAC™), опросник для определения выраженности боли по Мак-Гиллу, тест с шестиминутной ходьбой, ультразвуковое исследование коленного сустава и определение высокочувствительного С-реактивного белка.

Предварительные результаты по оценке боли пациентами резюмированы в таблице 12. Оценку боли пациентами использовали в качестве оценки выраженности боли. Пациентов просили оценить их ответ по шкале 0-100 мм ВАШ, где 0 мм соответствует отсутствию боли, а 100 мм соответствует самой сильной боли.

Таблица 12. PG110 у пациентов с остеоартритом: Оценка боли пациентом (ВАШ)   Оценка боли пациентом (ВАШ, мм, изменение относительно

  исходного уровня) (среднее ± стандартное отклонение) Время (дни) Плацебо 0,003 мг/кг 0,01 мг/кг 0,03 мг/кг 0.1 мг/кг 0,3 мг/кг 4 -7,2±13,1 -15,8±23,0 -22,8±28,6 -16,5±17,5 -23,0±17,6 -31,7±18,2 7 -10,2±12,1 -14,8±23,4 -12,3±25,9 -26,0±17,2 -34,8±20,3 -32,5±18,2 14 -10,6±14,3 -29,7±15,8 -12,5±21,7 -15,5±22,7 -24,3±28,3 0,5±17,2 21 -11, 2 ±24,1 -30,5±23,9 -16,3±24,9 -25,5±24,1 -23,3±40,7 -20,0±18,5 28 -9,6±11,9 -28,3±25,9 -16,5±22,8 -30,7±22,5 -45,2±22,4 -35,3±20,5 56 0,5±15,0 -24,3±25,8 -11,8±19,8 -24,0±19,8 -48,8±23,7 -52,8±19,3 84 -7,8±16,4 -25,0±20,7 -9,2±18,2 -21,0±23,2 -29,3±37,1 -34,0±26,0 Максимальная оценка боли пациентом (ВАШ, мм) -22,4±13,0 -41,0±14,5 -30,2±25,3 -37,2±17,7 -48,8±23,7 -55,3±13,7

На основании предварительных фармакодинамических данных очевидная зависимость доза-эффект наблюдалась в диапазоне доз PG110 от 0 до 0,3 мг/кг.

Фармакологический период полувыведения вычислили на основании среднего количества времени до достижения эффекта от лекарственного средства (среднее время удержания для эффекта от лекарственного средства). Его вычисляют как соотношение площади под кривой эффективности в первый момент, скорректированной относительно базовой линии, (AUMEC) к площади зависимости накопленного, скорректированного относительно базовой линии эффекта лекарственного средства от времени (площадь под кривой эффективности, AUEC):

Расчетные фармакологические периоды полувыведения резюмированы в таблице 13.

Таблица 13. Фармакологический период полувыведения PG110   Доза PG110   0,003 мг/кг 0,01мг/кг 0,03 мг/кг 0,1 мг/кг 0,3 мг/кг Фармакологический период полувыведения (среднее ± стандартное отклонение) (дни) 43,0±7,5 30,9±21,6 35,8±17,9 42,7±5,0 41,9±5,4

Вычисления фармакологического периода полувыведения проводили на основе данных, содранных за период до 84 дней после введения дозы PG110. Так как на 84 день еще наблюдался длительный эффект от PG110, особенно при дозах 0,1 мг/кг и 0,3 мг/кг, расчетный средний фармакологический период полувыведения для PG110 составляет по меньшей мере 5-7 недель, с диапазоном по меньшей мере от 4 до 8 недель.

Предварительные фармакодинамические данные согласуются с предсказанной терапевтической дозой (от 0,10 до 0,3 мг/кг или 7-21 мг). Предварительное значение фармакологического периода полувыведения предполагает, что эффективным может быть введение дозы каждые 4-12 недель.

Эквиваленты

Специалисты в данной области смогут распознать или установить, применяя только стандартные способы проведения экспериментов, множество эквивалентов конкретных примеров воплощения изобретения, описанных в этом документе. Предполагается, что такие эквиваленты включены в следующую далее формулу изобретения. Предполагается, что любая комбинация вариантов воплощения, раскрытых в подчиненных пунктах формулы изобретения, находится в пределах объема изобретения.

Включение в качестве ссылок

Все публикации, патенты и заявки на патент в стадии рассмотрения, на которые ссылается данный документ, полностью включены сюда в качестве ссылок.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой антитела против фактора роста нервов (ФРН). Настоящее изобретение также раскрывает фармацевтическую композицию для облегчения боли, ассоциированной с заболеванием или состоянием, при котором развитие или сохранение боли опосредовано ФРН, содержащую указанные антитела, а также набор для лечения связанного с ФРН заболевания, такого как, например, остеоартрит, нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую или легкую цепь антитела, вектор экспрессии, клетку-хозяина для получения указанных антител, способ экспрессии указанных антител против ФРН, а также применение указанных антител в способе лечения боли и для получения лекарственного средства для лечения боли, ассоциированной с заболеванием или состоянием, при котором развитие или сохранение боли опосредовано ФРН. Настоящее изобретение позволяет получить антитела против ФРН, характеризующиеся повышенной стабильностью in vivo. 10 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 13 табл., 8 пр.

1. Антитело против фактора роста нервов (ФРН), содержащее:
(i) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:3, 4 и 5, соответственно,
(ii) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR 1, 2 и 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:6, 7 и 8, соответственно, и
(iii) константную область IgG4 человека, где константная область IgG4 человека содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

2. Антитело по п.1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

3. Антитело по п.1, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:16.

4. Антитело по любому из пп.1-3, где антитело является гуманизированным.

5. Фармацевтическая композиция для облегчения боли, ассоциированной с заболеванием или состоянием, при котором развитие или сохранение боли опосредовано ФРН, содержащая антитело против ФРН по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель.

6. Набор для лечения связанного с ФРН заболевания или состояния, содержащий антитело против ФРН по любому из пп.1-4 и инструкцию по применению.

7. Нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела по любому из пп.1-4.

8. Нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела по любому из пп.1-4.

9. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по пп.7 и 8.

10. Вектор экспрессии по п.9, который содержит SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:14.

11. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.9 или 10, для получения антитела против ФРН по любому из пп.1-4.

12. Способ экспрессии антитела против ФРН по п.1, включающий культивирование клетки-хозяина по п.11.

13. Применение антитела против ФРН по любому из пп.1-4 в способе лечения боли, ассоциированной с заболеванием или состоянием, при котором развитие или сохранение боли опосредовано ФРН.

14. Применение антитела против ФРН по любому из пп.1-4 для получения лекарственного средства для лечения боли, ассоциированной с заболеванием или состоянием, при котором развитие или сохранение боли опосредовано ФРН.

15. Применение по п.13 или 14, где боль является болью при остеоартрите.

16. Применение по п.13 или 14, где боль является хронической болью нижней части спины.