АНТИТЕЛА ПРОТИВ ИНГИБИТОРА МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ПУТИ ТКАНЕВОГО ФАКТОРА Российский патент 2015 года по МПК C07K16/38 C12N5/10 A61K39/395 A61P7/02 

Область изобретения

Данное изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с ингибитором пути тканевого фактора (TFPI, tissue factor pathway inhibitor).

Уровень техники

У субъектов с коагулопатией, таких как люди с гемофилией А и В, различные этапы каскада свертывания оказываются дисфункциональными, например, из-за отсутствия или недостаточного количества фактора свертывания. Такая дисфункция одной части каскада свертывания приводит к недостаточному свертыванию крови и потенциально опасному для жизни кровотечению или повреждению внутренних органов, например суставов. Такие субъекты, как люди с гемофилией А и В, могут получать заместительную терапию фактором свертывания, таким как экзогенный FVIIIa или FIXa, соответственно. Тем не менее, такие пациенты имеют риск развития «ингибиторов» (антител) к таким экзогенным факторам, делающих эффективную ранее терапию неэффективной. Кроме того, экзогенные факторы свертывания крови можно вводить только внутривенным способом, который вызывает значительные неудобства и дискомфорт у пациентов. Например, младенцам и детям младшего дошкольного возраста, возможно, придется хирургическим способом вставлять внутривенные катетеры в грудную вену для того, чтобы гарантировать венозный доступ. Это подвергает их значительному риску развития бактериальных инфекций. Субъекты с коагулопатией могут получить терапию только после начала кровотечения, а не в качестве меры предосторожности, что часто снижает их общее качество жизни.

Таким образом, до сих пор есть много неудовлетворенных медицинских потребностей у людей с гемофилией в частности и у субъектов с коагулопатией в общем.

Когда стенка сосуда повреждена, тканевой фактор (TF) становится доступным содержимому циркулирующей крови, и TF образует комплекс с фактором VII/активированным фактором VII (FVII/FVIIa) на поверхности TF-несущих клеток. Это приводит к активации фактора Х (FX) в FXa, который вместе с FVa порождает ограниченное количество тромбина (FIIa). Небольшие количества тромбина активируют тромбоциты, что приводит к поверхностной экспозиции фосфолипидов, что поддерживает связывание теназного комплекса, состоящего из FVIIIa/FIXa.

Теназный комплекс производит большое количество FXa, который впоследствии облегчает полный тромбиновый взрыв. Полный тромбиновый взрыв необходим для формирования механически прочной фибриновой структуры и для стабилизации гемостатической пробки. У больных гемофилией FVIII и FIX отсутствует или присутствует на низком уровне, а также из-за отсутствия теназной активности способность образовывать FXa является низкой и недостаточной для поддержания фазы распространения коагуляции. Напротив, TF-опосредованная фаза инициации не зависит от образования теназного комплекса. Тем не менее, TF-путь будет заблокирован плазменными ингибиторами вскоре после начального образования FXa.

Ингибитор пути тканевого фактора (TFPI) уменьшает идущую коагуляцию путем нейтрализации каталитической активности FXa и путем ингибирования комплекса TF-FVIIa в присутствии FXa. TFPI либо ингибирует комплекс TF/FVIIa/FXA на клеточной поверхности, либо ингибирует высвобожденный FXa,, после чего следует ингибирование FVIIa/TF.

Краткое описание изобретения

Изобретатели выявили моноклональные антитела, которые специфически связываются с ингибитором пути тканевого фактора («TFPI», который иногда называют «TFPI1») и тем самым модулируют его активность. Данное изобретение относится к этим антителам и к другим связанным антителам, которые получены из этих антител или имеют аналогичные с этими антителами свойства связывания.

Таким образом, данное изобретение относится к антителам, которые специфически связываются с ингибитором пути тканевого фактора (TFPI) и которые уменьшают время свертывания, например, (а) человеческой плазмы, дефицитной по фактору VIII, и/или (б) человеческой цельной крови.

Одно антитело включает вариабельную область легкой цепи SEQ ID №4 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №8. Другое антитело включает вариабельную область легкой цепи SEQ ID №15 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №18.

Изобретение также предлагает полинуклеотиды, кодирующие антитело изобретения, такие как полинуклеотиды, кодирующие легкую цепь антитела и/или тяжелую цепь антитела изобретения.

Изобретение также предлагает фармацевтические композиции, содержащие антитело или полинуклеотид изобретения и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

Антитела, полинуклеотиды и композиции изобретения также предназначены для применения в (а) лечении или профилактике коагулопатии (нарушения с повышенной кровоточивостью) или (б) стимуляции свертывания крови. Т.е. изобретение относится к способу (а) лечения или профилактики коагулопатии (нарушения с повышенной кровоточивостью) или (б) стимуляции свертывания крови, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически или профилактически эффективного количества антитела, полинуклеотида или композиции изобретения.

Кроме того, изобретение предлагает режимы дозирования указанного моноклонального антитела изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1 показаны последовательности доменов VH (А) и VL (В) мышиного анти-TFPI4F36A1B2 (далее также называемого MuTFPI4F36 или 4F36), выровненные с последовательностями человеческой зародышевой линии и исходной CDR-привитой версии гуманизированного TFPI4F36. Схема нумерации Кабат указана над последовательностями.

На фиг.2 показаны нуклеотидные последовательности и транслированные полипептидные последовательности для последовательностей VH и VL мышиного антитела TFPI4F36A1B2 (MuTFPI4F36).

На фиг.3 показаны аминокислотные последовательности легкой (А) и тяжелой (В) цепей Fab-фрагментов мышиного антитела 4F36, MuTFPI4F36. Нумерация над последовательностями указана в соответствии с нумерацией Кабат. Позиции, соответствующие петлям CDR, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты в нумерации Кабата. Аминокислотные остатки, составляющие паратоп, выделены жирным шрифтом и подчеркнуты. Паратоп определяют по рентгеноструктуре комплекса между Fab MuTFPI4F36 и доменом К2 TFPI как остатки в Fab, имеющие тяжелый атом на расстоянии менее 4 Å от тяжелого атома в К2.

На фиг.4 показана последовательность TFPI (последовательность сигнального пептида опущена). Домены Кунитца выделены жирным шрифтом: домен Кунитца 1 TFPI = аминокислоты 26-76; домен Кунитца 2 TFPI = аминокислоты 97-147; домен Кунитца 3 TFPI = аминокислоты 188-238. С-концевая часть TFPI выделена курсивом на аминокислотах 240-276.

На фиг.5 показана относительная доступность остатков TFPI. Остатками, которые имеют доступность более 40%, являются аминокислоты 94-95, 98, 100-110, 118-121, 123-124, 131, 134, 138-142 и 144-145.

На фиг.6 показана гель-проникающая ВЭЖХ комплекса между вторым доменом Кунитца (К2) TFPI и Fab-фрагментом MuTFPI4F36 (Fab). В УФ при длине волны 280 нм выявляли гель-проникающие ВЭЖХ-хроматограммы свободного К2 (сплошная линия, r_t 13,1 мин, показан пик на 13,134), свободного Fab (прерывистая линия, r_t 11,7 мин, показан пик на 11,676) и комплекса (пунктирная линия, r_t 11,5 мин, показан пик на 11,496). Образец комплекса содержал ~20% избыточного К2.

На фиг.7 показана общая структура комплекса MuTFPI4F36 Fab:K2. Легкие цепи показаны бледно-серыми, а тяжелые цепи показаны темно-серыми. CDR-петли, определенные в соответствии со схемой Кабат, обозначены как L1-L3 и Н1-Н3.

На фиг.8 показана структура домена К2 TFPI в комплексе с Fab MuTFPI4F36 (Fab-молекула не показана). Отмечены N- и С-концы и вторичные структурные элементы.

На фиг.9 показаны осевые наложения структур К2. Показаны различия в структуре между растворенным К2, К2 в комплексе с MuTFPI4F36 Fab и К2 в комплексе со свиным трипсином.

На фиг.10 показан MuTFPI4F36-связывающий эпитоп на К2. (А) Изображение представляет К2-домен TFPI с боковыми цепями остатков, включенных в связывающий эпитоп, представленными шарами и палками. (В) аналогично А, но с добавленной поверхностью. (С) Связывающий эпитоп отображен на первичной последовательности. Заглавные буквы, выделенные жирным, выделенные курсивом и подчеркнутые, соответствуют остаткам в К2-связывающем эпитопе, создающем контакты с Fab только тяжелой цепи MuTFPI4F36 (позиции 10, 11, 13, 28, 31, 33 и 35), только легкой цепи (позиции 21, 23 и 50), а также тяжелой и легкой цепи (17, 19, 34 и 36), соответственно. Обозначены вторичные структурные элементы (h = спираль, s = складчатость) (спирали в позициях 5-8 и 50-56 и складчатости в позициях 20-26 и 31-37). Остатки, выделенные серым (позиции 1-2 и 59-66), присутствуют в экспрессированном белке, но не обнаруживаются в кристаллической структуре в связи с гибкостью N- и С-концов.

На фиг.11 показано сравнение осевых остатков комплексов K2:MuTFPI4F36 Fab и K2:HzTFPI4F36 Fab, демонстрирующее идентичные связывающие формы Fab-фрагментов мышиного MuTFPI4F36 и гуманизированного HzTFPI4F36. K2:MuTFPI4F36 Fab показан серым, а K2:HzTFPI4F36 Fab показан черным. Структуры совмещены для оптимизации совпадения в вариабельных областей Fab-фрагментов.

На фиг.12 показано влияние анти-TFPI-моноклональных антител (МКА) на TF/FVIIa-индуцированную активацию FX на поверхности HUVEC, стимулированных TNFα/IL1β. Активацию FX измеряли в присутствии 0-20 нМ МКА (МКА TFPI 2021 или МКА 2974), 50 пкМ FVIIa (NovoSeven®) и 50 нМ FX в буфере с 25 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 3,5 мМ KCI, 5 мМ CaCl₂, 1 мг/мл BSA (0,1%), рН 7,4, которым покрывали монослой HUVEC. Полученную активность FXa определяли в анализе амидолитической активности с S-2765, измеряя увеличение абсорбции при 405 нм.

На фиг.13 показано влияние анти-TFPI-МКА на TFPI-ингибирование TF/FVIIa-индуцированной активации FX на поверхности клеток MDA-MB 231. Активацию FX измеряли в присутствии 0-20 нМ МКА (гуманизированное МКА TFPI 2021 или МКА 2974), 2,5 нМ fl-TFPI, 100 пкМ FVIIa и 50 нМ FX в буфере с 25 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 3,5 мМ KCl, 5 мМ CaCl₂, 1 мг/мл BSA (0,1%), рН 7,4, которым покрывали монослой клеток MDA-MB 231. Полученную активность FXa определяли в анализе амидолитической активности с S-2765, измеряя увеличение абсорбции при 405 нм.

На фиг.14 показано влияние одиночных замен аминокислоты аланина выбранных остатков во втором домене Кунитца TFPI на связывание с МКА TFPI 2021 («МКА 4F36») и МКА 2974 (n=2). Выбранные остатки являются частью МКА TFPI 2021-связывающего эпитопа. Нумерация аминокислотных остатков проведена, как показано на фиг.10С.

На фиг.15 показано время кровотечения из кутикулы и потеря крови, измеренные у кроликов с временной гемофилией после лечения контрольным IgG (гемофилия) или мышиным анти-TFPI антителом, TFPI-4F36A1B2 («4F36», MuTFPI4F36).

На фиг.16 показано время кровотечения из кутикулы (одиночные наблюдения; среднее значение ± стандартная ошибка среднего) и потеря крови (среднее значение + стандартная ошибка среднего) у кроликов с лечением «по требованию» с индуцированной антителом гемофилией, получавших HzTFPI4F36 («анти-TFPI», МКА TFPI 2021) (2 мг/кг) или NovoSeven (9 мг/кг) в течение 5 минут после индукции кровотечения. Кровотечение наблюдали в течение 1 часа (3600 секунд).

На фиг.17 показано время кровотечения из кутикулы (одиночные

наблюдения; среднее значение ± стандартная ошибка среднего) и потеря крови (среднее значение + стандартная ошибка среднего) у кроликов с индуцированной антителом гемофилией при предварительной обработке HzTFPI4F36 («анти-TFPI», MKATFPI 2021) (дозы: 0,5, 1, 2 мг/кг) или изотипическим контрольным антителом за 35 минут до индукции кровотечения. Кровотечение наблюдали в течение 1 часа (3600 секунд).

На фиг.18 показано количество тромбоцитов, измеренное у отдельных животных после стимуляции анти-FVIII-антителом, введения анти-TFPI-антитела («анти-TFPI-AT», MuTFPI4F36), а затем индукции кровотечения. Это выполняли на контрольной модели гемофилии и в присутствии мышиного анти-TFPI-антитела 4F36 (MuTFPI4F36), описанного в данном документе.

На фиг.19 показана концентрация свободного HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021) в плазме у кроликов, которым вводили 20 мг/кг HzTFPI4F36 в 0 час. Эксперименты по кровотечению из кутикулы выполняли в 96 часов (4 дня), 168 часов (7 дней) и 240 часов (10 дней). Пунктирные линии указывают диапазон «эффективной концентрации» HzTFPI4F36, полученный в исследовании доза-ответ (см. фиг.17).

Фиг.20: Левая панель: плазменное HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021) (левая ось: ο) и время кровотечения из кутикулы (среднее значение ± стандартная ошибка среднего; ■). Правая панель: плазменное HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021) (левая ось ο) и потеря крови (среднее значение + стандартная ошибка среднего; ■) у кроликов с индуцированной антителом гемофилией при предварительном введении 20 мг/кг HzTFPI4F36 (n=8) или изотипического контрольного антитела (n=12) за 4, 7 или 10 дней до индукции кровотечения. Кровотечение наблюдали в течение 1 часа (3600 секунд).

На фиг.21 показаны уровни концентрации в плазме крови после внутривенного и подкожного введения HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021) обезьянам. На трех нижних графиках двум обезьянам вводили три дозы HzTFPI4F36 с двухнедельным интервалом. На нижнем левом вводили три дозы 2, 20 и 80 мг/кг, на нижнем среднем вводили три дозы 20, 80 и 160 мг/кг, на нижнем правом вводили три дозы 80, 160 и 200 мг/кг. На верхнем левом трем обезьянам вводили единичную дозу 20 мг/кг, на верхнем правом трем обезьянам вводили единичную внутривенную дозу. На графиках точки представляют собой отдельные наблюдения, а линия представляет соответствующую модель.

На фиг.22 показано моделирование 1 мг/кг HzTFPI4F36 (MKA TFPI 2021), вводимого подкожно ежедневно. Сплошная горизонтальная линия представляет моделированные уровни плазменной концентрации, а пунктирная горизонтальная линия представляет верхнюю эффективную концентрацию, которая вытекает из полученных данных.

На фиг.23 показано моделирование 15 мг/кг HzTFPI4F36 (MKA TFPI 2021), вводимого внутривенно каждые три недели. Сплошная горизонтальная линия представляет моделированные уровни плазменной концентрации, а пунктирная горизонтальная линия представляет верхнюю эффективную концентрацию, которая вытекает из полученных данных.

На фиг.24 показано моделирование 20 мг/кг HzTFPI4F36 (MKA TFPI 2021), вводимого внутривенно каждые две недели. Сплошная горизонтальная линия представляет моделированные уровни плазменной концентрации, а пунктирная горизонтальная линия представляет ожидаемое целевое насыщение, которое вытекает из полученных данных.

Краткое описание списка последовательностей

SEQ ID №1 представляет аминокислотную последовательность человеческого TFPI (последовательность сигнального пептида опущена).

SEQ ID №2 представляет аминокислотную последовательность конструкции, используемой для определения связывающего эпитопа антитела. Конструкция содержит аминокислоты с 91 по 150 из человеческого TFPI и C-концевую метку His₆.

SEQ ID №№3, 4 и 5 представляют полинуклеотидные (смысловые и антисмысловые) и полипептидные последовательности вариабельного домена легкой цепи (VL) моноклонального антитела MuTFPI4F36 (TFPI, 4F36A1B2). SEQ ID №6 представляет аминокислотную последовательность легкой цепи моноклонального антитела MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2). Последовательности сигнального пептида опущены.

SEQ ID №№7, 9 и 8 представляют полинуклеотидные (смысловые и антисмысловые) и полипептидные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (VH) моноклонального антитела MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2). SEQ ID №10 представляет аминокислотную последовательность тяжелой цепи моноклонального антитела MuTFPI4F36 (TFPI-4F36A1B2). Последовательности сигнального пептида опущены.

SEQ ID №11 представляет последовательность обратного праймера, используемого для амплификации вариабельного домена тяжелой цепи, a SEQ ID №12 представляет последовательность обратного праймера, используемого для амплификации легкой цепи.

SEQ ID №№13-15 предлагают смысловую полинуклеотидную, антисмысловую полинуклеотидную и полипептидную последовательности, соответственно, вариабельного домена легкой цепи (VL) гуманизированного моноклонального антитела, HzTFPI4F36 (MKA TFPI2021). Последовательности сигнального пептида опущены.

SEQ ID №№16-18 предлагают смысловую полинуклеотидную, антисмысловую полинуклеотидную и полипептидную последовательности, соответственно, вариабельного домена тяжелой цепи (VH) гуманизированного моноклонального антитела HzTFPI4F36 (MKA TFPI2021).

SEQ ID №№19-21 предлагают смысловую полинуклеотидную, антисмысловую полинуклеотидную и полипептидную последовательности, соответственно, легкой цепи (LC) гуманизированного моноклонального антитела HzTFPI4F36 (MKA TFPI2021).

SEQ ID №№22-24 предлагают смысловую полинуклеотидную, антисмысловую полинуклеотидную и полипептидную последовательности, соответственно, тяжелой цепи (НС) гуманизированного моноклонального антитела HzTFPI4F36 (MKA TFPI2021). Последовательности сигнального пептида опущены.

SEQ ID №25-26 предлагают нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности, соответственно, вариабельного домена легкой цепи CDR-привитого HzTFPI4F36. Последовательности сигнального пептида опущены.

SEQ ID №27-28 предлагают нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности, соответственно, вариабельного домена тяжелой цепи CDR-привитого HzTFPI4F36. Последовательности сигнального пептида опущены.

SEQ ID №29 предлагает аминокислотную последовательность легкой цепи CDR-привитого HzTFPI4F36 (человеческая каппа-цепи). Последовательность сигнального пептида опущена.

SEQ ID №30 предлагает аминокислотную последовательность тяжелой цепи CDR-привитого HzTFPI4F36, который является человеческим lgG4 (S241P). Последовательность сигнального пептида опущена.

SEQ ID №31 предлагает зародышевую последовательность VKII_A18/JK4, используемую для гуманизации легкой цепи MuTFPI4F36. Последовательность сигнального пептида опущена.

SEQ ID №32 предлагает зародышевую последовательность VH3_21/JH6, используемую для гуманизации тяжелой цепи MuTFPI4F36. Последовательность сигнального пептида опущена.

SEQ ID №33 предлагает аминокислотную последовательность Fab тяжелой цепи MuTFPI4F36A1B2. Сигнальный пептид опущен.

SEQ ID №34 предлагает аминокислотную последовательность Fab тяжелой цепи HzTFPI4F36. Сигнальный пептид опущен.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение относится к антителам, которые связываются с TFPI. Антитела предпочтительно специфически связываются с TFPI, т.е. они связываются с TFPI, но не связываются или связываются с более низкой аффинностью с другими молекулами. В частности, изобретение относится к антителам, которые связываются с TFPI и модулируют его активность. Таким образом, антитела изобретения могут обладать способностью уменьшать время свертывания крови. Например, антитело изобретения могут обладать способностью сокращать время свертывания человеческой FVIII-дефицитной плазмы или сокращать время формирования сгустка, измеряемое в анализе тромбоэластографии (ТЭГ) человеческой цельной крови. Изобретение также относится к применению таких антител, например в терапевтических и фармацевтических целях.

Термин «TFPI», используемый в данном документе, включает любые природные формы TFPI, которые могут быть получены из любого подходящего организма. Например, TFPI для применения, описанного в данном документе, может представлять собой TFPI млекопитающего, например человека, мыши, крысы, примата, крупного рогатого скота, барана или свиньи. Предпочтительно TFPI является человеческим TFPI. TFPI может иметь зрелую форму TFPI, такую как белок TFPI, который претерпел посттрансляционный процессинг в подходящей клетке. Такой зрелый белок TFPI может, например, быть гликозилированным. TFPI может быть белком TFPI полной длины. Термин TFPI также включает варианты, изоформы и другие гомологи таких молекул TFPI. Вариантные молекулы TFPI, как правило, будут характеризоваться тем, что проявляют тот же вид активности, что и природный TFPI, например способность нейтрализовать каталитическую активность FXa или способность ингибировать комплекс TF-FVIIa/FXa.

Антитело изобретения будет иметь способность связываться с TFPI. Предпочтительно антитело изобретения будет связываться специфически с TFPI. Т.е. антитело изобретения предпочтительно будет связываться с TFPI с большей аффинностью, чем та аффинность, с которой он связывается с другой молекулой. Антитело изобретения может иметь способность связываться или специфически связываться с молекулой TFPI, описанной в данном документе, такой как любая молекула-мишень, описанная в данном документе.

Термин «аффинность связывания» в данном документе используется для обозначения силы нековалентного взаимодействия двух молекул, например и антитела или его фрагмента, и антигена. Термин «аффинность связывания» используется для описания одновалентных взаимодействий (внутренняя активность).

Аффинность связывания двух молекул, например антитела или его фрагмента и антигена, через моновалентное взаимодействие может быть количественно оценена путем определения константы диссоциации (K_D). В свою очередь, K_D может быть определена путем измерения кинетики формирования и диссоциации комплекса, например методом SPR (Biacore). Константы скоростей, соответствующие ассоциации и диссоциации одновалентного комплекса, называются константой скорости ассоциации k_a (или k_on) и диссоциации константа скорости k_d (или k_off), соответственно. K_D связана с k_a и k_d через уравнение K_D=k_d/k_a.

После приведенного выше определения аффинностей связывания, связанных с различными молекулярными взаимодействиями, можно сравнить, например, аффинности связывания различных антител с данным антигеном путем сравнения значений K_D для отдельных комплексов антитело/антиген.

Аналогичным образом, специфичность взаимодействия можно оценить путем определения и сравнения значений K_D взаимодействия, представляющего интерес, например специфического взаимодействия между антителом и антигеном, со значением K_D взаимодействия, не представляющего интерес.

Как правило, K_D антитела по отношению к мишени будет в 2 раза, предпочтительно в 5 раз, более предпочтительно в 10 раз меньше, чем K_D по отношению к другим, не целевым, молекулам, таким как несвязанный материал или сопроводительный материал в окружающей среде. Более предпочтительно K_D будет в 50 раз меньше, например в 100 раз меньше или в 200 раз меньше; еще более предпочтительно в 500 раз меньше, например в 1000 раз меньше или 10000 раз меньше.

Значение этой константы диссоциации можно определить непосредственно с помощью хорошо известных способов и можно вычислить даже для сложных смесей с помощью таких способов, как изложенные, например, в Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984). Например, K_D может быть установлен в анализе связывания с использованием двойного нитроцеллюлозного фильтра, такого как изложен Wong & Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Для оценки связывающей способности лигандов, таких как антитела, с мишенями в данной области известны другие стандартные анализы, включая, например, ИФА, вестерн-блоттинг, радиоиммунологический анализ и проточную цитометрию. Кинетику связывания и аффинность связывания антитела также можно оценить с помощью стандартных анализов, известных в данной области, таких как поверхностный плазменный резонанс (SPR), например, с помощью системы Biacore™.

Можно проводить анализ конкурентного связывания, в котором связывание антитела с мишенью сравнивают со связыванием мишени другим лигандом этой мишени, например другим антителом. Концентрация, при которой происходит 50% ингибирование, называется Ki. В идеальных условиях Ki эквивалентна K_D. Значение Ki никогда не будет меньше, чем K_D, поэтому измерение Ki можно удобно заменить для обеспечения верхнего предела K_D.

Антитело изобретения может иметь K_D для своей цели 1×10^-7 М или меньше, 1×10^-8 М или меньше, или 1×10^-9 М или меньше, или 1×10^-10 M или меньше, 1×10^-11 М или меньше, или 1×10^-12 M или меньше.

Антитело, которое специфически связывается со своей мишенью, может связывать свою мишень с высокой аффинностью, т.е. демонстрируя низкую K_D, как говорилось выше, и может связываться с другими, не целевыми, молекулами с более низкой аффинностью. Например, антитело может связывать нецелевые молекулы с K_D 1×10^-6 М или более, более предпочтительно 1×10^-5 М или более, более предпочтительно 1×10^-4 М или более, более предпочтительно 1×10^-3 M или более, еще более предпочтительно 1×10^-2 М или более. Антитело изобретения предпочтительно способных связываться со своей мишенью с аффинностью, которая больше как минимум в два раза, в 10 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 500 раз, в 1000 раз или 10000 раз или больше, чем аффинность его связывания с с другой, не целевой, молекулой.

Молекулой-мишенью может быть любая молекула TFPI, описанная в данном документе, например природная молекула TFPI, полностью зрелая молекула TFPI или молекула TFPI полной длины. Предпочтительными молекулами TFPI являются полностью зрелые, природные молекулы TFPI млекопитающих полной длины. Например, молекула TFPI может состоять из (или может содержать) аминокислотной последовательности SEQ ID №1 или ее фрагмента или другого варианта, описанного в данном документе.

Молекула-мишень может быть вариантом молекулы TFPI, таким как фрагмент молекулы TFPI. Например, молекула-мишень может быть фрагментом или другим вариантом TFPI, который содержит подходящий эпитоп для связывания антитела. Например, молекула-мишень может быть фрагментом или другим вариантом TFPI, который сохраняет эпитоп, описанный в данном документе. Молекула-мишень может включать такой эпитоп.

В одном воплощении молекула-мишень является молекулой TFPI полной длины. Молекула TFPI полной длины может включать первый, второй и третий домены Кунитца, описанные в данном документе. Молекула TFPI полной длины может включать первый, второй и третий домены Кунитца, описанные в данном документе, а также карбоксильную концевую область, описанную в данном документе. Молекула TFPI полной длины может быть природной молекулой TFPI, такой как полипептид TFPI полной длины, экспрессированный с гена TFPI или секретируемый TFPI-экспрессирующими клетками. Молекула TFPI полной длины может быть природной молекулой TFPI, которая циркулирует в свободном виде в плазме или связана с клетками, такими как эндотелиальные клетки. Молекула TFPI полной длины не является усеченной молекулой TFPI, такой как природная усеченная молекула TFPI, описанная в данном документе.

В одном воплощении молекула-мишень является усеченной молекулой TFPI. Например, усеченная молекула TFPI может содержать усечение карбоксильного конца. Например, известно множество природных усеченных форм TFPI. Они могут включать усечение частично или полностью карбокси-конца TFPI. Они также могут включать усечение частично или полностью одного или более доменов Кунитца. Например, усеченная форма TFPI может включать удаление карбоксильной концевой части и части или всего третьего домена Кунитца.

Например, одна из природных усеченных форм TFPI содержит только аминокислоты с 1 по 161 из молекулы TFPI полной длины (далее в данном документе как TFPI (1-161)). TFPI (1-161) является активной формой TFPI, которая имеет сниженную активность по сравнению с молекулой полной длины. TFPI (1-161) отличается по структуре от TFPI полной длины, и антитела, образованные против TFPI (1-161) в качестве молекулы-мишени, могут отличаться от антител, образованных против TFPI полной длины.

Усеченная форма TFPI может быть соответствующей целевой молекулой, когда нужны целевые антитела против области TFPI полной длины, которая присутствует в TFPI (1-161). Тем не менее, усеченный TFPI предпочтительно использовать в качестве молекулы-мишени, когда антитела должны быть направлены против специфических усеченных форм TFPI, таких как природный усеченный TFPI.

В одном воплощении молекула-мишень является природной формой TFPI. Она может быть использована в форме, в которой она присутствует in vivo. Например, молекула-мишень может быть природным TFPI полной длины, описанным выше. Молекула-мишень может быть усеченным природным TFPI, описанным выше. Молекула-мишень может быть TFPI в форме, в которой она присутствует в плазме крови in vivo. Молекула-мишень может быть TFPI, который связан с липопротеином таким же образом, как он присутствует в плазме in vivo. Молекула-мишень может быть TFPI, который связан с клетками таким же образом, как это происходит in vivo, например TFPI, который связан с эндотелиальными клетками. Антитело изобретения может связываться с одной или более из этих природных форм TFPI. Антитело изобретения может обладать способностью связывать все эти природные формы TFPI или может обладать способностью различать эти различные формы, связываясь с некоторыми из них и не связываясь с другими.

В одном воплощении молекула-мишень представляет собой или включает в себя второй домен Кунитца из TFPI. Такая молекула-мишень может включать аминокислоты с 97 по 147 из SEQ ID №1 или аминокислоты с 91 по 150 из SEQ ID №1 или область, эквивалентную второму домену Кунитца, из другого полипептида TFPI. Такая молекула-мишень может включать SEQ ID №2 или аминокислоты с 3 по 58 или с 10 по 50 из SEQ ID №2. Молекула-мишень может быть или может содержать фрагмент второго домен Кунитца из TFPI. Например, молекула-мишень может включать пять или более, восемь или более, десять или более, двенадцать или более или пятнадцать или более аминокислот из второго домена Кунитца.

Молекула-мишень может включать пять или более, восемь или более, десять или более, двенадцать или более или пятнадцать или более доступных на поверхности остатков TFPI или конкретной области TFPI, например конкретного домена Кунитца или C-концевой части TFPI. Доступный на поверхности остаток является остатком, имеющим более 40% относительной доступности. Например, для второго домена Кунитца TFPI (SEQ ID №1) следующие аминокислоты имеют более 40% относительной доступности: 94-95, 98, 100-110, 118-121, 123-124, 131, 134, 138-142 и 144-145 (см. фиг.5). Молекула-мишень может включать пять или более, восемь или более, десять или более, двенадцать или более или пятнадцать или более из этих остатков, например фрагмент TFPI, который включает пять или более, восемь или более, десять или более, двенадцать или более или пятнадцать или более из этих остатков.

Молекула-мишень может включать известный эпитоп из TFPI.

Термин «эпитоп», используемый в данном документе, используется в контексте молекулярного взаимодействия между «антиген-связывающим полипептидом» (Ab) и соответствующим ему «антигеном» (Ag). Используемый в данном документе термин Ab включает антитело или его фрагмент, который специфически связывается с соответствующим Ag. Примеры антиген-связывающих фрагментов включают Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (как правило, VL- и VH-домены одной ветви антитела), одноцепочечный Fv (scFv; см., например, Bird et al., Science 1988; 242:428-426; и Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (как правило, VH- и СН1-домен) и dAb (как правило, VH-домен); VH-, VL-, VhH- и V-NAR-домены; миниантитела, двух-, трех-, четырехвалентные антитела и каппа-антитела (см., например, III et al., Protein Eng 1997; 10:949-57); верблюжий IgG; IgNAR и полиспецифичные фрагменты антитела, сформированные из фрагментов антитела, а также один или более изолированный CDR или функциональный паратоп, где изолированные CDR или антиген-связывающие остатки или полипептиды могут быть ассоциированы или связаны друг с другом с тем, чтобы сформировать функциональный фрагмент антитела. Различные типы фрагментов антитела были описаны и рассмотрены, например, в Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23, 1126-1136; WO2005040219, и в опубликованных патентных заявках США 20050238646 и 20020161201.

Фрагменты антитела могут быть получены с помощью обычных рекомбинантных методик или методик белковой инженерии, а также фрагменты могут быть проверены на антиген-связывающую или другую функцию таким же образом, как и интактные антитела.

Термин «антиген» (Ag) относится к молекулярной единице, используемой для иммунизации иммунокомпетентного позвоночного для производства антитела (Ab), которое распознает Ag. В данном документе термин «Ag» понимается более широко и, как правило, предназначен для включения молекул-мишеней, которые специфически распознаются антителом, таким образом включая фрагменты или имитаторы молекулы, используемой в процессе иммунизации для получения Ab. Таким образом, при связывании Ab со вторым доменом Кунитца (К2) TFPI антигеном называются и изолированный К2, и TFPI полной длины, в том числе усеченные и другие варианты TFPI.

Как правило, термин «эпитоп» относится к области или участку на Ag, с которым специфически связывается Ab, т.е. к области или участку, который физически контактирует с Ab. Белковый эпитоп может включать аминокислотные остатки в Ag, которые непосредственно участвуют в связывании с Ab (также называемые иммунодоминантным компонентом эпитопа), и другие аминокислотные остатки, которые непосредственно не участвуют в связывании, такие как аминокислотные остатков антигена, которые эффективно блокируются антителом (другими словами, аминокислотный остаток на «поверхности исключенного из растворителя объема» и/или «посадочное место» антитела). Термин «эпитоп» в данном документе включает оба типа сайтов связывания в любой конкретной области К2 в TFPI, которые специфически связываются с анти-TFPI-антителом или другим К2-специфическим агентом в соответствии с изобретением, если не указано иное (например, в некоторых контекстах изобретение относится к антителам, которые связываются непосредственно с конкретными аминокислотными остатками). К2 может содержать ряд различных эпитопов, которые могут включать, без ограничения, (1) линейные пептидные антигенные детерминанты, (2) конформационные антигенные детерминанты, которые состоят из одной или более несмежных аминокислот, расположенных рядом друг с другом в конформации зрелого К2; и (3) посттрансляционные антигенные детерминанты, которые состоят, полностью или частично, из молекулярных структур, ковалентно присоединенных к К2, таких как углеводные группы.

Эпитоп для данной пары антитело (Ab)/антиген (Ag) может быть определен и охарактеризован на различных уровнях детализации с помощью различных экспериментальных и расчетных способов картирования эпитопов. Экспериментальные способы включают мутагенез, рентгеновскую кристаллографию, спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрию с водородно-дейтериевым обменом (HX-MS) и различные способы конкурентного связывания. Поскольку каждый способ основан на уникальном принципе, описание эпитопа тесно связано со способом, которым оно было проведено. Таким образом, эпитоп для данной пары Ab/Ag будет определен по-разному в зависимости от используемого способа картирования эпитопа.

На самом детальном уровне можно определить эпитоп для взаимодействия между Ag и Ab посредством пространственных координат, определяющих атомные контакты, присутствующие во взаимодействии Ag-Ab, а также информацию об их относительной роли в термодинамике связывания. На менее детальном уровне эпитоп можно охарактеризовать посредством пространственных координат, определяющих атомные контакты между Ag и Ab. На еще менее детальном уровне эпитоп можно охарактеризовать посредством аминокислотных остатков, которые он содержит, определенных по специфическим критериям, например по расстоянию между атомами в Ab и Ag. На еще менее детальном уровне эпитоп можно охарактеризовать через функцию, например при конкурентном связывании с другими антителами. Эпитоп также может быть определен в более общем плане как включающий аминокислотные остатки, для которых замещение другой аминокислотой изменит характеристики взаимодействия между Ab и Ag.

В контексте полученной с помощью рентгеновских лучей кристаллической структуры, определенной по пространственным координатам комплекса между Ab, например Fab-фрагментом, и его Ag, термин «эпитоп» в данном документе специфически определяется как К2-остатки, характеризующиеся наличием тяжелого атома (т.е. не атома водорода) на расстоянии 4 Å от тяжелого атома в Ab, если не указано иное, или если это не противоречит контексту.

Из того факта, что описания и определения эпитопов получают на разных уровнях детализации в зависимости от используемого способа картирования эпитопа, следует, что сравнение эпитопов для различных Ab на одном и том же Ag может быть проведено аналогичным образом на различных уровнях детализации.

Эпитопы, описанные на уровне аминокислот, например определенные рентгеноструктурным образом, называют идентичными, если они содержат одинаковый набор аминокислотных остатков. Эпитопы называют перекрывающимися, если у них хотя бы одна аминокислота является общей. Эпитопы называют отдельными (уникальными), если они не имеют общих аминокислотных остатков с другими эпитопами.

Эпитопы, которые характеризуются конкурентным связыванием, называют перекрывающимися, если связывание соответствующих антител является взаимоисключающим, т.е. связывание одного антитела исключает одновременное связывание другого антитела. Эпитопы называют отдельными (уникальными), если антиген может обеспечить связывание обоих соответствующих антител одновременно.

Определение термина «паратоп» получают из данного выше определения «эпитоп», меняя перспективу. Таким образом, термин «паратоп» относится к области или участку на антителе, с которым специфически связывается антиген, т.е. с которым он имеет физический контакт.

В контексте полученной с помощью рентгеновских лучей кристаллической структуры, определенной по пространственным координатам комплекса между Ab, например Fab-фрагментом, а его Ag, термин «паратоп» в данном документе специфически определяется как антигенные остатки, характеризующиеся наличием тяжелого атома (т.е. не атома водорода) на расстоянии 4 Å от тяжелого атома в К2, если не указано иное, или если это не противоречит контексту.

Эпитоп и паратоп для данной пары антитело (Ab)/антиген (Ag) могут быть выявлены стандартными способами. Например, общее местонахождение эпитопа может быть определено путем оценки способности антитела связываться с разными фрагментами или вариантами полипептидов TFPI. Специфические аминокислоты в TFPI, которые создают контакт с антителом (эпитоп), и специфические аминокислоты в антителе, которые создают контакт с TFPI (паратоп), также могут быть определены с помощью обычных способов, таких как описанные в примерах. Например, антитело и молекула-мишень могут быть объединены, и комплекс Ab/Ag может быть кристаллизован. Кристаллическая структура комплекса может быть определена и использована для идентификации специфических сайтов взаимодействия между антителом и его мишенью.

Авторы данного изобретения провели такой анализ взаимодействия между мышиным антителом MuTFPI4F36, а также гуманизированным антителом HzTFPI4F36, описанным в данном документе, и вторым доменом Кунитца (К2) TFPI. Этот анализ более подробно описан в примерах.

Паратоп антитела в соответствии с данным изобретением может быть определен следующим образом: легкая цепь указанного антитела содержит остатки Е31, S32, D33, Y37, А96, Т97 и F99 из SEQ ID №15, а тяжелая цепь указанного антитела содержит остатки N31, S52, R53, S54, Y57, Y59, F60, Р61, D62, Q65, Y102, D103 и D106 из SEQ ID №18.

Таким образом, легкая цепь антитела в соответствии с данным изобретением может включать аминокислотные остатки:

Е в позиции, соответствующей позиции 31,

S в позиции, соответствующей позиции 32,

D в позиции, соответствующей позиции 33,

Y в позиции, соответствующей позиции 37,

А в позиции, соответствующей позиции 96,

Т в позиции, соответствующей позиции 97 и

F в позиции, соответствующей позиции 99

из SEQ ID №15;

а тяжелая цепь указанного антитела может включать аминокислотные остатки:

N в позиции, соответствующей позиции 31,

R в позиции, соответствующей позиции 53,

S в позиции, соответствующей позиции 54,

Y в позиции, соответствующей позиции 57,

Y в позиции, соответствующей позиции 59,

F в позиции, соответствующей позиции 60,

Р в позиции, соответствующей позиции 61,

D в позиции, соответствующей позиции 62,

Q в позиции, соответствующей позиции 65,

Y в позиции, соответствующей позиции 102,

D в позиции, соответствующей позиции 103 и

D в позиции, соответствующей позиции 106

из SEQ ID №18.

Тяжелая цепь также может содержать S в позиции, соответствующей позиции 52 в SEQ ID №18.

Легкая цепь антитела в соответствии с данным изобретением может также содержать Н в позиции, соответствующей позиции 98 в SEQ ID №15, а тяжелая цепь также может содержать S в позиции, соответствующей позиции 56 в SEQ ID №18.

Для MuTFPI4F36 (пример 4) было установлено, что эпитоп состоит из аминокислот Е100, Е101, Р103, R107, Y109, Т111, Y113, Q118, Q121, Е123, R124, F125, K126 и L140 из SEQ ID №1, соответствующих аминокислотам Е10, Е11, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, Q28, Q31, Е33, R34, F35, K36 и L50 из SEQ ID №2. Было установлено, что паратоп состоит из аминокислотных остатков легкой цепи Е31, S32, D33, Y37, А96, Т97, Н98 и F99 из SEQ ID №4 и аминокислотных остатков тяжелой цепи N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, Р61, D62, Q65, Y102, D103 и D106 из SEQ ID №8.

Для HzTFPI4F36 (пример 5) было установлено, что эпитоп состоит из аминокислот Е100, Е101, D102, Р103, R107, Y109, Т111, Y113, F114, N116, Q118, Q121, С122, Е123, R124, F125, K126 и L140 из SEQ ID №1, соответствующих аминокислотам Е10, Е11, D12, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, С32, Е33, R34, K36 и L50 из SEQ ID №2. Было установлено, что паратоп состоит из аминокислотных остатков легкой цепи Е31, S32, D33, Y37, А96, Т97 и F99 из SEQ ID №15 и аминокислотных остатков тяжелой цепи N31, S52, R53, S54, Y57, Y59, F60, Р61, D62, Q65, Y102, D103 и D106 из SEQ ID №18.

Антитело в соответствии с данным изобретением может связываться с тем же эпитопом или доменом TFPI, как и антитела изобретения, которые конкретно описаны в данном документе. Например, другие еще не идентифицированые антитела изобретения могут быть определены путем сравнения их связывания с TFPI и связывания моноклональных антител, MuTFPI4F36 и/или HzTFPI4F36; или путем сравнения функции еще не идентифицированых антител с функцией MuTFPI4F36 и/или HzTFPI4F36. Анализы и тесты, которые могут быть использованы для такой идентификации, включают анализы нейтрализации TFPI, такие как: анализ ингибирования FXa, описанный в примере 6, и анализ ингибирования FVIIa/TF/FXa, описанный в примере 7; анализы связывания, такие как анализ поверхностного плазменного резонанса, описанный в примере 8; клеточные анализы, такие как нейтрализация TFPI на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC), описанная в примере 9, а также нейтрализация TFPI-ингибирования активности TF/FVIIa на клетках рака молочной железы человека MDA-MB 231, описанная в примере 10.

В одном воплощении антитело изобретения может связываться с тем же эпитопом или областью, что и антитела MuTFPI4F36 или HzTFPI4F36, описанные в данном документе. Связывание MuTFPI4F36 и HzTFPI4F36 с TFPI описано более подробно в данном документе. Антитело изобретения может быть антителом, которое связывается с тем же эпитопом в TFPI, что и антитела MuTFPI4F36 или HzTFPI4F36. Оно может включать его, будучи в контакте с конкретными аминокислотами TFPI, как описано выше. Например, антитело изобретения может связываться с TFPI таким образом, что оно находится в контакте с аминокислотами Е10, Е11, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, Q28, Q31, Е33, R34, F35, K36 и L50 из SEQ ID №2 или таким образом, что оно находится в контакте с аминокислотами Е10, Е11, D12, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, С32, Е33, R34, K36 и L50 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий один или более остаток, выбранный из группы, состоящей из Е10, Е11, D12, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, С32, Е33, R34, F35, K36 и L50 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток E10 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток Е11 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток D12 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток Р13 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток R17 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток Y19 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток Т21 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток Y23 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток F24 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток N26 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток Q28 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток Q31 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток С32 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток E33 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток R34 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток F35 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток K36 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остаток L50 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп, содержащий остатки E10, Е11, D12, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, С32, E33, R34, K36 и L50 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью связывать эпитоп содержащий остатки E10, Е11, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 и L50 из SEQ ID №2.

Антитело изобретения может обладать способностью конкурировать с другим антителом изобретения в связывании с TFPI или другой соответствующей мишенью, описанной в данном документе. Например, антитело изобретения может перекрестно конкурировать с антителами MuTFPI4F36 или HzTFPI4F36, описанными в данном документе, в связывании с TFPI или подходящим фрагментом или вариантом TFPI, который связывается с антителами MuTFPI4F36 или HzTFPI4F36. Такие перекрестно конкурирующие антитела могут быть определены на основе их способности к перекрестной конкуренции с известным антителом изобретения в стандартном анализе связывания. Для демонстрации перекрестной конкуренции может быть использован, например, SPR, например с помощью системы Biacore™, ИФА-анализы или проточная цитометрия. Такая перекрестная конкуренция позволяет предположить, что два антитела связываются с одинаковыми, перекрывающимися или аналогичными эпитопами.

Таким образом, антитело изобретения может обладать способностью связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем любой один или более из следующих коммерчески доступных моноклональных антител: МКА 0281 (Ab systems) и/или МКА 4904 (American Diagnostica) и/или МКА 2974 (R&D systems) и/или МКА 29741 (R&D systems).

Антитело изобретения может быть определено с помощью способа, который включает анализ связывания, который оценивает, способно ли тестируемое антитело конкурировать с известным антителом изобретения за сайт связывания на молекуле-мишени. Способы проведения анализов конкурентного связывания хорошо известны в данной области. Например, они могут включать связывание известного антитела изобретения с молекулой-мишенью с использованием условий, в которых антитело может связываться с молекулой-мишенью. Затем комплекс антитело/мишень может подвергнуться воздействию тестируемого антитела, и может быть оценена степень, в которой тестируемое антитело способно вытеснять антитело изобретения из комплекса антитело/мишень. Альтернативный способ может включать контактирование тестируемого антитела с молекулой-мишенью в условиях, позволяющих связывать антитело, а затем добавление антитела изобретения, способного связывать молекулу-мишень, и оценку степени, в которой антитело изобретения способно вытеснять тестируемое антитело из комплекса антитело/мишень.

Способность тестируемого антитела ингибировать связывание антитела изобретения с мишенью показывает, что тестируемое соединение может конкурировать с антителом изобретения в связывании с мишенью и что таким образом, тестируемое антитело связывается с тем же эпитопом или областью на белке TFPI, как и известное антитело изобретения. Тестируемое антитело, которое идентифицируется как конкурирующее с известным антителом изобретения в таком способе, является также потенциальным антителом в соответствии с данным изобретением. Тот факт, что тестируемое антитело может связывать TFPI в той же области, как и известное антитело изобретения и конкурировать с известным антителом изобретения, подтверждает, что тестируемое антитело может выступать в качестве лиганда на том же самом сайте связывания, что и сайт связывания известного антитела, и что тестируемое антитело может, таким образом, имитировать действие известного антитела. Это может быть подтверждено путем оценки активности TFPI в присутствии тестируемого соединения, описанного в данном документе.

Известное антитело изобретения может быть антителом, описанным в данном документе, например мышиным антителом TFPI-4F36A1B2 (также известным как 4F36 и как MuTFPI4F36), или каким-либо его вариантом или фрагментом, описанным в данном документе, который сохраняет способность связываться с TFPI, таким как гуманизированные антитела TFPI-4F36A1B2, одно из которых в данном документе называется HzTFPI4F36 (MKA TFPI 2021). Антитело изобретения может связываться с тем же эпитопом, что и антитело MuTFPI4F36, описанное в данном документе, или его любой вариант или фрагмент, описанный в данном документе, который сохраняет способность связываться с TFPI, например HzTFPI4F36.

Антитело изобретения может связывать эпитоп, идентичный, перекрывающийся или схожий с эпитопом MuTFPI4F36, что более подробно описано в примерах. Антитело изобретения может связываться с эпитопом, идентичным, перекрывающимся или схожим с эпитопом HzTFPI4F36, что более подробно описано в примерах. Антитело изобретения может связывать, предпочтительно специфично, один или более аминокислотный остаток, который принадлежит эпитопам MuTFPI4F36 и/или HzTFPI4F36, Например, антитело изобретения может связываться с пятью или более, шестью или более, семью или больше, восемью или более или десятью или более аминокислотными остатками, приведенными выше, при связывании MuTFPI4F36 или HzTFPI4F36. Например, при контакте с полипептидом SEQ ID №2 антитело изобретения может связываться с полипептидом и вступать в контакт с аминокислотами E10, Е11, D12, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, С32, E33, R34, F35, K36 и L50 или частью этих аминокислот, например по меньшей мере с 2, по меньшей мере с 3, по меньшей мере с 4, по меньшей мере с 5, по меньшей мере с 6, по меньшей мере с 7, по меньшей мере с 8, по меньшей мере с 9, по меньшей мере с 10, по меньшей мере с 11, по меньшей мере с 12, по меньшей мере с 13, по меньшей мере с 14, по меньшей мере с 15, по меньшей мере с 16, по меньшей мере с 17 или по меньшей мере с 18 из этих аминокислот.

Специфическое связывание может быть оценено посредством связывания антитела с молекулой, которая не является мишенью. Это сравнение может быть сделано путем сравнения способности антитела связываться с мишенью и с другой молекулой. Это сравнение может быть сделано, как описано выше в оценке K_D или Ki. Другой молекулой, используемой в таком сравнении, может быть любая молекула, которая не является молекулой-мишенью. Предпочтительно другая молекула не совпадает с молекулой-мишенью. Предпочтительно молекула-мишень не является фрагментом молекулы-мишени.

K_D антитела данного изобретения может быть менее 0,8 нМ, например менее 0,7 нМ, например менее 0,6 нМ, например менее 0,5 нМ, например менее 0,4 нМ, например менее 0,3 нМ, например менее 0,2 нМ, например менее 0,1 нМ, например менее 0,05 нМ, например менее 0,025 нМ, например менее 0,015 нМ, например между 0,015 нМ и 0 нМ.

Другая молекула, используемая для определения специфического связывания, может быть не связана структурно или функционально с мишенью. Например, другая молекула может быть не родственным материалом или сопроводительным материалом в окружающей среде.

Другая молекула, используемая для определения специфического связывания, может быть другой молекулой, вовлеченной в тот же самый in vivo путь, как и молекула-мишень. Например, если мишенью является TFPI или его фрагмент или вариант, другая молекула, используемая для сравнения, может быть белком, который участвует в каскаде свертывания крови. При уверенности, что антитело изобретения специфично по отношению к TFPI над другой такой молекулой, нежелательной перекрестной реактивности in vivo можно избежать.

Другая молекула, используемая для сравнения, может быть связана с молекулой-мишенью. Например, когда необходимо определить антитело, которое связывается только со специфическим эпитопом, другой молекулой для сравнения может быть молекула TFPI, в которой такой эпитоп отсутствует или нарушен. Таким образом, другая молекула, используемая для сравнения, может быть другой молекулой-мишенью, которая отличается от молекулы-мишени, связанной рассматриваемым антителом.

Антитело изобретения может сохранять способность связываться с некоторыми молекулами, которые родственны молекуле-мишени. Например, зрелый человеческий TFPI полной длины может быть использован в качестве мишени, но антитело также может быть способно связывать, например, незрелые формы человеческого TFPI, фрагменты или усеченные формы человеческого TFPI, TFPI, который связан с липопротеином или с клеткой, или TFPI от других видов, например TFPI других млекопитающих.

Альтернативно, антитело изобретения может иметь специфичность по отношению к определенной молекуле-мишени. Например, оно может связываться с одной молекулой-мишенью, описанной в данном документе, но может не связываться или может связываться со значительно сниженной аффинностью с различными молекулами-мишенями, описанными в данном документе. Например, зрелый человеческий TFPI полной длины может быть использован в качестве мишени, но антитело, которое связывается с этой мишенью, может быть не в состоянии связываться или может связываться с меньшей аффинностью, например, с незрелыми формами человеческого TFPI, фрагментами или усеченными формами человеческого TFPI, TFPI, который связан с липопротеином или с клеткой, или TFPI от других видов, например TFPI других млекопитающих.

Антитело изобретения может связываться с TFPI и при этом может ингибировать активность TFPI.

Как объяснялось выше, TFPI снижает свертываемость крови. Он делает это путем ингибирования активности FXa и путем ингибирования комплекса TF-FVIIa в присутствии FXa. Активность TFPI, которая ингибируется антителом изобретения, может быть любым из этих видов активности или любым понижающим влиянием. Например, антитело изобретения может привести к увеличению свертываемости крови, увеличению присутствия или уровня FXa или повышению активности TF-FVIIa. Предпочтительно антитело изобретения сокращает время свертывания крови при контакте с (а) человеческой плазмой, дефицитной по фактору VIII, или (б) цельной кровью человека.

Измерение активности TFPI может включать оценку активности TFPI в ингибировании свертывания или сокращении времени свертывания образца крови. Например, такой способ может включать контактирование TFPI с образцом крови или препаратом крови, таким как плазма или сыворотка, который содержит факторы свертывания крови, в условиях, когда должна произойти коагуляция, и определение того, замедляется ли свертывание крови или сокращается ли время свертывания в присутствии TFPI. Уровень свертывания крови или время свертывания в таком образце затем можно сравнить с эквивалентным образцом, в котором также присутствует тестируемое антитело. Если в образце антитела уровень коагуляции повышен или время свертывания крови снижено, это подтверждает, что в образце есть антитело, ингибирующие активность TFPI.

Свертывание крови может быть выявлено при исследовании свертывания самой крови, плазмы или при исследовании одной или более характеристик каскада свертывания, которые находятся дальше точки действия TFPI. Например, способ может оценить уровни FXa или активацию TF-FVIIa в образце.

Различные другие способы оценки свертывания крови и времени свертывания крови хорошо известны в данной области. Например, любое влияние антитела на время свертывания крови можно оценить с помощью анализа протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT-анализа), описанного в примерах. Вкратце, плазма крови человека контактирует с человеческим тромбопластином. Время, необходимое, чтобы плазма образовала сгусток, измеряют в присутствии и в отсутствие антитела. В таком анализе может быть использован положительный контроль, такой как добавление FVIIa (NovoSeven®), который ожидаемо уменьшает время свертывания крови. Антитело изобретения должно быть способно снижать время свертывания в таком способе. Предпочтительно антитело изобретения должно быть способно уменьшать время свертывания крови в зависимости от дозы.

Антитело данного изобретения может быть способно ингибировать TFPI в анализе, основанном на образовании плазмой сгустка, таком как dPT-анализ, значительно лучше, чем одно или более из следующих коммерчески доступных моноклональных антител: МКА 0281 (Ab systems) и/или МКА 4904 (American Diagnostica) и/или МКА 2974 (R&D systems) и/или МКА 29741 (R&D systems).

Для оценки кинетики образования сгустка и фибринолиза в образцах цельной крови может быть использована тромбоэластография. Способность антитела сокращать время свертывания или стимулировать свертывание крови, таким образом, можно так же оценивать в образце цельной крови, сравнивая время, необходимое для свертывания крови в присутствии и в отсутствие антитела.

Таким образом, способы оценки функциональных влияний антитела изобретения могут быть проведены in vitro. Такие способы предпочтительно осуществлять на образцах человеческой крови или плазмы. Такие образцы могут быть нормальной человеческой кровью или плазмой или могут быть дефицитными или дополненными, по одному или более фактору, участвующему в свертывании крови. Например, эти способы могут осуществляться на нормальной человеческой цельной крови, нормальной человеческой плазме или дефицитой по FVIII плазме или цельной крови. FVIII-дефицитая кровь или плазма может быть получена путем контактирования подходящего образца крови или плазмы с нейтрализующим анти-FVIII-антителом. Такие способы in vitro могут быть анализами связывания или анализами нейтрализации TFPI, такими как описанные в примерах 6-11.

Антитело данного изобретения может обладать способностью ингибировать тромбоцит-ассоциированный TFPI.

Антитело данного изобретения может обладать способностью ингибировать растворимый TFPI.

Антитело данного изобретения может обладать способностью ингибировать липопротеин-связанный TFPI.

Антитело данного изобретения может обладать способностью ингибировать связанный с клеткой TFPI, такой как TFPI, который связан с эндотелиальными клетками.

Антитело данного изобретения может обладать способностью связывать TFPI, так что FXa сохраняет свою активность, измеряемую в анализе ингибирования FXa, по меньшей мере на 91%, например по меньшей мере на 92%, например по меньшей мере на 93%, например по меньшей мере на 94%, например по меньшей мере на 95%, например по меньшей мере на 96%, например по меньшей мере на 97%, например по меньшей мере на 98%, например по меньшей мере на 99%, например на 99-100%.

Антитело данного изобретения может обладать способностью нейтрализовать TFPI-ингибирование мембраносвязанного FVIIa/TF/FXa, когда TFPI насыщен указанным антителом, по меньшей мере на 55%, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 65%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 75%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 85%, например по меньшей мере на 90%, например по меньшей мере на 95%, например по меньшей мере на 100%, например по меньшей мере на 100%, измеренное в анализе ингибирования FVIIa/TF/FXa.

Предпочтительно антитело изобретения способно снижать время свертывания крови и/или стимулировать свертывание крови в образце (а) цельной крови человека, (б) плазмы крови человека, (в) дефицитной по FVIII цельной крови человека, (г) дефицитной по FVIII плазмы крови человека, (д) дефицитной по FIX цельной крови человека или (е) дефицитной по FIX плазмы крови человека.

Способы определения способности антитела стимулировать свертывание крови или уменьшать время свертывания крови можно также осуществлять in vivo. Например, исследования in vivo могут быть проведены на временно гемофильных кроликах, как описано в примерах. Вкратце, кроликов можно сделать временно гемофильными путем введения анти-FVIII-антитела. Затем может быть введено тестируемое антитело и оценено время кровотечения из кутикулы и/или число тромбоцитов. Сокращение времени кровотечения из кутикулы в присутствии тестируемого антитела указывает, что антитело способно снижать время свертывания крови и стимулировать свертывание крови. Антитело, оказывающее такое влияние, может быть антителом данного изобретения.

Антитело данного изобретения может обладать способностью связывать К2-домен TFPI, так что процент свободного TFPI у субъекта снижается до менее 30%, например, до менее 29%, например, до менее 28%, например, до менее 27%, например, до менее 26%, например, до менее 25%, например, до менее 24%, например, до менее 23%, например, до менее 22%, например, до менее 21%, например, до менее 20%, например, до менее 19%, например, до менее 18%, например, до менее 17%, например, до менее 16%, например, до менее 15%, например, до менее 14%, например, до менее 13%, например, до менее 12%, например, до менее 11%, например, до менее 10%, например, до менее 9%, например, до менее 8%, например, до менее 7%, например, до менее 6%, например, до менее 5%, например, до менее 4%, например, до менее 3%, например, до менее 2%, например, до менее 1%, например до 0%.

Кроме того, антитело данного изобретения может обладать способностью связывать К2-домен TFPI, так что количество свободного TFPI у субъекта снижается в течение первых 28 дней, например в течение первых 27 дней, например в течение первых 26 дней, например в течение первых 25 дней, например в течение первых 24 дней, например в течение первых 23 дней, например в течение первых 22 дней, например в течение первого 21 дня, например в течение первых 20 дней, например в течение первых 19 дней, например в течение первых 18 дней, например в течение первых 17 дней, например в течение первых 16 дней, например в течение первых 15 дней, например в течение первых 14 дней, например в течение первых 13 дней, например в течение первых 12 дней, например в течение первых 11 дней, например в течение первых 10 дней, например в течение первых 9 дней, например в течение первых 8 дней, например в течение первых 7 дней, например в течение первых 6 дней, например в течение первых 5 дней, например в течение первых 4 дней, например в течение первых 3 дней, например в течение первых 2 дней, например в течение первого дня после введения указанному субъекту указанного моноклонального антитела.

Антитело данного изобретения может также привести к незначительному снижению числа тромбоцитов. В частности, антитело изобретения может быть способно сокращать время свертывания крови и/или стимулировать свертывание крови в образцах (а) цельной крови человека, (б) плазмы крови человека, (в) дефицитной по FVIII цельной крови человека, (г) дефицитной по FVIII плазмы крови человека, (д) дефицитной по FIX цельной крови человека или (е) дефицитной по FIX плазмы крови человека, или у животного in vivo, не приводя к существенному снижению числа тромбоцитов. Число тромбоцитов может быть оценено в тех же образцах или животных, как и другие эффекты, рассмотренные выше, или может быть оценено отдельно. Например, число тромбоцитов можно оценить в образцах крови, таких как образец крови, полученный от пациента или экспериментального животного. Число тромбоцитов можно оценить после введения антитела временно гемофильному кролику, описанному выше. Антитела изобретения могут обладать способностью сокращать время кровотечения из кутикулы, не приводя к одновременному снижению числа тромбоцитов, о чем свидетельствуют исследования in vivo на временно гемофильных кроликах. Изменение числа тромбоцитов можно оценить путем сравнения числа тромбоцитов до и после введения антитела или путем сравнения числа тромбоцитов из образца или от животного, получавшего интересующее антитело, и контрольного образца или животного, не получавшего это антитело. Антитело данного изобретения может обладать способностью связывать К2-домен TFPI, так что время свертывания крови у субъекта in vivo уменьшается, а число тромбоцитов указанного субъекта существенно не снижается. Например, число тромбоцитов указанного субъекта не может упасть примерно до 80%, например примерно до 75%, например примерно до 70%, например примерно до 65%, например примерно до 60%, например примерно до 55%, например примерно до 50%, например примерно до 45%, например примерно до 40%, например примерно до 35%, например примерно до 30%, например примерно до 25% от первоначального числа тромбоцитов. Предпочтительно, не будет никакой разницы или статистически значимого различия в числе тромбоцитов при проведении таких сравнений. Т.е. антитело изобретения не вызывает какого-либо снижения числа тромбоцитов.

Термин «антитело», используемый в данном документе, включает целые антитела и любой антиген-связывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или их одинарные цепи. Антитело относится к гликопротеину, содержащему по меньше мере две тяжелые цепи (НС) и две легкие цепи (LC), связанные друг с другом дисульфидными мостиками, или к его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенной здесь как VH) и константной области тяжелой цепи (СН). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенной здесь как VL) и константной области легкой цепи (CL). Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. VH- и VL-области также могут быть подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR, complementarity determining region), которые перемежаются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR, framework region). Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Термины «область, определяющая комплементарность» или «гипервариабельная область», используемые в данном документе, относятся к аминокислотным остаткам антитела, ответственным за связывание антигена. Области, определяющие комплементарность, или «CDR», как правило, состоят из аминокислотных остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) и/или тех остатков из «гипервариабельной петли» (остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917). Как правило, нумерация аминокислотных остатков в этой области осуществляется по способу, описанному Kabat et al., см. выше. Такие фразы, как «положение по Кабат», «остаток Кабат» и «в соответствии с Кабат» в данном документе относятся к этой системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При использовании системы нумерации Кабат фактическая линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие сокращению или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать аминокислотные вставки (остаток 52а, 52b и 52с в соответствии с Кабат) после остатка 52 в CDR H2, и вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. в соответствии с Кабат) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кабат может быть определена для данного антитела путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Кабат.

Термины «остатки каркасной области» или «остатки FR» относятся к тем аминокислотным остаткам VH или VL, которые не входят в CDR, как они определены в данном документе.

Антитело изобретения может быть моноклональным антителом или поликлональным антителом. В одном воплощении антитело изобретения является моноклональным антителом. Антитело изобретения может быть химерным антителом, CDR-привитым антителом, человеческим или гуманизированным антителом или антиген-связывающей частью любого из них. Для получения как моноклональных, так и поликлональных антител экспериментальным животным является подходящее млекопитающее, такое как, но не ограничиваясь ими, коза, кролик, крыса или мышь.

Поликлональные антитела представляют собой антитела, которые получены из различных В-клеточных линий. Поликлональное антитело может включать смесь различных иммуноглобулиновых молекул, направленных против специфического антигена. Поликлональное антитело может включать смесь различных иммуноглобулиновых молекул, которые связываются с одним или более различными эпитопами в молекуле антигена. Поликпональные антитела могут быть получены обычными способами, такими как иммунизация подходящего животного интересующим антигеном. Впоследствии у животного может быть взята кровь и очищена иммуноглобулиновая фракция.

Моноклональные антитела являются иммуноглобулиновыми молекулами, которые идентичны друг другу и имеют единую специфичность связывания и аффинность к определенному эпитопу. Моноклональные антитела (МКА) данного изобретения могут быть получены с помощью различных методик, включая обычные методологии получения моноклональных антител, например, с помощью стандартной методики гибридизации соматической клетки по Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495. Предпочтительной системой получения гибридом на животных является мышиная система. Получение гибридомы у мыши является очень хорошо известной процедурой. Протоколы иммунизации и методики выделения иммунизированных спленоцитов для слияния хорошо известны в данной области. Партнеры для слияния (например, мышиные миеломные клетки) и процедуры слияния также известны в данной области.

Для создания гибридом, продуцирующих моноклональные антитела изобретения, у иммунизированных мышей могут быть выделены спленоциты и/или клетки лимфатических узлов и слиты с соответствующей иммортализованной клеточной линией, такой как мышиная миеломная клеточная линия. Полученные гибридомы можно проверить на продукцию антиген-специфических антител. Гибридомы, секретирующие антитела, можно пересеять, снова провести скрининг, и все еще положительные на подходящий IgG моноклональные антитела можно субклонировать по меньшей мере дважды путем серийных разведении. Затем стабильные субклоны можно культивировать in vitro для получения небольшого количества антитела в культуральной среде для проведения характеристики.

Термин «антиген-связывающая часть» антитела относится к одному или более из фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном, например с TFPI или с другим белком-мишенью, описанным в данном документе. Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может быть выполнена фрагментом антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином «антиген-связывающая часть» антитела, включают Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент, Fab'-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, dAb-фрагмент и выделенную область, определяющую комплементарность (CDR). Одноцепочечные антитела, такие как scFv, и антитела тяжелой цепи, такие как VHH, и верблюжьи антитела также могут быть охвачены термином «антиген-связывающий часть» антитела. Эти фрагменты антител могут быть получены с помощью обычных методик, известных специалистам в данной области, и фрагменты могут быть оценены на полезность тем же образом, что и интактные антитела.

Антитело изобретения может быть получено, экспрессировано, создано или выделено с помощью рекомбинантных средств, таких как (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным или трансхромосомным для генов интересующих иммуноглобулинов, или из гибридомы, полученной на них, (б) антитела, выделенные из принимающей клетки, трансформированной для экспрессии интересующего антитела, например из трансфектомы, (в) антитела, выделенные из библиотеки рекомбинантных, комбинаторных антител, и (г) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают сплайсинг последовательностей иммуноглобулиновых генов с другими последовательностями ДНК.

Антитело изобретения может быть человеческим антителом или гуманизированным антителом. Термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, включает антитела, имеющие вариабельные области, в которых и каркасная область, и области CDR получены из человеческих иммуноглобулиновых зародышевых последовательностей. Кроме того, если антитело содержит константную область, то константная область также получена из человеческих иммуноглобулиновых зародышевых последовательностей. Человеческие антитела изобретения могут включать аминокислотные остатки, не закодированные человеческими иммуноглобулиновыми зародышевыми последовательностями (например, мутации, введенные случайно или путем сайт-специфического мутагенеза in vitro или путем соматических мутаций in vivo). Тем не менее, термин «человеческое антитело», используемый в данном документе, не включает антитела, в которых CDR-последовательности, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь, были привиты в человеческие каркасные последовательности.

Такое человеческое антитело может быть человеческим моноклональным антителом. Такое человеческое моноклональное антитело может быть получено с помощью гибридомы, которая содержит В-клетку, полученную из трансгенного животного, отличного от человека, например, из трансгенной мыши, имеющей геном с человеческим трансгеном тяжелой цепи и трансгеном легкой цепи, слитую с иммортализованной клеткой.

Человеческие антитела могут быть выделены из библиотек последовательностей, построенных на подборке человеческих зародышевых последовательностей, также диверсифицированных с разнообразием природных и синтетических последовательностей.

Человеческие антитела могут быть получены in vitro путем иммунизации лимфоцитов человека с последующей трансформацией лимфоцитов вирусом Эпштейна-Барр.

Термин «производные человеческого антитела» относится к любой модифицированной форме человеческого антитела, например, к конъюгату антитела и другому агенту или антителу.

Термин «гуманизированное антитело» предназначен для обозначения химерного антитела человек/нечеловек, которое содержит минимальную последовательность (CDR-области), полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. Таким образом, гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками гипервариабельной области нечеловеческого вида (донорное антитело), например мыши, крысы, кролика или примата, с нужной специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях FR-остатки человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Примером такой модификации является введение одной или более так называемых обратных мутаций, таких как описаны в примере 2.

Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются в реципиентном антителе или донорном антителе. Эти модификации сделаны для дальнейшего уточнения характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют таковым в нечеловеческом иммуноглобулине, и все или практически все FR-остатки принадлежат человеческой иммуноглобулиновой последовательности. Гуманизированное антитело, возможно, может также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина.

Антитела изобретения можно проверить на связывание белка-мишени, например, с помощью стандартного ELISA (ИФА) или вестерн-блоттинга. Анализ ELISA можно также использовать для выявления гибридом, которые демонстрируют положительную реактивность с белком-мишенью. Специфичность связывания антитела можно также определять при мониторинге связывания антитела с клетками, экспрессирующими белок-мишень, например, с помощью проточной цитометрии.

Специфичность антитела изобретения по отношению к белку-мишени также можно изучить путем определения того, связывается ли антитело с другими белками. Например, когда желательно производить антитело, которое специфически связывается с TFPI или конкретной частью TFPI, например эпитопом, специфичность антитела можно оценить путем определения, связывается ли антитело также и с другими молекулами или модифицированными формами TFPI, в которых отсутствует интересующая часть.

Как было указано выше, антитела изобретения могут изменять активность TFPI. Антитела, обладающие необходимыми связывающими свойствами таким образом, могут также быть проверены в плане их влияния на активность TFPI. Таким образом, могут быть использованы способы для определения подходящих антител, способных связываться с TFPI и способных изменять и, в частности, снижать его активность.

Как только подходящее антитело определено и выбрано, аминокислотная последовательность антитела может быть определена способами, известными в данной области. Гены, кодирующие антитело, могут быть клонированы с использованием специфических и/или вырожденных праймеров. Антитело может быть получено рекомбинантно обычными способами.

Термин «полипептид» используется в данном документе в его самом широком смысле для обозначения соединения из двух или более субъединиц аминокислот, аналогов аминокислот или других пептидомиметиков. Таким образом, термин «полипептид» включает короткие пептидные последовательности, а также более длинные полипептиды и белки. Используемый в данном документе термин «аминокислота» может относиться к природным и/или неприродным или синтетическим аминокислотам, D- и/или L-оптическим изомерам, аминокислотным аналогам и пептидомиметикам.

Авторы данного изобретения идентифицировали мышиное антитело, описанное в примерах. Это антитело называется в данном документе как TFPI-4F36A1B2 (альтернативно, 4F36 или MuTFPI4F36). Данное изобретение охватывает это антитело, его варианты и фрагменты, в том числе химерные антитела и гуманизированные антитела, которые сохраняют один или более вид активности мышиного антитела, и которые также описаны в примерах. Активности этого антитела включают способность связываться с TFPI, способность связываться со специфическими местами молекулы TFPI и способность ингибировать активность TFPI.

Подходящий фрагмент или вариант этого антитела будет сохранять способность связываться с TFPI. Предпочтительно он будет сохранять способность специфически связываться с TFPI. Предпочтительно он будет сохранять способность специфически связываться с таким же или аналогичным эпитопом или областью молекулы TFPI, как антитело (MuTFPI4F36), из которого он получен. Предпочтительно он будет сохранять одну или более дополнительную функцию антитела, из которого он получен, например способность ингибировать активность TFPI или способность снижать время свертывания крови, возможно без уменьшения числа тромбоцитов.

«Фрагменты» полипептида или антитела в соответствии с изобретением могут быть получены путем усечения, например путем удаления одной или более аминокислот с N и/или С-конца полипептида. В этом случае с N- и/или С-конца может быть удалено до 10, до 20, до 30, до 40 или более аминокислот. Фрагменты также могут быть получены путем введения одной или более внутренней делеции.

Антитело изобретения может представлять собой (или может содержать) фрагмент антитела MuTFPI4F36 или его вариант. Антитело изобретения может представлять собой (или может содержать) антигенсвязывающую часть этого антитела или его варианта, как обсуждалось выше. Например, антитело изобретения может быть Fab-фрагментом этого антитела или его вариантом или может быть одноцепочечным антителом, полученным из этого антитела или его варианта.

Аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей антитела MuTFPI4F36 приведены в SEQ ID №№6 и 10, соответственно. Аминокислотные последовательности VL- и VH-цепей антитела MuTFPI4F36 приведены в SEQ ID №№4 и 8, соответственно. Аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепей одного гуманизированного антитела, HzTFPI4F36, приведены в SEQ ID №№21 и 24, соответственно. Аминокислотные последовательности VL- и VH-цепей HzTFPI4F36 приведены в SEQ ID №№15 и 18, соответственно.

Антитело изобретения может включать аминокислотную последовательность легкой цепи MuTFPI4F36, приведенную в SEQ ID №6, или ее фрагмент или вариант. Антитело может дополнительно или альтернативно включать аминокислотную последовательность тяжелой цепи MuTFPI4F36, приведенную в SEQ ID №10, или ее фрагмент или вариант, как описано в данном документе.

Антитело изобретения может включать VL-аминокислотную последовательность SEQ ID №4 или ее фрагмент или вариант. Антитело изобретения может включать VH-аминокислотную последовательность SEQ ID №8 или ее фрагмент или вариант. Антитело изобретения может включать и (a) VL-аминокислотную последовательность SEQ ID №4 или ее фрагмент или вариант, и (б) VH-аминокислотную последовательность SEQ ID №8 или ее фрагмент или вариант.

Антитело изобретения может включать фрагмент одной из аминокислотных последовательностей VL или VH, показанных на фиг.2. Например, антитело изобретения может включать фрагмент по меньшей мере из 7, по меньшей мере из 8, по меньшей мере из 9, по меньшей мере из 10, по меньшей мере из 12, по меньшей мере из 15, по меньшей мере из 18, по меньшей мере из 20 или по меньшей мере из 25 последовательных аминокислот из SEQ ID №4 или 8. Предпочтительно такой фрагмент будет сохранять одну или более из функций, обсуждаемых выше, например способность связываться с TFPI.

Подходящий фрагмент или вариант любой из этих последовательностей VH или VL будет сохранять способность связываться с TFPI. Предпочтительно он будет сохранять способность специфически связываться с TFPI. Предпочтительно он будет сохранять способность специфически связываться с таким же или аналогичным эпитопом или областью молекулы TFPI, как антитело (MuTFPI4F36), из которого он получен. Предпочтительно он будет сохранять одну или более из дополнительных функций антитела, из которого он получен, например способность ингибировать активность TFPI или способность снижать время свертывания крови, возможно без уменьшения числа тромбоцитов.

Подходящий фрагмент или вариант VL-последовательности предпочтительно будет сохранять аминокислоты в позициях Е31, S32, D33, Y37, А96, Т97, Н98 и F99 в SEQ ID №4. Подходящий фрагмент или вариант VH-последовательности предпочтительно будет сохранять аминокислоты в позициях N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, Р61, D62, Q65, Y102, D103 и D106 в SEQ ID №8. Подходящий фрагмент или вариант антитела предпочтительно будет сохранять аминокислоты в позициях Е31, S32, D33, Y37, А96, Т97, Н98 и F99 в SEQ ID №4 и аминокислоты в позициях N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, Р61, D62, Q65, Y102, D103 и D106 в SEQ IN №8. Как указано на фиг.3, они являются остатками в последовательностях легкой и тяжелой цепи MuTFPI4F36, которые имеют тяжелый атом на расстоянии 4 Å от тяжелого атома, когда MuTFPI4F36 связан с К2-доменом TFPI.

Антитело изобретения может включать CDR-область от специфического антитела, определенного в данном документе, например CDR-область из SEQ ID №4 или 8. Такое антитело предпочтительно будет сохранять способность связываться с TFPI, как описано в данном документе. Например, как показано на фиг.3, используя определение Кабат, CDR-последовательности в легкой цепи MuTFPI4F36 могут быть определены как аминокислоты с 24 по 39, с 55 по 61 и с 94 по 102 из SEQ ID №4 или SEQ ID №6. CDR-последовательности в тяжелой цепи MuTFPI4F36 могут быть определены как аминокислоты с 31 по 35, с 50 по 66 и с 99 по 110 из SEQ ID №8 или SEQ ID №10. Антитело изобретения может включать одну или более из последовательностей CDR, указанных на фиг.3. Например, антитело изобретения может включать одну, две или все три аминокислотные последовательности, показанные как остатки с 24 по 39, с 55 по 61 и с 94 по 102 из SEQ ID №6. Антитело изобретения альтернативно или дополнительно может включать одну, две или все три аминокислотные последовательности, показанные как остатки с 31 по 35, с 50 по 66 и с 99 по 110 из SEQ ID №10. Антитело изобретения может включать все шесть аминокислотных последовательностей, которые показаны как остатки с 24 по 39, с 55 по 61 и с 94 по 102 из SEQ ID №6 и с 31 по 35, с 50 по 66 и с 99 по 110 из SEQ ID №10.

Антитело изобретения может быть гуманизированным антителом, таким как антитело, называемое в данном документе как HzTFPI4F36 (MKA TFPI 2021). Такое антитело может включать одну или более CDR-область из SEQ ID №15 или 18.

Тяжелая цепь антитела в соответствии с изобретением может включать CDR1-последовательность аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18, где одна из этих аминокислот может быть заменена другой аминокислотой.

Тяжелая цепь антитела в соответствии с изобретением может включать CDR2-последовательность аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Тяжелая цепь антитела в соответствии с изобретением может включать CDR3-последовательность аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Легкая цепь антитела в соответствии с изобретением может включать CDR1-последовательность аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Легкая цепь антитела в соответствии с изобретением может включать CDR2-последовательность аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Легкая цепь антитела в соответствии с изобретением может включать CDR3-последовательность аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Более конкретно, антитело изобретения может иметь тяжелую цепь, которая включает:

- CDR1-последовательность, которая, в свою очередь, состоит из аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18;

- CDR2-последовательность, которая, в свою очередь, состоит из аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18; и

- CDRS-последовательность, которая, в свою очередь, состоит из аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18.

Антитело изобретения может иметь легкую цепь, которая включает:

- CDR1-последовательность, которая, в свою очередь, состоит из аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15;

- CDR2-последовательность, которая, в свою очередь, состоит из аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15; и

- CDR3-последовательность, которая, в свою очередь, состоит из аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15.

Антитело изобретения может содержать любое сочетание указанных выше CDR-областей.

Более конкретно, каркасная область 2 (FR2) тяжелой цепи антитела изобретения может включать аминокислоты:

- Т в позиции, соответствующей позиции 40,

- Е в позиции, соответствующей позиции 42,

- R в позиции, соответствующей позиции 44 и

- А в позиции, соответствующей позиции 49 из SEQ ID №18.

Альтернативно, указанная FR2 тяжелой цепи может включать аминокислоты с 36 по 49 из SEQ ID №18.

Антитело изобретения может содержать что-либо из:

- аминокислотной последовательности VL из SEQ ID №15.

- аминокислотной последовательности VH из SEQ ID №18.

- SEQ ID №№15 и 18.

- аминокислотной последовательности легкой цепи SEQ ID №21.

- аминокислотной последовательности тяжелой цепи SEQ ID №24.

- SEQ ID №№21 и 24.

Антитело изобретения может альтернативно представлять собой или может содержать вариант одной из этих специфических последовательностей, например вариант антитела MuTFPI4F36 или вариант HzTFPI4F36. Например, вариант может быть вариантом любой из вышеуказанных аминокислотных последовательностей с заменой, делецией или добавлением.

Вариантом в соответствии с данным изобретением может быть антитело, которое не включает:

- N в позиции, соответствующей позиции 31 из CDR1-области SEQ ID №18;

- R в позиции, соответствующей позиции 53;

- S в позиции, соответствующей позиции 54;

- S в позиции, соответствующей позиции 56;

- Y в позиции, соответствующей позиции 57;

- Y в позиции, соответствующей позиции 59;

- F в позиции, соответствующей позиции 60;

- Р в позиции, соответствующей позиции 61;

- D в позиции, соответствующей позиции 62; и

- Q в позиции, соответствующей позиции 65;

из CDR2-области SEQ ID №18.

- Y в позиции, соответствующей позиции 102;

- D в позиции, соответствующей позиции 103; и

- D в позиции, соответствующей позиции 106;

из CDR3-области SEQ ID №18.

- Е в позиции, соответствующей позиции 31;

- S в позиции, соответствующей позиции 32;

- D в позиции, соответствующей позиции 33; и

- Y в позиции, соответствующей позиции 37;

из CDR1-области SEQ ID №15.

- А в позиции, соответствующей позиции 96;

- Т в позиции, соответствующей позиции 97;

- Н в позиции, соответствующей позиции 98; и

- F в позиции, соответствующей позиции 99;

из CDR3-области SEQ ID №15.

Вариант антитела может включать 1, 2, 3, 4, 5, до 10, до 20, до 30 или более аминокислотных замен и/или делеций и/или вставок из специфических последовательностей и фрагментов, о которых говорилось выше. «Делеционные» варианты могут включать делецию отдельных аминокислот, делецию небольших групп аминокислот, например 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или делецию больших аминокислотных областей, например делецию конкретного аминокислотного домена или других деталей. «Инсерционные» варианты могут включать вставку отдельных аминокислот, вставку небольших групп аминокислот, например 2, 3, 4 или 5 аминокислот, или вставку больших аминокислотных областей, например вставку конкретных аминокислотных доменов или других деталей. Варианты «с заменой» предпочтительно включают замену одной или более аминокислот тем же числом аминокислот и осуществление консервативных аминокислотных замен. Например, аминокислота может быть заменена альтернативной аминокислотой, обладающей сходными свойствами, например, другой основной аминокислотой, другой кислой аминокислотой, другой нейтральной аминокислотой, другой заряженной аминокислотой, другой гидрофильной аминокислотой, другой гидрофобной аминокислотой, другой полярной аминокислотой, другой ароматической аминокислотой или другой алифатической аминокислотой. Некоторые свойства 20 главных аминокислот, которые можно использовать для выбора подходящих заместителей, приведены далее:

Ala алифатическая, гидрофобная, нейтральная Met гидрофобная, нейтральная Cys полярная, гидрофобная, нейтральная Asn полярная, гидрофильная, нейтральная Asp полярная, гидрофильная, заряженная (-) Pro гидрофобная, нейтральная Glu полярная, гидрофильная, заряженная (-) Gln полярная, гидрофильная, нейтральная Phe ароматическая, гидрофобная, нейтральная Arg полярная, гидрофильная, заряженная (+) Gly алифатическая, нейтральная Ser полярная, гидрофильная, нейтральная His ароматическая, полярная, гидрофильная, заряженная (+) Thr полярная, гидрофильная, нейтральная Ile алифатическая, гидрофобная, нейтральная Val алифатическая, гидрофобная, нейтральная Lys полярная, гидрофильная, заряженная (+) Trp ароматическая, гидрофобная, нейтральная Leu алифатическая, гидрофобная, нейтральная Tyr ароматическая, полярная, гидрофобная

Предпочтительные «производные» или «варианты» включают те, в которых вместо природной аминокислоты в последовательности появляется аминокислота, которая является ее структурным аналогом. Аминокислоты, используемые в последовательностях, также могут быть производными или модифицированными, например, мечеными, обеспечивая несущественное нарушение функции антитела.

Замены могут быть консервативными заменами, но не ограничиваются ими.

Производные и варианты, описанные выше, могут быть получены в процессе синтеза антитела или модификации после продукции, или когда антитело является рекомбинантной формой, с использованием известных методик сайт-направленного мутагенеза, случайного мутагенеза или ферментативного расщепления и/или лигирования нуклеиновых кислот.

В другом аспекте данное изобретение описывает мультиспецифичные молекулы, содержащие анти-TFPI-антитело изобретения или его антигенсвязывающий фрагмент. Такие мультиспецифичные молекулы включают биспецифичные молекулы по меньшей мере с одной специфичностью связывания для TFPI и второй специфичностью связывания для второго эпитопа-мишени. Один тип биспецифичных молекул является биспецифичным антителом, известным в данной области. Биспецифичные антитела, или действительно мультиспецифичные антитела, могут быть получены как антитела полной длины или как фрагменты антител (например, F(ab')2-биспецифичные антитела) или как любые другие антиген-связывающие фрагменты, описанные в данном документе.

В одном аспекте данное изобретение описывает производные антител (или иммуноконъюгаты), такие как анти-TFPI-антитела, конъюгированные или ковалентно связанные со вторым агентом. Второй агент может быть связан с антителом непосредственно или косвенно с помощью любого из большого количества доступных способов, известных специалистам в данной области. Например, агент может быть присоединен к шарнирной области редуцированного компонента антитела через дисульфидный мостик с помощью кросс-линкеров, таких как N-сукцинил-S-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), или через углеводную группировку в Fc-области антитела.

В одном аспекте могут быть разработаны антитела изобретения с включением модификаций в Fc-области, как правило, для изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как время полужизни в сыворотке, связывание комплемента, Fc-рецепторное связывание, стабильность белков и/или антиген-зависимая клеточная цитотоксичность, или удаления таких свойств. Кроме того, антитело изобретения может быть химически модифицировано (например, к антителу может быть прикреплена одна или более химическая группировка) или модифицировано таким образом, чтобы изменялось его гликозилирование, снова для изменения одного или более из функциональных свойств антитела.

При желании класс антитела может быть «переключен» с помощью известных методик. Например, антитело, которое было первоначально получено как молекула IgM, может быть переключено на антитело IgG. Методики переключения класса также могут быть использованы для преобразования одного подкласса IgG в другой, например: IgG1 в IgG2 или IgG4, IgG2 в IgG1 или IgG4; или IgG4 в IgG1 или IgG2. Разработка антител для создания химерных молекул по константной области также может быть выполнена путем комбинации областей из различных подклассов IgG.

В одном воплощении шарнирная область CHI модифицирована таким образом, что число остатков цистеина в шарнирной области изменяется, например повышается или понижается. Этот подход также описан, например, Bodmer et al. в патенте США №5677425.

Константная область также может быть модифицирована для стабилизации антитела, например для уменьшения риска разделения двухвалентного антитела на два одновалентных VH-VL-фрагмента. Например, в константной области IgG4 остаток S241 может быть мутирован на остаток пролина (Р) для формирования полного дисульфидного мостика на шарнире (см., например, Angal et al., Mol Immunol. 199S; 30:105-8).

Вариантные антитела в соответствии с изобретением могут иметь аминокислотные последовательности, которые более чем на 60%, или более чем на 65%, или более чем на 70%, или более чем на 75%, или более чем на 80%, предпочтительно более чем на 85%, например более чем на 90%, например более чем на 95% идентичны SEQ ID №4 или 8 или их фрагментам. Другие вариантные антитела в соответствии с изобретением могут иметь аминокислотные последовательности, которые более чем на 60%, или более чем на 65%, или более чем на 70%, или более чем на 75%, или более чем на 80%, предпочтительно более чем на 85%, например более чем на 90%, например более чем на 95% идентичны SEQ ID №№15 или 18 или их фрагментам. Этот уровень аминокислотной идентичности можно увидеть вдоль всей длины соответствующей SEQ ID №последовательности или на части последовательности, например вдоль 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200 или более аминокислот в зависимости от размера полипептида полной длины.

В связи с аминокислотными последовательностями термин «идентичность последовательности» относится к последовательностям, которые имеют значение, оцененное с помощью ClustalW (Thompson et al., 1994, см. выше) со следующими параметрами:

Параметры парного выравнивания - Способ: точный, Матрица: РАМ, штраф на внесение делеции: 10,00, штраф на удлинение делеции: 0,10;

Параметры множественного выравнивания - Матрица: РАМ, штраф на внесение делеции: 10,00, % идентичности для отсрочки: 30, штраф на концевую делецию: on, расстояние разделения делеции: 0, отрицательная матрица: нет, штраф на удлинение делеции: 0,20, штрафы на делецию специфического остатка: on, штрафы на гидрофильные делеции: on, гидрофильные остатки: GPSNDQEKR. Идентичность последовательности в конкретном остатке предназначена для включения идентичных остатков, которые были просто производными.

Таким образом, данное изобретение предлагает антитела со специфическими VH- и VL-аминокислотными последовательностями и их вариантами и фрагментами, которые поддерживают функцию или активность этих VH- и VL-доменов.

Соответственно, антитело изобретения может включать:

(а) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID №4;

(б) фрагмент по меньшей мере из 7 аминокислот (а), который сохраняет способность специфически связываться cTFPI; или

(в) вариант (а), имеющий по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность с последовательностью (а) и сохраняющий способность специфически связываться cTFPI.

Антитело изобретения может включать:

(а) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID №8;

(б) фрагмент по меньшей мере из 7 аминокислот (а), который сохраняет способность специфически связываться с TFPI, или

(в) вариант (а), имеющий по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность с последовательностью (а) и сохраняющий способность специфически связываться с TFPI.

Антитело изобретения может включать вариабельную область легкой цепи SEQ ID №4 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №8.

Антитело изобретения может включать:

(а) вариабельную область легкой цепи SEQ ID №4 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №8;

(б) вариант (а), в котором одна или обе последовательности (и тяжелой цепи, и легкой цепи) модифицированы таким образом, что он содержит фрагмент по меньшей мере из 7 аминокислот последовательности, указанной в (а), или

(в) вариант (а) или (б), в котором одна или обе последовательности (и тяжелой цепи, и легкой цепи) модифицированы таким образом, что он имеет по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность с последовательностью (а) или (б);

где антитело сохраняет способность специфически связываться с TFPI. Антитело может также сохранять одну или более из дополнительных функций или видов активности антитела изобретения, описанных в данном документе, таких как способность ингибировать TFPI или способность сокращать время свертывания крови, возможно без уменьшения числа тромбоцитов.

Предпочтительные фрагменты и варианты SEQ ID №4 будут включать (i) аминокислоты с 24 по 39 из SEQ ID №6; и/или (ii) аминокислоты с 55 по 61 из SEQ ID №6; и/или (iii) аминокислоты с 94 по 102 из SEQ ID №6. Предпочтительные фрагменты и варианты SEQ ID №8 будут включать (i) аминокислоты с 31 по 35 из SEQ ID №10; и/или (ii) аминокислоты с 50 по 66 из SEQ ID №10; и/или (iii) аминокислоты с 99 по 110 из SEQ ID №10.

Другие предпочтительные варианты SEQ ID №4 будут включать аминокислоты с 31 по 33, 37 и с 96 по 99 из SEQ ID №6. Другие предпочтительные варианты SEQ ID №8 будут включать аминокислоты 31, 53, 54, 56, 57, 59, 60, 61, 62, 65, 102, 103 и 106 из SEQ ID №10.

Антитело изобретения может включать:

(а) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID №15;

(б) фрагмент по меньшей мере из 7 аминокислот (а), который сохраняет способность специфически связываться с TFPI, или

(в) вариант (а), имеющий по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность с последовательностью (а) и сохраняющий способность специфически связываться с TFPI.

Антитело изобретения может включать:

(а) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID №18;

(б) фрагмент по меньшей мере из 7 аминокислот (а), который сохраняет способность специфически связываться c TFPI; или

(в) вариант (а), имеющий по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность с последовательностью (а) и сохраняющий способность специфически связываться cTFPI.

Антитело изобретения может включать вариабельную область легкой цепи SEQ ID №15 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №18.

Антитело изобретения может включать:

(а) вариабельную область легкой цепи SEQ ID №15 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID №18;

(б) вариант (а), в котором одна или обе последовательности (и тяжелой цепи, и легкой цепи) модифицированы таким образом, что он содержит фрагмент по меньшей мере из 7 аминокислот последовательности, указанной в (а); или

(в) вариант (а) или (б), в котором одна или обе последовательности (и тяжелой цепи, и легкой цепи) модифицированы таким образом, что он имеет по меньшей мере 70% аминокислотную идентичность с последовательностью (а) или (б);

где антитело сохраняет способность специфически связываться с TFPI. Антитело может также сохранять одну или более из дополнительных функций или видов активности антитела изобретения, описанных в данном документе, таких как способность ингибировать TFPI или способность сокращать время свертывания крови, возможно без уменьшения числа тромбоцитов.

Как объяснялось выше, антитело изобретения может связываться с тем же эпитопом или областью, как и другое антитело изобретения. Таким образом, будет видно, что такое антитело может связываться с тем же эпитопом или областью TFPI, как и какое-либо специфическое антитело, фрагмент и вариант, описанный в данном документе.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим антитела изобретения. Таким образом, полинуклеотид изобретения может кодировать любое антитело, описанное в данном документе. Термины «нуклеиновокислотная молекула» и «полинуклеотид» используются в данном документе как синонимы и относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, или к их аналогам. Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают ген, фрагмент гена, матричную РНК (мРНК), кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенную ДНК любой последовательности, выделенную РНК любой последовательности, нуклеиновокислотные зонды и праймеры. Полинуклеотид изобретения может быть представлен в выделенной или очищенной форме.

Нуклеиновокислотная последовательность, которая «кодирует» выбранный полипептид, является нуклеиновокислотной молекулой, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo под контролем соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5'(амино)-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'(карбокси)-конце. Для целей изобретения такие нуклеиновокислотные последовательности могут включать, но не ограничиваясь ими, кДНК из вирусных, прокариотических или эукариотических мРНК, геномные последовательности из вирусных или прокариотических ДНК или РНК и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции может быть расположена на 3'-конце кодирующей последовательности.

В одном воплощении полинуклеотид изобретения содержит последовательность, которая кодирует VH- или VL-аминокислотные последовательности, описанные выше. Например, полинуклеотид изобретения может кодировать полипептид, содержащий последовательность SEQ ID №4 или 8, или его вариант или фрагмент, как описано выше. Такой полинуклеотид может состоять из (или включать) любой нуклеиновокислотной последовательности из SEQ ID №№3, 5, 7 и 9. Подходящая полинуклеотидная последовательность альтернативно может быть вариантом одной из этих специфических полинуклеотидных последовательностей. Например, вариант может быть вариантом с заменой, делецией или добавлением любой из вышеуказанных нуклеиновокислотных последовательностей. Вариантный полинуклеотид может включать 1, 2, 3, 4, 5, до 10, до 20, до 30, до 40, до 50, до 75 или более нуклеиновокислотных замен и/или делеций в последовательностях, приведенных в списке последовательностей.

Подходящие варианты могут быть по меньшей мере на 70% гомологичны полинуклеотиду любой из SEQ ID №№3, 5, 7 и 9, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 90% и более, предпочтительно по меньшей мере на 95%, 97% или 99% гомологичны ей. Способы измерения гомологии хорошо известны в данной области, и специалистам в данной области должно быть понятно, что в данном контексте гомология рассчитывается на основании нуклеиновокислотной идентичности. Такая гомология может существовать на протяжении области по меньшей мере из 15, предпочтительно по меньшей мере из 30, например по меньшей мере из 40, 60, 100, 200 или более смежных нуклеотидов. Такая гомология может существовать на протяжении всей длины немодифицированной полинуклеотидной последовательности.

Способы измерения полинуклеотидной гомологии или идентичности хорошо известны в данной области. Например, UWGCG Package предлагает программу BESTFIT, которую можно использовать для вычисления гомологии (например, использовать с настройками по умолчанию) (Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395).

Также для расчета гомологии или выстраивания последовательностей могут быть использованы алгоритмы PILEUP и BLAST (как правило, с их настройками по умолчанию), например, как описано в Altschul S.F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10.

Программное обеспечение для выполнения анализа BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Этот алгоритм включает в первую очередь выявление пары последовательностей с максимальным сходством (HSP) путем выявления коротких «слов» (участков) длины W в запрошенных последовательностях, которые либо совпадают, либо удовлетворяют какому-либо положительно-оцененному порогу оценки Т при выравнивании с участком такой же длины из базы данных последовательностей. Т относится к порогу оценки смежного участка (Altschul et al., см. выше). Эти начальные совпадения смежных участков выступают в качестве затравки для начала поиска, чтобы найти HSP, содержащие их. Совпадения участков распространяются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока совокупная оценка выравнивания может увеличиваться. Удлинения совпадений участков в каждом направлении прекращаются, когда: совокупная оценка выравнивания стремится к нулю или ниже из-за накопления одного или более отрицательно-оцененных выравниваний остатков; или когда достигнут конец какой-либо последовательности. Параметры W, Т и Х в алгоритме BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. Программа BLAST использует в качестве значений по умолчанию длину слова (W) 11, матрицу BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919) выравнивания (В) 50, Е-значение (оценка количества случайных совпадений такого же качества) 10, М=5, N=4 и сравнение обеих цепей.

Алгоритм BLAST выполняет статистический анализ сходства двух последовательностей, например, см. Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Одним из показателей сходства, предлагаемых алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (Р(N)), которая позволяет судить о вероятности, с которой совпадение между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будет происходить случайно. Например, последовательность считается аналогичной другой последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении первой последовательности со второй последовательностью составляет менее примерно 1, предпочтительно менее примерно 0,1, более предпочтительно менее примерно 0,01, а наиболее предпочтительно менее примерно 0,001.

Гомолог может отличаться от последовательности в соответствующем полинуклеотиде менее чем на 3, 5, 10, 15, 20 или более мутаций (каждая из которых может быть заменой, делецией или вставкой). Эти мутации могут быть измерены на протяжении области по меньшей мере 30, например по меньшей мере 40, 60 или 100 или более смежных нуклеотидов гомолога.

В одном воплощении вариантная последовательность может отличаться от конкретных последовательностей, приведенных в списке последовательностей, из-за избыточности генетического кода. ДНК-код имеет 4 первичных нуклеиновокислотных остатка (А, Т, С и G) и использует их для «записи» трехбуквенных кодонов, которые представляют аминокислоты белков, кодируемых генами организма. Линейная последовательность кодонов вдоль молекулы ДНК транслируется в линейную последовательность аминокислот в белке(ах), кодируемом этим геном. Код сильно вырожден, так как 61 кодон кодирует 20 природных аминокислот и 3 кодона, которые представляют «стопа-сигналы. Таким образом, большинство аминокислот кодируются более чем одним кодоном - на самом деле, несколько кодируются четырьмя или более различными кодонами. Таким образом, вариантный полинуклеотид изобретения может кодировать одну и ту же полипептидную последовательность, как другой полинуклеотид изобретения, но может иметь отличную нуклеиновокислотную последовательность из-за использования различных кодонов для кодирования тех же аминокислот.

«Фрагменты» полинуклеотида в соответствии с изобретением могут быть получены путем усечения, например путем удаления одного или более нуклеотида на одном или обоих концах полинуклеотида. Таким образом с 3'- и/или 5'-конца полинуклеотида может быть удалено до 10, до 20, до 30, до 40, до 50, до 75, до 100, до 200 или более аминокислот. Фрагменты также могут быть получены путем введения одной или более внутренней делеции. Такие фрагменты могут быть получены из последовательности SEQ ID №№3, 5, 7 и 9 или могут быть получены из вариантного полинуклеотида, описанного в данном документе. Предпочтительно такие фрагменты имеют от 30 до 300 остатков в длину, например от 30 до 300, от 30 до 200, от 30 до 100, от 100 до 200 или от 200 до 300 остатков. Альтернативно, фрагменты изобретения могут быть более длинными последовательностями, например содержащими по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% полной длины полинуклеотида изобретения.

Таким образом, антитело изобретения может быть получено из (или доставлено в форме) полинуклеотида, который его кодирует и способен его экспрессировать. Когда антитело состоит из двух или более цепей, полинуклеотид изобретения может кодировать одну или более из цепей антитела. Например, полинуклеотид изобретения может кодировать легкую цепь антитела, тяжелую цепь антитела или обе цепи. Может быть предложено два полинуклеотида, один из которых кодирует легкую цепь антитела, а другой кодирует тяжелую цепь соответствующего антитела. Такой полинуклеотид или пара полинуклеотидов могут быть экспрессированы вместе, так что получается антитело изобретения.

Полинуклеотиды изобретения могут быть синтезированы в соответствии со способами, хорошо известными в данной области, описанными, например, в Sambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press).

Нуклеиновокислотные молекулы данного изобретения могут быть предложены в форме экспрессионной кассеты, которая включает контрольные последовательности, последовательности сигнального пептида, функционально связанные со вставленной последовательностью, что позволяет экспрессировать антитело изобретения in vivo. Эти экспрессионные кассеты, в свою очередь, как правило, предоставляются в векторах (например, плазмидах или рекомбинантных вирусных векторах). Такую экспрессионную кассету можно вводить непосредственно принимающему субъекту. Альтернативно, принимающему субъекту может быть введен вектор, содержащий полинуклеотид изобретения. Предпочтительно полинуклеотид получают и/или вводят с помощью генетического вектора. Подходящий вектор может быть любым вектором, который способен перенести достаточное количество генетической информации, а также позволить экспрессию полипептида изобретения.

Таким образом, данное изобретение включает векторы экспрессии, содержащие такие полинуклеотидные последовательности. Такие векторы экспрессии являются стандартными конструкциями в области молекулярной биологии образом и могут, например, включать применение плазмидной ДНК и соответствующих инициаторов, промоторов, энхансеров, последовательностей сигнального пептида и других элементов, таких как, например, сигналы полиаденилирования, которые могут быть необходимы и которые расположены в правильной ориентации, для обеспечения экспрессии пептида изобретения. Другие подходящие векторы будут очевидны специалистам в данной области. В качестве еще одного примера в этой связи мы обращаемся к Sambrook et al.

Изобретение также включает клетки, которые были модифицированы для экспрессии антитела изобретения. Такие клетки включают транзиентные или, предпочтительно, стабильные клеточные линии высших эукариотов, такие как клетки млекопитающих или клетки насекомых, низших эукариотов, такие как дрожжи, или прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки. Конкретные примеры клеток, которые могут быть модифицированы путем введения вектора или экспрессионной кассеты, кодирующей антитело изобретения, включают клетки млекопитающих HEK293, СНО, BHK, NSO и клетки сетчатки человека. Предпочтительно выбранной клеточной линией будет та, которая является не только стабильной, но и делает возможной зрелое гликозилирование полипептида и его экспрессию на клеточной поверхности.

Такие клеточные линии изобретения можно культивировать обычными способами, чтобы получить антитело изобретения, или их можно использовать терапевтически или профилактически для доставки антитела изобретения субъекту. Альтернативно, полинуклеотиды, экспрессионные кассеты или векторы изобретения могут быть введены в клетку от субъекта ex vivo, и затем клетка может быть возвращена в тело субъекта.

В другом аспекте данное изобретение предлагает композиции и составы, содержащие молекулы изобретения, такие как антитела, полинуклеотиды, векторы и клетки, описанные в данном документе. Например, изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую одну или более из молекул изобретения, например, одно или более из антител изобретения, составленную вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель является подходящим для парентерального, например внутривенного, внутримышечного или подкожного введения (например путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения антитело может быть покрыто материалом для защиты антитела от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать или денатурировать антитело.

Предпочтительные фармацевтически приемлемые носители включают водные носители или разбавители. Примеры подходящих водных носителей, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях изобретения, включают воду, водный буфер и физиологический раствор. Примеры других носителей включают этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Подходящая текучесть может быть обеспечена, например, за счет использования покрывающих материалов, таких как лецитин, за счет поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий, а также за счет применения поверхностно-активных веществ. Во многих случаях предпочтительным будет включение в композицию изотонических агентов, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит, сорбит, или хлорида натрия.

Фармацевтическая композиция изобретения также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Эти композиции также могут содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено как с помощью процедур стерилизации, см. выше, так и за счет включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательным включение в композиции изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированная абсорбция инъекционной лекарственной формы может быть получена за счет включения агентов, которые задерживают абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного препарата.

Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем включения активного агента (например, антитела) в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, в случае необходимости, с последующей стерилизацией путем микрофильтрации. Как правило, дисперсии готовят путем включения активного агента в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые позволяют получить порошок активного агента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из их раствора, предварительно простерилизованного путем фильтрации.

Фармацевтические композиции изобретения могут содержать дополнительные активные ингредиенты, а также антитело изобретения. Как уже упоминалось выше, композиции изобретения могут содержать одно или более из антител изобретения. Они также могут содержать дополнительные терапевтические или профилактические агенты. Например, когда фармацевтическая композиция изобретения предназначена для применения в лечении нарушения с повышенной кровоточивостью, она дополнительно может содержать один или более из агентов для уменьшения симптомов нарушения с повышенной кровоточивостью. Например, композиция может включать один или более из факторов свертывания крови. Композиция может включать один или более из других компонентов, предназначенных для улучшения состояния пациента. Например, когда композиция предназначена для применения в лечении пациентов, страдающих от нежелательной кровоточивости, например пациентов, перенесших операцию, или пациентов, страдающих от травмы, композиция может включать один или более анальгетик, анестетик, иммунодепрессант или противовоспалительный агент. Кроме того, под действие данного изобретения подпадает набор, включающий антитела или другие композиции изобретения и инструкции по применению. Такой набор также может содержать один или более дополнительный реагент, например дополнительный терапевтический или профилактический агент, описанный выше.

Антитела, другие молекулы и композиции данного изобретения имеют многочисленные терапевтические применения in vitro и in vivo, связанные с лечением и профилактикой нарушений свертывания. Например, эти антитела и композиции могут быть введены в культуру клеток, in vitro или ex vivo, или человеку в качестве субъекта, т.е. in vivo, для профилактики и лечения различных нарушений.

В частности, данное изобретение предлагает способы лечения нарушений с повышенной кровоточивостью или способы повышения свертываемости крови, включающие введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества антитела или другой молекулы или композиции изобретения. Например, такие способы могут применяться для лечения дефицитов факторов свертывания, таких как гемофилия А, гемофилия В, дефицит фактора XI, дефицит фактора VII, тромбоцитопения или болезнь Виллебранда. Такие способы могут применяться для лечения состояний, сопровождающихся присутствием ингибиторов факторов свертывания. Такие способы могут применяться для лечения чрезмерной кровоточивости. Антитела и композиции изобретения могут быть использованы для лечения пациентов до, во время или после хирургической операции или антикоагулянтной терапии или после травмы. Антитела и композиции, описанные в данном документе, могут быть использованы в любом таком лечении или могут быть использованы в производстве лекарственного средства для применения в любом таком лечении.

Антитела и композиции данного изобретения могут быть введены для профилактического/превентивного и/или лечебного воздействия.

В терапевтических целях антитела или композиции вводят субъекту, уже страдающему от расстройства или состояния, описанного выше, в количестве, достаточном для лечения, облегчения или частичной приостановки состояния или одного или более из его симптомов. Такое терапевтическое лечение может привести к уменьшению тяжести симптомов заболевания или увеличению частоты и продолжительности бессимптомных периодов. Количество, адекватное для достижения этой цели, определяется как «терапевтически эффективное количество». Например, если лечение применяется при нежелательной кровоточивости, терапевтический эффект может быть определен как снижение количества кровотечений или подходящая коагуляция для остановки кровоточивости в целом.

В профилактических или превентивных целях антитела или композиции вводят субъекту с риском развития расстройства или состояния, описанного выше, в количестве, достаточном для предотвращения или уменьшения последующих эффектов состояния или одного или более из его симптомов. Количество, адекватное для достижения этой цели, определяется как «профилактически эффективное количество». Например, если лечение применяется при нежелательной кровоточивости, профилактический эффект может быть определен как предотвращение кровотечений или сокращение срока или количества кровотечений по сравнению с тем, как это было бы в отсутствие модулятора.

Эффективные количества для каждой цели будут зависеть от тяжести заболевания или травмы, а также от веса и общего состояния субъекта.

Используемый в данном документе термин «субъект» включает любого человека или животное, отличное от человека. Термин «животное, отличное от человека» включает всех позвоночных, например млекопитающих и немлекопитающих, таких как приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, земноводные, пресмыкающиеся и т.д.

Антитело или композицию данного изобретения можно вводить одним или более путями введения с помощью одного или более различных способов, известных в данной области. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будет варьировать в зависимости от желаемых результатов. Предпочтительные пути введения антител или композиций изобретения включают внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие парентеральные пути введения, например путем инъекции или инфузии. Фраза «парентеральное введение», используемая в данном документе, обозначает способы введения, отличные от энтерального и местного введения, как правило, путем инъекций. Альтернативно, антитело или композиция изобретения может быть введена непарентеральным путем, таким как местный, эпидермальный или слизистый пути введения.

Аналогичным образом, антитело изобретения может быть использовано для изготовления лекарственного средства для парентерального введения.

Антитело изобретения может быть использовано для изготовления лекарственного средства, подходящего для внутривенного введения.

Антитело изобретения может быть использовано для изготовления лекарственного средства, подходящего для внутримышечного введения.

Антитело изобретения может быть использовано для изготовления лекарственного средства, подходящего для подкожного введения.

Подходящая дозировка антитела изобретения может быть установлена квалифицированным врачом. Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в фармацевтических композициях данного изобретения могут быть изменены таким образом, чтобы получить количество активного ингредиента, которое является эффективным для достижения желаемого терапевтического эффекта для конкретного пациента, состава и способа введения, не будучи при этом токсичным для пациента. Выбранный уровень дозировки будет зависеть от целого ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретного используемого антитела, от пути введения, времени введения, скорости выведения антитела, продолжительности лечения, других лекарств, соединений и/или материалов, используемых в сочетании с конкретными используемыми композициями, возраста, пола, веса, условий, общего состояния здоровья и истории болезни пациента, подлежащего лечению, и других факторов, хорошо известных в медицинской области.

Подходящая доза антитела изобретения может находиться, например, в диапазоне примерно от примерно 0,1 мкг/кг до примерно 100 мг/кг массы тела пациента, подлежащего лечению. Например, подходящая доза может составлять от примерно 1 мкг/кг до примерно 10 мг/кг массы тела в день или от примерно 1 мг/кг до примерно 5 мг/кг массы тела в день. Подходящая доза антитела изобретения может находиться в диапазоне от 2 до 200 мг/кг, например, примерно 150-200 мг/кг, например, примерно 150-170 мг/кг, например, примерно 100-150 мг/кг, например, примерно 50-100 мг/кг, например, примерно 70-90 мг/кг, например, примерно 10-50 мг/кг, например, примерно 10-30 мг/кг.

Другие подходящие дозировки могут составлять примерно 0,1-10 мг/кг, например, примерно 0,1-1 мг/кг, например, примерно 1-2 мг/кг или примерно 2-3 мг/кг, или примерно 4-5 мг/кг, или примерно 5-6 мг/кг, или примерно 6-7 мг/кг, или примерно 7-8 мг/кг, или примерно 8-9 мг/кг, или примерно 9-10 мг/кг, или примерно 10-21 мг/кг, например, примерно 10-11 мг/кг или примерно 11-12 мг/кг, или примерно 12-13 мг/кг, или примерно 13-14 мг/кг, или примерно 14-15 мг/кг, или примерно 15-16 мг/кг, или примерно 16-17 мг/кг, или примерно 17-18 мг/кг, или примерно 18-19 мг/кг, или примерно 19-20 мг/кг, или примерно 20-21 мг/кг.

Количество моноклонального антитела, вводимого субъекту, может быть таким, что его введение приводит к концентрации указанного моноклонального антитела в плазме крови субъекта от примерно 10 мкг/мл до примерно 40 мкг/мл, например, примерно 15-35 мкг/мл, например, примерно 10-15 мкг/мл, например, примерно 15-20 мкг/мл, например, примерно 20-25 мкг/мл, например, примерно 25-30 мкг/мл, например, примерно 30-35 мкг/мл, например, примерно 35-40 мкг/мл. Схемы дозировки могут быть изменены для достижения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно ввести один болюс, можно с течением времени ввести несколько дробных доз, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как предписано в конкретной терапевтической ситуации. Особенно выгодно составлять парентеральные композиции в единую лекарственную форму для облегчения введения и для равномерности дозировки. Понятие дозированной формы для однократного введения, используемое в данном документе, относится к физически разделенным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.

Антитела могут быть введены в виде однократной дозы или в виде многократных доз. Многократные дозы могут быть введены одним и тем же или разными путями и в одну и ту же или разные области. Альтернативно антитела могут быть введены в составе с замедленным высвобождением, в этом случае требуется меньшая частота введений. Дозировка и частота могут варьировать в зависимости от времени полужизни антитела у пациента и желательной продолжительности лечения. Дозировка и частота введения также может варьировать в зависимости от того, является лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических целях относительно низкая доза может вводиться с относительно редкими интервалами в течение длительного периода времени. В терапевтических целях может вводиться относительно высокая доза, например до тех пор, пока у пациента не наблюдается частичное или полное улучшение симптомов заболевания.

Таким образом, антитело изобретения может вводиться: примерно раз в день, примерно через день, примерно каждый третий день, примерно каждый четвертый день, примерно каждый пятый день, примерно каждый шестой день, примерно раз в неделю, например, каждые 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, примерно раз в две недели, например, каждые 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 дней, и примерно каждую третью неделю, например, каждые 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 дня, примерно каждую четвертую неделю, например, каждые 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 дней. Антитело изобретения также может вводиться по требованию.

Как уже упоминалось выше, антитела изобретения могут вводиться одновременно с одним или более другим терапевтическим агентом. Другой агент может быть агентом, который усиливает действие модулятора. Другой агент может быть агентом, который усиливает свертываемость крови, например фактором свертывания крови. В частности, модуляторы изобретения могут вводиться одновременно с фактором VII(a) или фактором VIII(a). Другой агент может быть предназначен для лечения других симптомов или состояний пациента. Например, другой агент может быть анальгетиком, анестетиком, иммунодепрессантом или противовоспалительным агентом.

Комбинированное введение двух или более агентов может быть достигнуто несколькими различными путями. В одном воплощении антитело и другой агент могут быть введены вместе в единой композиции. В другом воплощении антитело и другой агент могут быть введены в отдельных композициях как части комбинированной терапии. Например, модулятор может быть введен до, после или одновременно с другим агентом.

Термин «лечение», используемый в данном документе, относится к медикаментозной терапии любого человека или животного, нуждающегося в этом. Ожидается, что указанный субъект прошел медицинский осмотр врачом или ветеринаром, который поставил предварительный или окончательный диагноз, который указывал бы, что применение указанного специфического лечения будет полезно для здоровья указанного человека или животного. Сроки и цель указанного лечения могут варьировать от одного лица к другому в зависимости от состояния здоровья субъекта. Таким образом, указанное лечение может быть профилактическим, паллиативным, симптоматическим и/или терапевтическим. С точки зрения данного изобретения профилактическое, паллиативное, симптоматическое и/или терапевтическое лечение может представлять отдельные аспекты изобретения.

Таким образом, антитело изобретения можно вводить парентерально.

Антитело изобретения можно вводить внутривенно.

Антитело изобретения можно вводить внутримышечно.

Антитело изобретения можно вводить подкожно.

Антитело изобретения можно вводить профилактически.

Антитело изобретения можно вводить терапевтически (по требованию).

Антитело изобретения может обладать способностью значительно сокращать потерю крови.

Антитело изобретения может обладать способностью значительно сокращать время кровотечения.

Таким образом, изобретение также относится к способу лечения субъекта, нуждающегося в этом, моноклональным антителом, которое способно связывать К2-домен TFPI, где вводится такое количество моноклонального антитела, чтобы насытить им мишень. Количество вводимого моноклонального антитела может быть таким, чтобы насытить растворимый TFPI. Количество вводимого моноклонального антитела может быть таким, чтобы насытить эндотелий-связанный TFPI.

Термин «коагулопатия», используемый в данном документе, относится к повышению тенденции к кровотечению, что может быть вызвано любым качественным или количественным дефицитом любого прокоагуляционного компонента нормального каскада свертывания крови или любой повышенной регуляцией фибринолиза. Такие коагулопатии могут быть врожденными и/или приобретенными и/или ятрогенными и идентифицируются специалистом в данной области.

Неограничивающими примерами врожденных гипокоагулопатий являются гемофилия А, гемофилия В, дефицит фактора VII, дефицит фактора XI, болезнь Виллебранда и тромбоцитопении, такие как тромбастения Гланцмана и синдром Бернара-Сулье.

Неограничивающим примером приобретенной коагулопатии является дефицит сериновой протеазы, вызванный дефицитом витамина К; такой дефицит витамина К может быть вызван введением антагониста витамина К, таким как варфарин. Приобретенная коагулопатия также может появиться после обширной травмы. Этот случай, иначе известный как «кровавый порочный круг», характеризуется гемодилюцией (дилюционная тромбоцитопения и разбавление факторов свертывания крови), гипотермией, истощением факторов свертывания крови и нарушением обмена веществ (ацидозом). Инфузионная терапия и увеличение фибринолиза могут обострить эту ситуацию. Указанные кровотечения могут возникнуть в любой части тела.

Гемофилия А с «ингибиторами» (т.е. с аллоантителами против фактора VIII) и гемофилия В с «ингибиторами» (т.е. с аллоантителами против фактора IX) являются неограничивающими примерами коагулопатии, которые являются отчасти врожденными, а отчасти приобретенными.

Неограничивающим примером ятрогенной коагулопатии является передозировка антикоагулянтных лекарств - таких как гепарин, аспирин, варфарин и другие ингибиторы агрегации тромбоцитов - которые могут быть назначены для лечения тромбоэмболических заболеваний. Во-вторых, неограничивающим примером ятрогенной коагулопатии является коагулопатия, индуцированная чрезмерной и/или ненадлежащей инфузионной терапией, например коагулопатия, которая может быть вызвана переливанием крови.

В одном воплощении данного изобретения кровотечение связано с гемофилией А или В. В другом воплощении кровотечение связано с гемофилией А или В с приобретенными ингибиторами. В другом воплощении кровотечение связано с тромбоцитопенией. В другом воплощении кровотечение связано с болезнью Виллебранда. В другом воплощении кровотечение связано с серьезным повреждением тканей. В другом воплощении кровотечение связано с тяжелой травмой. В другом воплощении кровотечение связано с хирургической операцией. В другом воплощении кровотечение связано с геморрагическим гастритом и/или энтеритом. В другом воплощении кровотечение является профузным маточным кровотечением, например при отслойке плаценты. В другом воплощении кровотечение происходит в органах с ограниченными возможностями для механического гемостаза, например интракраниальное, внутриушное или внутриглазное кровотечение. В другом воплощении кровотечение связано с антикоагулянтной терапией.

Антитело данного изобретения может быть использовано для лечения субъекта с коагулопатией. Таким образом, изобретение также предлагает применение моноклонального антитела, которое способно связывать К2-домен TFPI, для лечения нуждающегося в этом субъекта, а также применение указанного антитела для изготовления лекарственного средства для лечения нуждающегося в этом субъекта. Кроме того, изобретение относится к способу лечения нуждающегося в этом субъекта моноклональным антителом, которое способно связываться с К2-доменом TFPI.

Применение указанного моноклонального антитела изобретения может значительно уменьшить потерю крови.

Применение указанного моноклонального антитела изобретения может значительно уменьшить время кровотечения.

Кроме того, применение указанного моноклонального антитела изобретения может уменьшить время свертывания крови in vivo, не вызывая транзиентной тромбоцитопении.

Воплощения

Ниже приведен список неограничивающих воплощений данного изобретения:

Воплощение 1: Моноклональное антитело, которое способно специфически связывать К2-домен TFPI, где указанное антитело способно связывать эпитоп, содержащий один или более из остатков, выбранных из группы, состоящей из E10, Е11, D12, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, С32, E33, R34, F35, K36 и L50 из SEQ ID №2.

Воплощение 2: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 1, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток E10 из SEQ ID №2.

Воплощение 3: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток Е11 из SEQ ID №2.

Воплощение 4: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток D12 из SEQ ID №2.

Воплощение 5: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток Р13 из SEQ ID №2.

Воплощение 6: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток R17 из SEQ ID №2.

Воплощение 7: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток Y19 из SEQ ID №2.

Воплощение 8: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток Т21 из SEQ ID №2.

Воплощение 9: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток Y23 из SEQ ID №2.

Воплощение 10: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток F24 из SEQ ID №2.

Воплощение 11: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток N26 из SEQ ID №2.

Воплощение 12: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток Q28 из SEQ ID №2.

Воплощение 13: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток Q31 из SEQ ID №2.

Воплощение 14: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток С32 из SEQ ID №2.

Воплощение 15: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток E33 из SEQ ID №2.

Воплощение 16: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток R34 из SEQ ID №2.

Воплощение 17: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток F35 из SEQ ID №2.

Воплощение 18: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток K36 из SEQ ID №2.

Воплощение 19: Моноклональное антитело в соответствии с любым из вышеуказанных воплощений, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остаток L50 из SEQ ID №2.

Воплощение 20: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-16 и 18-19, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остатки E10, Е11, D12, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, С32, E33, R34, K36 и L50 из SEQ ID №2.

Воплощение 21: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-3, 5-9, 12-13 и 15-19, где указанное антитело способно специфически связывать эпитоп, содержащий остатки E10, Е11, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 и L50 из SEQ ID №2.

Воплощение 22: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI, где легкая цепь указанного антитела содержит аминокислотные остатки:

- Е в позиции, соответствующей позиции 31,

- S в позиции, соответствующей позиции 32,

- D в позиции, соответствующей позиции 33,

- Y в позиции, соответствующей позиции 37,

- А в позиции, соответствующей позиции 96,

- Т в позиции, соответствующей позиции 97 и

- F в позиции, соответствующей позиции 99 из SEQ ID №15;

и где тяжелая цепь указанного антитела содержит аминокислотные остатки:

- N в позиции, соответствующей позиции 31,

- R в позиции, соответствующей позиции 53,

- S в позиции, соответствующей позиции 54,

- Y в позиции, соответствующей позиции 57,

- Y в позиции, соответствующей позиции 59,

- F в позиции, соответствующей позиции 60,

- Р в позиции, соответствующей позиции 61,

- D в позиции, соответствующей позиции 62,

- Q в позиции, соответствующей позиции 65,

- Y в позиции, соответствующей позиции 102,

- D в позиции, соответствующей позиции 103 и

- D в позиции, соответствующей позиции 106

из SEQ ID №18.

Воплощение 23: Моноклональное антитело в соответствии с любым из пп.1-21, где легкая цепь указанного антитела содержит аминокислотные остатки:

- Е в позиции, соответствующей позиции 31,

- S в позиции, соответствующей позиции 32,

- D в позиции, соответствующей позиции 33,

- Y в позиции, соответствующей позиции 37,

- А в позиции, соответствующей позиции 96,

- Т в позиции, соответствующей позиции 97 и

- F в позиции, соответствующей позиции 99 из SEQ ID №15;

и где тяжелая цепь указанного антитела содержит аминокислотные остатки:

- N в позиции, соответствующей позиции 31,

- R в позиции, соответствующей позиции 53,

- S в позиции, соответствующей позиции 54,

- Y в позиции, соответствующей позиции 57,

- Y в позиции, соответствующей позиции 59,

- F в позиции, соответствующей позиции 60,

- Р в позиции, соответствующей позиции 61,

- D в позиции, соответствующей позиции 62,

- Q в позиции, соответствующей позиции 65,

- Y в позиции, соответствующей позиции 102,

- D в позиции, соответствующей позиции 103 и

- D в позиции, соответствующей позиции 106 из SEQ ID №18.

Воплощение 24: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 22 или воплощением 23, где указанная тяжелая цепь также содержит S в позиции, соответствующей позиции 52 в SEQ ID №18.

Воплощение 25: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 22-23, где указанная легкая цепь также содержит Н в позиции, соответствующей позиции 98 в SEQ ID №15, и где указанная тяжелая цепь также содержит S в позиции, соответствующей позиции 56 в SEQ ID №18.

Воплощение 26: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела содержит CDR1-последовательность аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18, где одна из этих аминокислот может быть заменена другой аминокислотой.

Воплощение 27: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела содержит CDR1-последовательность аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18, где одна из этих аминокислот может быть заменена другой аминокислотой.

Воплощение 28: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела содержит CDR2-последовательность аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 29: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела содержит CDR2-последовательность аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 30: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела содержит CDR3-последовательность аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 31: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела содержит CDR3-последовательность аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 32: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где легкая цепь указанного антитела содержит CDR1-последовательность аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 33: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где легкая цепь указанного антитела содержит CDR1-последовательность аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 34: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где легкая цепь указанного антитела содержит CDR2-последовательность аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 35: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где легкая цепь указанного антитела содержит CDR2-последовательность аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 36: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где легкая цепь указанного антитела содержит CDR3-последовательность аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 37: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где легкой цепи указанного антитела включает CDR3-последовательность аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 38: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18, где одна из этих аминокислот может быть заменена другой аминокислотой; и/или

- CDR2-последовательность аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR3-последовательность аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 39: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, где тяжелая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18, где одна из этих аминокислот может быть заменена другой аминокислотой, и/или

- CDR2-последовательность аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами, и/или

- CDR3-последовательность аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 40: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где легкая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR2-последовательность аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR3-последовательность аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 41: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, где легкая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR2-последовательность аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR3-последовательность аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 42: Моноклональное антитело, которое способно связывать домен Кунитца 2 (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18, где одна из этих аминокислот может быть заменена другой аминокислотой; и/или

- CDR2-последовательность аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR3-последовательность аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами;

и где легкая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR2-последовательность аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR3-последовательность аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 43: Моноклональное антитело по любому из пп.1-21, где тяжелая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18, где одна из этих аминокислот может быть заменена другой аминокислотой; и/или

- CDR2-последовательность аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR3-последовательность аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами;

и где легкая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15, где одна, две или три из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR2-последовательность аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами; и/или

- CDR3-последовательность аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15, где одна или две из этих аминокислот могут быть заменены другими аминокислотами.

Воплощение 44: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 26-43, где указанные аминокислотные замены не содержат аминокислоты:

- N в позиции, соответствующей позиции 31

из CDR1-области SEQ ID №18;

- R в позиции, соответствующей позиции 53;

- S в позиции, соответствующей позиции 54;

- S в позиции, соответствующей позиции 56;

- Y в позиции, соответствующей позиции 57;

- Y в позиции, соответствующей позиции 59;

- F в позиции, соответствующей позиции 60;

- Р в позиции, соответствующей позиции 61;

- D в позиции, соответствующей позиции 62; и

- Q в позиции, соответствующей позиции 65;

из СОР2-области SEQ ID №18.

- Y в позиции, соответствующей позиции 102;

- D в позиции, соответствующей позиции 103; и

- D в позиции, соответствующей позиции 106;

из CDR3-области SEQ ID №18.

- Е в позиции, соответствующей позиции 31;

- S в позиции, соответствующей позиции 32;

- D в позиции, соответствующей позиции 33; и

- Y в позиции, соответствующей позиции 37;

из CDR1-области SEQ ID №15.

- А в позиции, соответствующей позиции 96;

- Т в позиции, соответствующей позиции 97;

- Н в позиции, соответствующей позиции 98; и

- F в позиции, соответствующей позиции 99;

из CDR3-области SEQ ID №15.

Воплощение 45: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 26-44, где указанная аминокислотная замена является консервативной заменой.

Воплощение 46: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 26-45, где тяжелая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность, которая содержит аминокислоты с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID №18; и

- CDR2-последовательность, которая содержит аминокислоты с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18; и

- CDR3-последовательность, которая содержит аминокислоты с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18.

Воплощение 47: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 26-46, где легкая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность, которая содержит аминокислоты с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15;

- CDR2-последовательность, которая содержит аминокислоты с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15; и

- CDR3-последовательность, которая содержит аминокислоты с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15.

Воплощение 48: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 46-47, где тяжелая цепь содержит:

- CDR1-последовательность, которая содержит аминокислоты с 31 по 35 (NYAMS)из SEQ ID №18;

- CDR2-последовательность, которая содержит аминокислоты с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18; и

- CDR3-последовательность, которая содержит аминокислоты с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18.

и где легкая цепь указанного антитела содержит:

- CDR1-последовательность, которая содержит аминокислоты с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15;

- CDR2-последовательность, которая содержит аминокислоты с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID №15; и

- CDR3-последовательность, которая содержит аминокислоты с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15.

Воплощение 49: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, где легкая цепь указанного антитела содержит SEQ ID №15.

Воплощение 50: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, где тяжелая цепь указанного антитела содержит SEQ ID №18.

Воплощение 51: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, где указанное антитело содержит SEQ ID №15 и SEQ ID №18.

Воплощение 52: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, где указанное антитело содержит легкую цепь SEQ ID №21.

Воплощение 53: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, где указанное антитело содержит тяжелую цепь SEQ ID №24.

Воплощение 54: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 52-53, где указанное антитело содержит SEQ ID №21 и SEQ ID №24.

Воплощение 55: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, которое является гуманизированным антителом.

Воплощение 56: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 55, в котором каркасная область 2 тяжелой цепи содержит аминокислоты:

- Т в позиции, соответствующей позиции 40,

- Е в позиции, соответствующей позиции 42,

- R в позиции, соответствующей позиции 44 и

- А в позиции, соответствующей позиции 49 из SEQ ID №18.

Воплощение 57: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 55, в котором каркасная область 2 тяжелой цепи содержит аминокислоты, соответствующие позициям с 36 по 49 (WVRQTPEKRLEWVA) из SEQ ID №18.

Воплощение 58: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-54, которое является человеческим антителом.

Воплощение 59: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-54, которое является химерным антителом.

Воплощение 60: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, где изотип указанного антитела является IgG.

Воплощение 61: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 60, где указанный изотип является IgG1, IgG2 или IgG4.

Воплощение 62: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 61, где изотип указанного антитела является IgG4.

Воплощение 63: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 60-62, где по меньшей мере одна аминокислота Fc-области указанного антитела была заменена другой аминокислотой.

Воплощение 64: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, где Fc-область указанного антитела по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, например, по меньшей мере на 90%, например, по меньшей мере на 95%, например на 95-100% идентична аминокислотам 122-448 из SEQ ID №24.

Воплощение 65: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем МКА 0281.

Воплощение 66: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-64, которое способно связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем МКА 0281.

Воплощение 67: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем МКА 4904.

Воплощение 68: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-66, которое способно связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем МКА 4904.

Воплощение 69: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем МКА 2974.

Воплощение 70: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-68, которое способно связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем МКА 2974.

Воплощение 71: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем МКА 29741.

Воплощение 72: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-70, которое способно связывать К2-домен TFPI с более высокой аффинностью, чем МКА 29741.

Воплощение 73: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI, где K_D указанного антитела составляет менее 0,8 нМ, например, менее 0,7 нМ, например, менее 0,6 нМ, например, менее 0,5 нМ, например, менее 0,4 нМ, например, менее 0,3 нМ, например, менее 0,2 нМ, например, менее 0,1 нМ, например, менее 0,05 нМ, например, менее 0,025 нМ.

Воплощение 74: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-73, где K_D указанного антитела составляет менее 0,8 нМ, например, менее 0,7 нМ, например, менее 0,6 нМ, например, менее 0,5 нМ, например, менее 0,4 нМ, например, менее 0,3 нМ, например, менее 0,2 нМ, например, менее 0,1 нМ, например, менее 0,05 нМ, например, менее 0,025 нМ.

Воплощение 75: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, которое способно связывать К2-домен тромбоцит-ассоциированного TFPI.

Воплощение 76: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, которое способно ингибировать растворимый TFPI.

Воплощение 77: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 76, где указанный растворимый TFPI может быть полностью ингибирован.

Воплощение 78: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, которое способно ингибировать липопротеин-связанный TFPI.

Воплощение 79: Моноклональное антитело в соответствии с любым из предыдущих воплощений, которое способно ингибировать связанный с эндотелиальными клетками TFPI.

Воплощение 80: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI таким образом, что FXa сохраняет свою активность по меньшей мере на 91%, например, по меньшей мере на 92%, например, по меньшей мере на 93%, например, по меньшей мере на 94%, например, по меньшей мере на 95%, например, по меньшей мере на 96%, например, по меньшей мере на 97%, например, по меньшей мере на 98%, например, по меньшей мере на 99%, например на 99-100% при измерении в анализе ингибирования FXa.

Воплощение 81: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-79, которое способно связывать TFPI таким образом, что FXa сохраняет свою активность по меньшей мере на 91%, например, по меньшей мере на 92%, например, по меньшей мере на 93%, например, по меньшей мере на 94%, например, по меньшей мере на 95%, например, по меньшей мере на 96%, например, по меньшей мере на 97%, например, по меньшей мере на 98%, например, по меньшей мере на 99%, например на 99-100% при измерении в анализе ингибирования FXa.

Воплощение 82: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI таким образом, что процент свободного TFPI у субъекта снижается до менее 30%, например, менее 29%, например, менее 28%, например, менее 27%, например, менее 26%, например, менее 25%, например, менее 24%, например, менее 23%, например, менее 22%, например, менее 21%, например, менее 20%, например, менее 19%, например, менее 18%, например, менее 17%, например, менее 16%, например, менее 15%, например, менее 14%, например, менее 13%, например, менее 12%, например, менее 11%, например, менее 10%, например, менее 9%, например, менее 8%, например, менее 7%, например, менее 6%, например, менее 5%, например, менее 4%, например, менее 3%, например, менее 2%, например, менее 1%, например, от 1% до 0%.

Воплощение 83: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-81, которое способно связывать К2-домен TFPI таким образом, что процент свободного TFPI у субъекта снижается до менее 30%, например, менее 29%, например, менее 28%, например, менее 27%, например, менее 26%, например, менее 25%, например, менее 24%, например, менее 23%, например, менее 22%, например, менее 21%, например, менее 20%, например, менее 19%, например, менее 18%, например, менее 17%, например, менее 16%, например, менее 15%, например, менее 14%, например, менее 13%, например, менее 12%, например, менее 11%, например, менее 10%, например, менее 9%, например, менее 8%, например, менее 7%, например, менее 6%, например, менее 5%, например, менее 4%, например, менее 3%, например, менее 2%, например, менее 1%, например, от 1% до 0%.

Воплощение 84: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 83, где количество свободного TFPI у субъекта уменьшается до указанного процента в течение первых 28 дней, например, в течение первых 27 дней, например, в течение первых 26 дней, например, в течение первых 25 дней, например, в течение первых 24 дней, например, в течение первых 23 дней, например, в течение первых 22 дней, например, в течение первого 21 дня, например, в течение первых 20 дней, например, в течение первых 19 дней, например, в течение первых 18 дней, например, в течение первых 17 дней, например, в течение первых 16 дней, например, в течение первых 15 дней, например, в течение первых 14 дней, например, в течение первых 13 дней, например, в течение первых 12 дней, например, в течение первых 11 дней, например, в течение первых 10 дней, например, в течение первых 9 дней, например, в течение первых 8 дней, например, в течение первых 7 дней, например, в течение первых 6 дней, например, в течение первых 5 дней, например, в течение первых 4 дней, например, в течение первых 3 дней, например, в течение первых 2 дней, например, в течение первого дня после введения указанного моноклонального антитела указанному лицу.

Воплощение 85: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI и которое способно нейтрализовать TFPI-ингибирование мембраносвязанного FVIIa/TF/FXa по меньшей мере на 55%, например, по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, например, по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 75%, например, по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, например, по меньшей мере на 90%, например, по меньшей мере на 95%, например, до 100%, например, 100%, измеренное в анализе ингибирования FVIIa/TF/FXa, когда TFPI насыщен указанным антителом.

Воплощение 86: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-84, где указанное антитело способно нейтрализовать TFPI-ингибирование мембраносвязанного FVIIa/TF/FXa по меньшей мере на 55%, например, по меньшей мере на 60%, например, по меньшей мере на 65%, например, по меньшей мере на 70%, например, по меньшей мере на 75%, например, по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 85%, например, по меньшей мере на 90%, например, по меньшей мере на 95%, например, до 100%, например, 100%, измеренное в анализе ингибирования FVIIa/TF/FXa, когда TFPI насыщен указанным антителом.

Воплощение 87: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI и которое уменьшает in vivo время свертывания крови без значительного снижения числа тромбоцитов.

Воплощение 88: Моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-86, где указанное антитело уменьшает in vivo время свертывания крови без значительного снижения числа тромбоцитов.

Воплощение 89: Моноклональное антитело в соответствии с воплощением 88, где число тромбоцитов не падает примерно до 80%, например, примерно до 75%, например, примерно до 70%, например, примерно до 65%, например, примерно до 60%, например, примерно до 55%, например, примерно до 50%, например, примерно до 45%, например, примерно до 40%, например, примерно до 35%, например, примерно до 30%, например, примерно до 25% от первоначального числа тромбоцитов.

Воплощение 90: Моноклональное антитело, которое способно связывать К2-домен TFPI и которое уменьшает in vivo время свертывания крови, не вызывая транзиентную тромбоцитопению.

Воплощение 91: Моноклональное антитело в соответствии с одним из воплощений 1-89, где указанное антитело уменьшает in vivo время свертывания крови, не вызывая транзиентную тромбоцитопению.

Воплощение 92: Фрагмент моноклонального антитела в соответствии с любым из предыдущих воплощений.

Воплощение 93: Фрагмент моноклонального антитела в соответствии с воплощением 92, который представляет собой Fab-фрагмент, F(ab')₂-фрагмент, Fab'-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент или dAb-фрагмент.

Воплощение 94: Вариант моноклонального антитела в соответствии с любым из воплощений, который является вариантом с делецией или вариантом со вставкой.

Воплощение 95: Фармацевтический состав, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-94.

Воплощение 96: Фармацевтический состав, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-94, где указанный состав подходит для парентерального применения.

Воплощение 97: Фармацевтический состав, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-94, где указанное антитело подходит для внутривенного применения.

Воплощение 98: Фармацевтический состав, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-94, где указанное антитело подходит для внутримышечного применения.

Воплощение 99: Фармацевтический состав, содержащий моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-94, где указанное антитело подходит для подкожного применения.

Воплощение 100: Применение моноклонального антитела в соответствии с любым из воплощений 1-94 для изготовления лекарственного средства, подходящего для парентерального введения.

Воплощение 101: Применение моноклонального антитела в соответствии с любым из воплощений 1-94 для изготовления лекарственного средства, подходящего для внутривенного введения.

Воплощение 102: Применение моноклонального антитела в соответствии с любым из воплощений 1-94 для изготовления лекарственного средства, подходящего для внутримышечного введения.

Воплощение 103: Применение моноклонального антитела в соответствии с любым из воплощений 1-94 для изготовления лекарственного средства, подходящего для подкожного введения.

Воплощение 104: Применение моноклонального антитела в соответствии с любым из воплощений 1-94 для лечения субъекта с коагулопатией.

Воплощение 105: Применение в соответствии с воплощением 104, где указанный субъект имеет какую-либо врожденную, приобретенную и/или ятрогенную коагулопатию, такую, которая может быть выбрана из группы, состоящей из гемофилии А, с ингибиторами или без, и гемофилии В, с ингибиторами или без.

Воплощение 106: Применение в соответствии с любым из воплощений 95-105, где указанное моноклональное антитело значительно снижает потерю крови.

Воплощение 107: Применение в соответствии с любым из воплощений 95-106, где указанное моноклональное антитело значительно снижает время кровотечения.

Воплощение 108: Применение в соответствии с любым из воплощений 95-107, где количество вводимого моноклонального антитела приводит к концентрации указанного моноклонального антитела в плазме крови от примерно 10 мкг/мл до примерно 40 мкг/мл, например, примерно 15-35 мкг/мл, например, примерно 10-15 мкг/мл, например, примерно 15-20 мкг/мл, например, примерно 20-25 мкг/мл, например, примерно 25-30 мкг/мл, например, примерно 30-35 мкг/мл, например, примерно 35-40 мкг/мл.

Воплощение 109: Способ лечения субъекта с коагулопатией, включающий введение указанному субъекту моноклонального антитела в соответствии с любым из воплощений 1-94.

Воплощение 110: Способ в соответствии с воплощением 109, где указанная коагулопатия является любой врожденной, приобретенной и/или ятрогенной коагулопатией, такой, которая может быть выбрана из группы, состоящей из гемофилии А, с ингибиторами или без, и гемофилии В, с ингибиторами или без.

Воплощение 111: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-110, где указанное моноклональное антитело способно значительно сократить потерю крови.

Воплощение 112: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-110, где указанное моноклональное антитело способно значительно сократить время кровотечения.

Воплощение 113: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-112, где количество вводимого моноклонального антитела таково, чтобы насытить его мишень.

Воплощение 114: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-113, где количество вводимого моноклонального антитела таково, чтобы насытить растворимый TFPI.

Воплощение 115: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-114, отличающийся тем, что вводимое антитело способно полностью ингибировать растворимый TFPI.

Воплощение 116: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-115, где указанное моноклональное антитело вводят в количестве, достаточном для насыщения эндотелий-связанного TFPI.

Воплощение 117: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-116, где количество вводимого моноклонального антитела приводит к концентрации указанного моноклонального антитела в плазме крови от примерно 10 мкг/мл до примерно 40 мкг/мл, например, примерно 15-35 мкг/мл, например, примерно 10-15 мкг/мл, например, примерно 15-20 мкг/мл, например, примерно 20-25 мкг/мл, например, примерно 25-30 мкг/мл, например, примерно 30-35 мкг/мл, например, примерно 35-40 мкг/мл.

Воплощение 118: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-117, где может вводиться однократная доза.

Воплощение 119: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-118, где могут вводиться многократные дозы.

Воплощение 120: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-119, где указанное антитело может вводиться раз в день.

Воплощение 121: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-120, где указанное антитело может вводиться через день.

Воплощение 122: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-121, где указанное антитело может вводиться каждый третий день.

Воплощение 123: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-122, где указанное антитело может вводиться каждый четвертый день.

Воплощение 124: Способ по любому из вариантов 109-123, где указанное антитело может вводиться каждый день пятый.

Воплощение 125: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-124, где указанное антитело может вводиться каждый шестой день.

Воплощение 126: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-125, где указанное антитело может вводиться примерно раз в неделю, например каждые 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней.

Воплощение 127: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-126, где указанное антитело может вводиться примерно раз в две недели, например каждые 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 дней.

Воплощение 128: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-127, где указанное антитело может вводиться примерно раз в три недели, например каждые 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 дня.

Воплощение 129: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-128, где указанное антитело может вводиться примерно раз в четыре недели, например каждые 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 день.

Воплощение 130: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-129, где дозировка может составлять примерно 0,1-10 мг/кг, например, примерно 0,1-1 мг/кг, например, примерно 1-2 мг/кг, или примерно 2-3 мг/кг, или примерно 4-5 мг/кг, или примерно 5-6 мг/кг, или примерно 6-7 мг/кг, или примерно 7-8 мг/кг, или примерно 8-9 мг/кг, или примерно 9-10 мг/кг, или примерно 10-21 мг/кг, например, примерно 10-11 мг/кг, или примерно 11-12 мг/кг, или примерно 12-13 мг/кг, или примерно 13-14 мг/кг, или примерно 14-15 мг/кг, или примерно 15-16 мг/кг, или примерно 16-17 мг/кг, или примерно 17-18 мг/кг, или примерно 18-19 мг/кг, или примерно 19-20 мг/кг, или примерно 20-21 мг/кг.

Воплощение 131: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-130, где дозировка может составлять примерно от 2 до 200 мг/кг, например, примерно 150-200 мг/кг, например, примерно 150-170 мг/кг, например, примерно 100-150 мг/кг, например, примерно 50-100 мг/кг, например, примерно 70-90 мг/кг, например, примерно 10-50 мг/кг, например, примерно 10-30 мг/кг.

Воплощение 132: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-131, где указанное моноклональное антитело может вводиться парентерально.

Воплощение 133: Способ в соответствии с воплощением 132, где указанное моноклональное антитело может вводиться внутривенно.

Воплощение 134: Способ в соответствии с воплощением 133, где дозировка указанного моноклонального антитела может составлять примерно 10-20 мг/кг.

Воплощение 135: Способ в соответствии с любым из воплощений 133-134, где указанное антитело может вводиться раз в две недели.

Воплощение 136: Способ в соответствии с любым из воплощений 133-135, где указанное антитело может вводиться раз в три недели.

Воплощение 137: Способ в соответствии с любым из воплощений 133-136, где указанное антитело может вводиться раз в четыре недели.

Воплощение 138: Способ в соответствии с воплощением 133, где дозировка указанного моноклонального антитела может составлять примерно 10-20 мг/кг и где указанное антитело может вводиться раз в две недели.

Воплощение 139: Способ в соответствии с воплощением 133, где дозировка указанного моноклонального антитела может составлять примерно 10-20 мг/кг и где указанное антитело может вводиться раз в три недели.

Воплощение 140: Способ в соответствии с воплощением 133, где дозировка указанного моноклонального антитела может составлять примерно 10-20 мг/кг и где указанное антитело может вводиться раз в четыре недели.

Воплощение 141: Способ в соответствии с воплощением 132, где указанное моноклональное антитело может вводиться внутримышечно.

Воплощение 142: Способ в соответствии с воплощением 132, где указанное монокпональное антитело может вводиться подкожно.

Воплощение 143: Способ в соответствии с воплощением 132, где дозировка указанного моноклонального антитела может составлять примерно 1 мг/кг.

Воплощение 144: Способ в соответствии с любым из воплощений 141-143, где моноклональное антитело может вводиться ежедневно.

Воплощение 145: Способ в соответствии с любым из воплощений 141-144, где моноклональное антитело может вводиться через день.

Воплощение 146: Способ в соответствии с любым из воплощений 141-145, где дозировка указанного моноклонального антитела может составлять примерно 1 мг/кг и где указанное моноклональное антитело может вводиться ежедневно.

Воплощение 147: Способ в соответствии с любым из воплощений 141-146, где дозировка указанного моноклонального антитела может составлять примерно 1 мг/кг и где указанное моноклональное антитело может вводиться через день.

Воплощение 148: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-147, где указанное монокпональное антитело может вводиться профилактически.

Воплощение 149: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-148, где указанное моноклональное антитело может вводиться терапевтически (по требованию).

Воплощение 150: Способ в соответствии с любым из воплощений 109-149, где указанное вводимое антитело способно полностью (на 100%) ингибировать растворимый TFPI.

Воплощение 151: Полинуклеотид, кодирующий моноклональное антитело в соответствии с любым из воплощений 1-94.

Воплощение 152: Полинуклеотид в соответствии с воплощением 151, который содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №№13, 16, 19 и 22.

Воплощение 153: Полинуклеотид в соответствии с воплощением 152, который содержит SEQ ID №19.

Воплощение 154: Полинуклеотид в соответствии с воплощением 152, который содержит SEQ ID №22.

Воплощение 155: Полинуклеотид в соответствии с воплощением 152, который содержит SEQ ID №№19 и 22.

Воплощение 156: Эукариотическая клетка, которая содержит полинуклеотид в соответствии с любым из воплощений 151-155.

Воплощение 157: Эукариотическая клетка, которая экспрессирует моноклональное антитело или его фрагмент в соответствии с любым из воплощений 1-94.

Воплощение 158: Эукариотическая клетка в соответствии с воплощением 157, которая является клеткой млекопитающего.

Воплощение 159: Эукариотическая клетка в соответствии с воплощением 157, которая является дрожжевой клеткой.

Воплощение 160: Клетка млекопитающего в соответствии с воплощением 158, которая выбрана из группы, состоящей из HEK293, СНО, ВНК, НСО и клеток сетчатки человека.

ПРИМЕРЫ

Данное изобретение также проиллюстрировано следующими примерами, которые не должны рассматриваться в качестве ограничения. Содержимое всех графических материалов и все ссылки, патенты и опубликованные патентные заявки, приводимые в этой заявке, безоговорочно включены в нее посредством ссылки.

Пример 1: Получение и характеризация моноклональных антител, направленных против TFPI

Были созданы моноклональные антитела против ингибитора пути тканевого фактора (TFPI). Было идентифицировано, клонировано и секвенировано моноклональное антитело, обладающее желаемой специфичностью связывания. Было обнаружено, что это антитело значительное снижает время кровотечения из кутикулы in vivo и не приводит к значительному снижению числа тромбоцитов.

Способы и результаты

Все наборы использовали в соответствии с инструкциями производителей. Сокращения: НС: тяжелая цепь, LC: легкая цепь; VH: вариабельный домен тяжелой цепи; VL: вариабельный домен легкой цепи; ПЦР: полимеразная цепная реакция.

Иммунизация и слияние

Мышей иммунизировали и TFPI полной длиной, и короткой версией TFPIB161B, которая содержит только первые два домена Кунитца. Для иммунизации и продукции мышиных моноклональных антител использовали RBF-мышей. Инъекции делали подкожно в спину мыши. Для первой инъекции 20 мкг белка смешивали с полным адъювантом Фрейнда. При последующих иммунизациях использовали неполный адъювант Фрейнда с той же концентрацией антигена. Через десять дней после последней иммунизации в крови из глаз мышей с помощью ИФА оценивали TFPI-специфические антитела. Мышей с положительными титрами в сыворотках бустировали 10 мкг TFPI путем внутривенной инъекции и умерщвляли через три дня. Селезенки асептически удаляли и диспергировали до суспензии с единичными клетками. Слияние клеток селезенки и клеток миеломы проводили ПЭГ-способом или путем электрослияния.

Анализ связывания: ИФА

Иммунологические планшеты покрывали анти-мышиным IgG. В планшеты добавляли культуральные супернатанты от клеток гибридомы, и после отмывки добавляли растворимый биотинилированный человеческий TFPI или TFPIB161B для тестирования специфического связывания.

Анализы нейтрализации: анализ FXa и анализ TF/FVIIa/FXA Анализ ингибирования FXa: фиксированную концентрацию TFPI, приводящую к 90% ингибированию FXa, предварительно инкубировали с культуральными супернатантами от гибридомных клеток, содержащими анти-TFPI моноклональные антитела, и добавляли к FXa плюс FXa-специфический хромогенный субстрат. Этот анализ исследует связывание TFPI с FXa (более подробно описано в примере 6).

Анализ ингибирования FVIIa/TF/FXA: 1) Инкубация культуральных супернатантов от гибридомных клеток, содержащих моноклональные антитела, направленные против TFPI и фиксирующие его (90% ингибирование FVIIa/TF); 2) Инкубация TFPI + FVIIa + TF + FXa; 3) Добавление FX (FX>>FXa) с последующей инкубацией с FXa хромогенным субстратом (более подробно описано в примере 7).

Протромбиновое время с разведенным тромбопластином (dPT)

Анализ протромбинового времени (РТ) с разведенным тромбопластином: плазма крови человека в сочетании с разведенным человеческим тромбопластином (источник TF). Время образования сгустка в плазме измеряли при добавлении увеличивающихся концентраций очищенного на белке А моноклонального TFPI-антитела для поиска дозозависимого снижения времени свертывания. FVIIa (25 нМ) был положительным контролем и должен был сокращать это время образования сгустка.

Анализ взаимодействия при связывании

Анализ взаимодействия при связывании проводили путем поверхностного плазменного резонанса на Biacore 3000. Захват соответствующего моноклонального антитела при фиксированной концентрации получали с иммобилизованными мышиными анти-IgG. Тестировали различные концентрации TFPI. Определение констант связывания (K_on, K_off, K_D) получали при условии взаимоотношения TFPI и представляющего интерес антитела 1:1 (более подробно описано в примере 8).

Тромбоэластография

Это записи кинетики образования сгустка и фибринолиза в цельной крови. Гемофилия А-подобное состояние индуцировали путем предварительной инкубации крови с нейтрализующим анти-IgG FVIII.

Клонирование и секвенирование антитела

Мышиные последовательности тяжелой и легкой цепей для анти-TFPI-антитела клонировали из гибридомы: TFPI-4F36A1B2 (сокращенной в данной документе как 4F36). Тотальную РНК, выделенную из клеток гибридомы с помощью набора RNeasy-Mini Kit от Qiagen, использовали в качестве матриц для синтеза кДНК. кДНК синтезировали в 5'-RACE реакции (быстрой амплификации концов кДНК) с помощью набора для амплификации кДНК SMART™ RACE от Clontech. Последующую прицельную амплификацию последовательностей НС и LC проводили путем ПЦР с использованием полимеразы Phusion Hot Star (Finnzymes) и универсальной смеси праймеров (UPM, universal primer mix), включенной в набор SMART™ RACE в качестве прямого праймера. Для амплификации НС (VH-домена) был использован обратный праймер со следующей последовательностью: 5'-CCCTTGACCAGGCATCCCAG-3' (праймер №129). Для амплификации LC был использован обратный праймер со следующей последовательностью: 5'-GCTCTAGACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3' (праймер №69).

ПЦР-продукты разделяли путем гель-электрофореза, выделяли с помощью набора GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit от GE Healthcare Bio-Sciences и клонировали для секвенирования с помощью набора Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit и химически компетентных ТОР10 E.coli от Invitrogen. На отдельных колониях проводили ПЦР на колониях с помощью смеси AmpliTaq Gold Master Mix от Applied Biosystems и праймеров M13uni/M13rev. Очистку ПЦР на колониях проводили с помощью ферментной смеси ExoSAP-IT (USB). Секвенирование проводили на MWG Biotech, Martinsried Germany с использованием праймеров для секвенирования M13uni(-21)/M13rev(-29) или Т3/Т7. Последовательности анализировали и снабжали комментариями с помощью программы VectorNTI.

Из гибридомы TFPI-4F36A1B2 был выявлен один уникальный мышиный LC каппа-типа и один уникальный мышиный НС, подкласс IgG1. LC-последовательность приведена в SEQ ID №6, а НС-последовательность приведена в SEQ ID №10. Последовательности VH и VL показаны на фиг.2, последовательности лидерных пептидов не включены.

Эпитопы

TFPI1 включает три домена Кунитца (см. фиг.4). Доступные на поверхности остатки домена Кунитца TFPI1 определяли на основе существующих структур TFPI1-2. В частности, остатки с относительной доступностью более 40% считаются поверхностно доступными. Для TFPI1-2, он включает (см. фиг.5): аминокислоты 94-95, 98, 100-110, 118-121, 123-124, 131, 134, 138-142 и 144-145.

Пример 2: Клонирование и секвенирование мышиного МКА TFPI4F36A1B2

В этом примере описано клонирование и секвенирование мышиных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи анти-TFPI-антитела: TFPI4F36A1B2.

Тотальную РНК выделяли из клеток гибридомы с помощью набора RNeasy-Mini Kit от Qiagen и использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК. кДНК синтезировали в 5'-RACE реакции с помощью набора для амплификации кДНК SMART™ RACE от Clontech. Последующую прицельную амплификацию последовательностей НС и LC проводили путем ПЦР с использованием полимеразы Phusion Hot Star (Finnzymes) и универсальной смеси праймеров (UPM, universal primer mix), включенной в набор SMART™ RACE в качестве прямого праймера. Для амплификации НС (VH-домена) использовали обратный праймер, указанный как SEQ ID №11, а для амплификации LC использовали обратный праймер указанный как SEQ ID №12. ПЦР-продукты разделяли путем гель-электрофореза, выделяли с помощью набора GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit от GE Healthcare Bio-Sciences и клонировали для секвенирования с помощью набора Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit и химически компетентных TOPO E.coli от Invitrogen. На отдельных колониях проводили ПЦР на колониях с помощью смеси AmpliTaq Gold Master Mix от Applied Biosystems и праймеров M13uni/M13rev. Очистку ПЦР на колониях проводили с помощью ферментной смеси ExoSAP-IT (USB). Секвенирование проводили на MWG Biotech, Martinsried Germany с использованием праймеров для секвенирования M13uni(-21)/M13rev(-29) или Т3/Т7. Последовательности анализировали и снабжали комментариями с помощью программы VectorNTI. Все наборы и реагенты использовали в соответствии с инструкциями производителей.

Из гибридомы TFPI-4F36A1B2 был выявлен один уникальный мышиный LC каппа-типа и один уникальный мышиный НС, подкласс IgG1. Нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности для вариабельных цепей показаны в SEQ ID №№7 и 9, соответственно. Последовательности лидерных пептидов не включены в эти последовательности.

Поиски по BLAST

Транслированные анти-TFPI4P36A1 В2 VL- и VH-аминокислотные последовательности использовали в качестве искомой последовательности. Поиски по BLAST проводили против последовательностей в базе данных Uniprot с использованием программы для трансляции BLASTp. Анти-TFPI4F36A1B2 VH, для которых было получено выравнивание более 20 из наивысшего показателя идентичности 50, были мышиными последовательностями тяжелой цепи Ig. Самый высокий показатель идентичности составлял 81% (99/121) против мышиной тяжелой цепи Ig. Анти-TFPI4P36A1B2 VL, для которых было получено выравнивание более 30 из наивысшего показателя идентичности 50, были мышиными последовательностями легкой цепи каппа Ig. Самый высокий показатель идентичности составлял 92% (105/113) против мыши легкой цепи каппа Ig. В заключение, VH- и VL-последовательности для анти-TFPI4P36A1B2 представляют новые уникальные последовательности.

Создание мышиных анти-TFPI4P36A1 В2 векторов экспрессии

Была создана серия экспрессионных векторов на основе CMV-промотора (рТТ-векторов) для транзиентной экспрессии мышиного TFPI4P36-антитела в экспрессионной системе на основе HEK293-6Е EBNA, разработанной Yves Durocher (Durocher et al. Nucleic Acid Research, 2002). В дополнение к CMV-промотору векторы содержат репликатор рМВ1, репликатор ВЭБ и ген резистентности Amp.

Область, соответствующую анти-TFPI4P36A1 В2 LC полной длины (включая исходную последовательность сигнального пептида) амплифицировали в ПЦР из исходных секвенированных клонов в ТОРО-системе с использованием праймеров, специфичных для N- и С-концевой последовательностей. Смысловой праймер содержал на конце сайт рестрикции HindIII для клонирования последовательностей и последовательность Козака (5'-GCCGCCACC-3') непосредственно перед старт-кодоном АТС. Антисмысловой праймер содержал стоп-кодон, а затем последовательность сайта рестрикции XbaI непосредственно после кодирующей последовательности. Созданный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами, клонировали в сайт множественного клонирования (MCS) линеаризованного основанного на рТТ вектора и трансформировали им E.coli для селекции. Последовательность окончательной конструкции проверяли путем секвенирования ДНК.

Область, соответствующую домену VH (включая исходную последовательность сигнального пептида) амплифицировали в ПЦР из исходных секвенированных клонов в ТОРО-системе с использованием праймеров, специфичных для N-концевой последовательности и последовательности перехода VH/CH. Смысловой праймер содержал на конце сайт рестрикции NotI для клонирования последовательностей и последовательность Козака (5'-GCCGCCACC-3') непосредственно перед старт-кодоном ATG. Антисмысловой праймер содержал в рамке считывания сайт рестрикции NheI ниже перехода VH/CH. Созданный ПЦР-фрагмент VH-домена расщепляли рестриктазами, клонировали в линеаризованный вектор, содержащий последовательность СН-домена мышиного IgG1, и трансформировали им E.coli для селекции. Последовательность окончательной конструкции проверяли путем секвенирования ДНК.

Клонированное и рекомбинантно экспрессированное анти-TFPI4P36A1B2 антитело имело во всех проводимых анализах тот же профиль и аффинность, что и исходное антитело, полученное с помощью гибридомы. Процедуры, используемые для транзиентной экспрессии в HEK293-6Е-клетки, описаны в примере 3.

Пример 3: Разработка и конструирование гуманизированного МКА TFPI4F36

Мышиные анти-TFPI4P36A1B2 CDR-последовательности аннотировали в соответствии с определением Кабат и выяснили, что они следующие:

CDR-H1: NYAMS (аминокислоты 31-35 из SEQ ID №8).

CDR-H2: TISRSGSYSYFPDSVQG (аминокислоты 50-66 из SEQ ID №8).

CDR-H3: LGGYDEGDAMDS (аминокислоты 99-110 из SEQ ID №8).

CDR-L1: KSSQSLLESDGKTYLN (аминокислоты 24-39 из SEQ ID №4).

CDR-L2: LVSILDS (аминокислоты 55-61 из SEQ ID №4).

CDR-L3: LQATHFPQT (аминокислоты 94-102 из SEQ ID №4).

3D-модель анти-TFPI4P36A1B2 строили в Modeller (www.salilab.org/modeller/) на основе структурных матриц 2GJJ (МКА против Her2erbb2) и 1X9Q (ПАВ против флуоресцеина).

Поиск BLASTp в человеческой зародышевой базе данных V с анти-TFPI4F36A1B2 VL и VH дал следующие четыре потенциальные зародышевые последовательности:

Тяжелая цепь: VH3_21 или VH7183.9 (Е-значения <1е-45)

Легкая цепь: VKII_A18 или VKII_A1 (Е-значения <3е-45)

После ручной проверки совпадений и выравниваний зародышевые последовательности VH3_21 и VKII_A18 были выбраны в качестве каркасных областей для гуманизации НС и LC, соответственно. Соответствующие зародышевые J-сегменты были выбраны на основе выравнивания таких последовательностей, как JH6 и JK4. Было показано выравнивание анти-TFPI4F36A1B2 и выбранных зародышевых последовательностей в сочетании с первой CDR-привитой версией гуманизированного TFPI4F36. Идентичность последовательностей анти-TFPI4P36A1B2 и человеческих остовов (НС: VH3_21/JH6 и LC: VKII_A18/JK4) очень высока, как отмечено звездочками на приведенных ниже последовательностях. Каждая звездочка означает позицию идентичности последовательности. Исходная гуманизированная VH-конструкция была разработана в соответствии со стратегией минимальной CDR-прививки, в которой CDR-H2 привит в более короткой версии (остатки 50-58), чем определенная по Кабат (остатки 50-66). Остальные 5 CDR были привиты в соответствии с определением Кабат. CDR (по определению Кабат) перечислены как привитые ниже; остатки, выделенные жирным шрифтом для CDR-H2, являются человеческими зародышевыми остатками.

CDR-H1: NYAMS (аминокислоты 31-35 из SEQ ID №18).

CDR-H2: TISRSGSYSYYADSVKG (аминокислоты 50-66 из SEQ ID №28).

CDR-H3: LGGYDEGDAMDS (аминокислоты 99-110 из SEQ ID №18).

CDR-L1: KSSQSLLESDGKTYLN (аминокислоты 24-39 из SEQ ID №15).

CDR-L2: LVSILDS (аминокислоты 55-61 из SEQ ID №15).

CDR-L3: LQATHFPQT (аминокислоты 94-102 из SEQ ID №15).

Структура CDR-H2 в окончательном гуманизированном варианте HzTFPI4F36 приведена ниже и соответствует CDR-H2, приведенному в списке для мышиного антитела анти-TFPI4P36A1B2.

CDR-H2: TISRSGSYSYFPDSVQG (аминокислоты 50-66 из SEQ ID №18).

На фиг.1 показаны последовательности доменов VH (А) и VL (В) мышиного анти-TFPI4P36A1B2 (SEQ ID №№8 и 4, соответственно), выровненные с человеческими зародышевыми последовательностями (SEQ ID №№32 и 31, соответственно) и CDR-привитыми гуманизированными TFPI4F36 последовательностями (SEQ ID №№28 и 26, соответственно). Используется схема нумерации Кабат, как показанные выше последовательности на фигуре, и CDR в соответствии с определением Кабат выделены жирным шрифтом. Различия в каркасных областях между мышиной анти-TFPI4P36A1B2 и зародышевой последовательностями выделены серым цветом в анти-TFPI4P36A1B2 последовательности. Звездочки указывают позиции идентичности последовательности между мышиной TFPI4F36 и человеческой зародышевой последовательностями. Потенциальные обратные мутации выделены серым цветом в HzTFPI4P36-CDR-привитой последовательности (записанной как hz4F36CDRgraft).

Потенциальные обратные мутации для HzTFPI4F36-CDR-привитой конструкции были определены на основе позиционных различий, существующих в каркасных областях мышиной TFPI4F36 и зародышевой последовательностей. 3D фиг.1 показывает модель последовательностей Fab-фрагмента TFPI4F36, также используемую для выявления и определения приоритетности потенциальных обратных мутаций. Списки созданных обратных мутаций в гуманизированных LC и НС TFPI4F36 приведены в таблицах 2 и 3, соответственно.

Создание векторов экспрессии для гуманизированного TFPI4F36

Последовательности ДНК для гуманизированных областей VH и VL TFPI4F36 синтезировали (GENEART AG) в соответствии с моделью гуманизации антитела, описанной выше. Получали последовательности с основной минимальной CDR-прививкой и без дополнительных обратных мутаций. В конструкции включали соответствующие зародышевые последовательности лидерных пептидов LC и НС, а также последовательность Козака (S'-GCCGCCACC-3') непосредственно перед старт-кодоном ATG.

Экспрессионный вектор на основе рТТ получали для транзиентной экспрессии гуманизированного антитела TFPI4F36 как человеческого каппа/IgG4 (S241P) изотипа. Пролиновую мутацию в позиции 241 (нумерация в соответствии с Кабат, соответствующая остатку 228 в системе нумерации EU (Edelman G.M. et AL., Proc. Natl. Acad. USA 63, 78-85 (1969)) вводили в шарнирную область IgG4 для ликвидации образования мономерных фрагментов антитела, т.е. «полуантител», состоящих из одной LC и одной НС.

Фрагмент VH вырезали из клонирующего вектора GENEART и клонировали в линеаризованный вектор на основе рТТ, содержащий последовательность СН-домена человеческого IgG4 (S241P), затем трансформируя им E.coli для селекции. Последовательность окончательной конструкции проверяли путем секвенирования ДНК. Фрагмент VL вырезали из клонирующего вектора GENEART и клонировали в линеаризованный вектор на основе рТТ, содержащий последовательность человеческого каппа CL-домена, и затем трансформировали им E.coli для селекции. Последовательность окончательной конструкции проверяли путем секвенирования ДНК.

Нуклеиновокислотные и аминокислотные последовательности VL, VH, LC и НС в CDR-привитом моноклональном антителе HzTFPI4F36 (последовательность сигнального пептида опущена) приведены в списке последовательностей (SEQ ID №№26-30).

Создание экспрессионных векторов для химерного мышь/человек TFPI4F36

Для лучшей возможной оценки гуманизированных вариантов TFPI4F36 химерную версию мышь/человек анти-TFPI4P36-антитела (ChimTFPI4F36) конструировали так, чтобы устранить любые различия, связанные с происхождением константной области и изотипом. Был создан Экспрессионный вектор на основе рТТ для транзиентной экспрессии химерного анти-TFPI4P36-антитела с мышиными вариабельными доменами на человеческом остове каппа/IgG4 (S241P) изотипа.

Область, соответствующую VH-домену, амплифицировали в ПЦР с анти-TFPI4F36A1B2 НС экспрессионной плазмиды с помощью универсального специфического праймера рТТ и праймера, специфического для С-конца домена VH. Смысловой праймер был специфическим для последовательности выше сайта рестрикции HindIII и старт-кодона ATG. Антисмысловой праймер содержал в рамке считывания сайт рестрикции NheI в последовательности перехода VH/CH. Созданный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами, клонировали в линеаризованный основанный на рТТ вектор, содержащий последовательность СН-домена человеческого IgG4 (S241P), и затем трансформировали им E.coli для селекции. Последовательность окончательной конструкции проверяли путем секвенирования.

Область, соответствующую VL-домену, амплифицировали в ПЦР с анти-TFPI4F36A1B2 LC экспрессионной плазмиды с помощью универсального специфического праймера рТТ и праймера, специфического для С-конца домена VL Смысловой праймер был специфическим для последовательности выше сайта рестрикции HindIII и старт-кодона ATG. Антисмысловой праймер содержал в рамке считывания сайт рестрикции BsiWI в последовательности перехода VL/CL. Созданный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами, клонировали в линеаризованный онованный на рТТ вектор, содержащий последовательность человеческого каппа CL-домена, и затем трансформировали им E.coli для селекции. Последовательность окончательной конструкции проверяли путем секвенирования.

Рекомбинантная экспрессия вариантов МКА

Мышиный анти-TFPI4P36A1B2, химерный анти-TFPI4P36 и гуманизированный варианты антитела TFPI4F36 транзиентно экспрессировали в клетки HEK293-6Е, следуя общему протоколу экспрессии антитела. Следующая процедура описывает общий протокол трансфекции, используемый для адаптированных к суспензии клеток HEK293-6Е.

Поддержание клеток

Клетки HEK293-6Е выращивали в суспензии в среде для экспрессии FreeStyle™ 293 (Gibco) с добавлением 25 мкг/мл Генетицина (Gibco), 0,1% (по объему) поверхностно-активного вещества Pluronic F-68 (Gibco) и 1% (по объему) пенициллина-стрептомицина (Gibco). Клетки культивировали в колбах Эрленмейера на шейкере в инкубаторах при 37°С, 8% CO₂ и 125 об/мин и поддерживали плотность клеток в диапазоне 0,1-1,5×10⁶ клеток/мл.

ДНК-трансфекция

- плотность клеток в культурах, используемых для трансфекции, составляла 0,9-2,0×10⁶ клеток/мл.

- на 1 мл культуры клеток использовали смесь 0,5 мкг LC-векторной ДНК + 0,5 мкг НС-векторной ДНК.

- ДНК разводиди в среде Opti-MEM (Gibco) в объеме 30 мкл среды/мкг ДНК, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре (23-25°С) в течение 5 мин.

- в качестве реагента для трансфекции использовали 293Fectin™ (Invitrogen) в концентрации 1 мкл на 1 мкг ДНК.

- 293Fectin™ разбавляли в 30 раз в среде Opti-MEM (Gibco), перемешивали и инкубировали при комнатной температуре (23-25°С) в течение 5 мин.

- растворы ДНК и 293Fectin смешивали и оставляли для инкубации при комнатной температуре (23-25°С) на 25 мин.

- затем смесь ДНК-293Fectin™ добавляли непосредственно в клеточную культуру.

- трансфицированную клеточную культуру переносили на шейкер в инкубаторе с температурой 37°С, 8% CO₂ и 125 об/мин.

- через 3-6 дней после трансфекции супернатанты клеточных культур собирали центрифугированием с последующей фильтрацией через фильтр PES с диаметром пор 0,22 мкм (Corning).

- Количественный анализ продукции антитела выполняли путем интерферометрии биослоя непосредственно на осветленных супернатантах от культуры клеток с использованием системы ForteBio Octet и биосенсоров с белком А или количественной ВЭЖХ с белком А.

Анализы активности CDR-привитого варианта гуманизированного анти-TFPI4P36

Гуманизация по схеме минимальной CDR-прививки привела к значительной потере аффинности, вызванной влиянием как на скорость связывания, так и на скорость диссоциации. Аффинность связывания TFPI исходной привитой версии гуманизированного антитела TFPI4F36 (HzTFPI4F36-CDRпривитое, в таблице 1 указан как гуманизированное TFPI4F36) по меньшей мере в 100 раз ниже, чем аффинность ~ 30 пМ исходного мышиного антитела TFPI4F36 (см. таблицу 1). Сохранение аффинности химерного антитела подтвердило, что человеческий каппа/IgG4 (S241P) FC не влияет на аффинность антитела. Анализы аффинности были выполнены с помощью SRP, как описано ниже.

Таблица 1 МКА Ka (1/Мс) kd (1/M) KD (M) Мышиное TFPI4F36 4,70Е+06 1,33Е-04 2,82Е-11 Химерное TFPI4F36 8,88Е+06 1,44Е-04 1,62Е-11 Гуманизированное TFPI4F36 1,07Е+06 2,21Е_03 2,06Е-09

Анализ поверхностного плазмонного резонанса (Biacore) взаимодействия hzTFPI4F36-TFPI

Кинетические параметры взаимодействия рекомбинантного человеческого TFPI с исходным мышиным анти-TFPI4P36A1B2, химерным анти-TFPI4P36, а также различными вариантами гуманизированного антитела TFPI4F36 определяли путем анализа SPR в Biacore с помощью двух различных подходов. Исследования исходных кинетических показателей были основаны на процедуре захвата очищенных МКА, как описано в примере 1. За ними следовала кинетическая процедура прямого связывания на конструкциях выбранных МКА с моноклональным антителом, ковалентно связанным через свободные аминогруппы к карбоксиметилированной декстрановой мембраной (СМ5) на поверхности сенсорного чипа. Рекомбинантный человеческий TFPI вводили в различных концентрациях, после чего шел период диссоциации с постоянным потоком буфера по поверхности сенсорного чипа, как описано в примере 8.

Сайт-направленный мутагенез для введения обратной мутации в гуманизированное МКА

Основываясь на низкой аффинности CDR-привитой версии гуманизированного анти-TFPI4P36, в легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (НС) HzTFPI4F36-CDRgrafted были созданы серии из 27 обратных мутаций от человека к мыши. Эти мутанты экспрессировали, очищали и анализировали в Biacore либо как отдельные мутанты, либо как комбинированные мутанты LC/HC. Списки созданных мутаций приведены в таблицах 2 и 3, соответственно.

Сайт-направленный мутагенез проводили с целью введения обратных мутаций от человека к мыши (далее именуемых как обратные мутации) в специфические остатки в конструкциях HzTFPI4F36-CDRgrafted LC/HC, как подчеркивается в схеме гуманизации. Мутации вводили двумя различными способами:

1) наборы QuickChange® Site-Directed или Multi Site-Directed Mutagenesis от Stratagene использовали для введения точечных мутаций и комбинированных мутаций. Наборы использовали в соответствии с протоколом производителя.

2) Стандартный 2-х ступенчатый способ ПЦР с перекрывающимися праймерами использовали для введения точечных мутаций и создания комбинированных мутаций.

LC- и НС-экспрессионные плазмиды для HzTFPI4F36-CDRgrafted использовали в качестве матрицы для первых циклов мутагенеза. В последующих циклах мутации также вводили с использованием ранее мутированных плазмид в качестве матрицы. Последовательности всех конечных конструкций проверяли путем секвенирования ДНК.

Таблица 2 Мутированные варианты легкой цепи HzTFPI4F36-CDRgrafted Мутанты LC Мутации K_D (М) HzTFPI4F36 LC-S63T S63T 7,8Е-9 HzTFPI4F36 LC-P15I Р151 17,0Е-9 HzTFPI4F36 LC-FR2 Y36L, K39R, Q42E, Q45K 6,3Е-10 HzTFPI4F36 LC-P15I, FR2 Р151, Y36L, K39R, Q42E, Q45K 6,4Е-10 HzTFPI4F36 LC-Y36L Y36L >3Е-11 HzTFPI4F36 LC-K39R, Q42E, Q45K K39R, Q42E, Q45K >3Е-11

Таблица 3 Мутированные варианты тяжелой цепи HzTFPI4F36-CDRgrafted Мутанты НС Мутации K_D (М) HzTFPI4F36 HC-Q3E Q3E 5,8Е-9 HzTFPI4F36 HC-G44R G44R 2,3Е-9 HzTFPI4F36 HC-S49A S49A 3,0Е-9 Мутанты НС Мутации K_D (М) HzTFPI4F36 HC-Y59F Y59F 5,5Е-9 HzTFPI4F36 HC-A60P А60Р 2,2Е-9 HzTFPI4F36 HC-K64Q K64Q 2,5Е-9 HzTFPI4F36 HC-S77T S77T 1,5Е-9 HzTFPI4F36 НС-А93Т А93Т 2,7Е-9 HzTFPI4F36 HC-Y59F, А60Р Y59F, A60P 2,3Е-9 HzTFPI4F36 НС-KABAT CDR2 Y59F, А60Р, K64Q 9,0Е-10 HzTFPI4F36 HC-FR2, S49A А40Т, G42E, G44R, S49A 1,3Е-9 HzTFPI4F36 HC-FR3 N82aS, A84S, V89M 5,3Е-9 HzTFPI4F36 HC-FR3, S77T S77T, N82aS, A84S, V89M 7,7Е-9 HzTFPI4F36 HC-FR3, А93Т N82aS, A84S, V89M, А93Т 4,1Е-9 HzTFPI4F36 HC-FR2 А40Т, G42E, G44R 8,8Е-10 HzTFPI4F36 HC-FR2, S49A, CDR2 А40Т, G42E, G44R, S49A, Y59F, А60Р, K64Q 2,6Е-11 HzTFPI4F36 HC-G42E, G44R, CDR2 G42E, G44R, Y59F, А60Р, K64Q 3,9Е-11 HzTFPI4F36 HC-FR2, CDR2 А40Т, G42E, G44R, Y59F, А60Р, K64Q >3Е-11 HzTFPI4F36 HC-G42E, G44R, S49A CDR2 G42E, G44R, S49A, Y59F, А60Р, K64Q >3Е-11 HzTFPI4F36 HC-G42E, G44R, А60Р, K64Q G42E, G44R, А60Р, K64Q 9,3Е-11 HzTFPI4F36 HC-G44R, А60Р, K64Q G44R, А60Р, K64Q 3,0Е-11

Мутации и в LC, и в НС, перечисленные в таблицах 2 и 3, последовательно пронумерованы в соответствии со схемой нумерации Кабат, как показано на фиг 1.

LC-мутанты, перечисленные в таблице 2, экспрессировали как мутанты LC только вместе с диким типом НС HzTFPI4P36-CDRпривитый. НС-мутанты, перечисленные в таблице 3, экспрессировали как мутанты НС только вместе с диким типом LC HzTFPI4F36-CDRgrafted. LC-HC-комбинированные мутанты также экспрессировали путем сочетания различных LC- и НС-мутантов. Мутанты последовательно называли по мутированной цепи, т.е. окончательный вариант гуманизированного МКА выражался как дикий тип HzTFPI4P36-CDRпривитый LC и мутированный HzTFPI4F36 FR2, S49A, CDR2 НС. Транзиентную экспрессию HEK293-6Е осуществляли, как описано выше.

Исходный набор из 9 точечных мутантов (HzTFPI4F36 LC-S63T и HzTFPI4F36 HC-Q3E; G44R; S49A; Y59F; А60Р; K64Q; S77T; А93Т) был основан на основном наборе обратных мутаций, выделенных для схемы гуманизации. Ни один из точечных мутантов не сохранил аффинность антитела, однако мутации во второй человеческой каркасной области тяжелой цепи (FR2, между CDR H1 и CDR Н2) и в С-концевой области CDR H2 (опущенной в схеме минимальной CDR-прививки) были отмечены как важные для TFPI-связывания. Измерения аффинности посредством анализов Biacore проводили, как описано выше.

Последующие циклы мутагенеза включали ряд патч-мутантов (фрагментных мутантов), в которых все остатки в отдельных областях были мутированы коллективно. Мутант HzTFPI4F36 НС-Кабат CDR2 имеет 3 мутации Y59F, А60Р, K64Q в С-концевой области CDR H2, которая соответствует привитому CDR H2 в соответствии с определением Кабат, но не в соответствии со схемой минимальной CDR-прививки, используемой для исходного варианта HzTFPI4F36-CDRgrafted. Этот патч-мутант вместе с патч-мутантами в LC FR2 и НС FR2 значительно повышал аффинность гуманизированного антитела TFPI4F36, но ни один из трех патч-мутантов индивидуально не восстановил высокую TFPI4P36-аффинность.

НС-мутант с комбинированными мутациями в НС FR2 и CDR2 (А40Т, G42E, G44R, S49A, Y59F, А60Р, K64Q) полностью восстановил аффинность. Этот мутант представил 7 дополнительных мышиных остатков в последовательности антитела. Сочетание LC РР2-мутантов (обеих FR2 мутаций и Y36L) и НС FR2- и/или CDR2-мутантов также привело к высокой аффинности мутантов. Тем не менее, сочетание этих LC/HC-мутантов последовательно привело к снижению полученной экспрессии по сравнению только с НС-мутантами. Эти результаты показали, что включение LC-мутантов оказало негативное воздействие на стабильность этих вариантов антител, таким образом подтверждая, что существует тонкий характер взаимодействия между гуманизированными TFPI4F36 LC и НС.

В последней серии мутантов 7 мутаций в НС FR2 и CDR2 (А40Т, G42E, G44R, S49A, Y59F, А60Р, K64Q) были удалены в целях устранения потенциально не способствующих обратных мутаций. Для решения этого вопроса была получена серия из 5 мутантов.

В трех мутантах обратные мутации были исключены из FR2:

HZTFPI4F36 HC-G42E, G44R, CDR2

HZTFPI4F36 HC-FR2, CDR2

HZTFPI4F36 HC-G42E, G44R, S49A CDR2

В двух мутантах дополнительные мутации в CDR2 также были удалены:

HZTFPI4F36 HC-G44R, А60Р, K64Q

HZTFPI4F36 HC-G42E, G44R, А60Р, K64Q

Тем не менее, ни один из мутантов не был на одном уровне с комбинированным НС FR2 CDR2-мутантом. В подгруппе мутантов НС FR2 CDR2 с каким-либо сокращением была затронута либо аффинность, либо уровни экспрессии (либо и то, и другое). Два мутанта HZTFPI4F36 НС G42E, G44R, Y59F, А60Р, K64Q с 5 оставшимися обратными мутациями и HZTFPI4F36 НС G42E, G44R, А60Р, K64Q с 4 оставшимися обратными мутациями были выбраны для полного сравнения с HZTFPI4F36 HC-FR2, S49A, CDR2.

- HZTFPI4F36 HC-G42E, G44R, А60Р, K64Q и HZTFPI4F36 HC-FR2, S49A, CDR2 экспрессировались на сопоставимых уровнях, в то время HZTFPI4F36 HC-G42E, G44R, CDR2 имел несколько более низкий уровень экспрессии. Ускоренное определение биофизической стабильности не показало никаких различий в стабильности трех вариантов.

- Показатели аффинности, измеренной Biacore, приведены ниже.

- Эффективность in vivo, измеренная в анализе dPT (как описано ниже), были сопоставима для всех трех вариантов.

Таблица 4 Кинетические параметры взаимодействия между TFPI и гуманизированными вариантами TFPI4F36. Мутанты K_D (пкМ) Полученная экспрессия (мг/л) № обратных мутаций HZTFPI4F36 А40Т, G42E, G44R, S49A, Y59F, 26 54 7 А60Р, K64Q       HZTFPI4F36 G42E, G44R, Y59F, А60Р, K64Q 39 24 5 HZTFPI4F36 G42E, G44R, А60Р, K64Q 93 53 4

На основании данных, описанных выше, исходный мутант НС FR2 и CDR2 с 7 НС-обратными мутациями (А40Т, G42E, G44R, S49A, Y59F, А60Р, K64Q) превосходит другие варианты; этот вариант в данном документе упоминается как HzTFPI4F36 или как МКА TFP12021.

Вполне вероятно, что CDR2-мутации Y59F, А60Р, K64Q влияют на аффинность антитела путем непосредственного взаимодействия с антигеном. Мутации А40Т, G42E, G44R, присущие FR2, в свою очередь связываясь с CDRH1 и CDRH2, удаляются с антиген-связывающей поверхности и могут быть готовы для стабилизации взаимодействий LC-HC. Мутация S49A скрыта в середине высоко гидрофобного кластера боковых цепей, что может объяснить, почему аланин в этой позиции предпочтительнее, чем серин. Таким образом, интересно, что высокая аффинность HzTFPI4F36 получена как сочетание мутаций, которые улучшают прямое взаимодействие антигена и мутаций, удаленных от антиген-связывающей области, которые стабилизируют антитело.

В заключение, HzTFPI4F36 имеет аффинность (K_D) ~25 пкМ и содержит 35 аминокислотных остатков, происходящих из последовательности мышиного антитела, соответствующих 5,2% от общего количества остатков в антителе.

Аминокислотные последовательности для вариабельной легкой (VL) области, вариабельной тяжелой (VH) области, легкой цепи и тяжелой цепи выбранной гуманизированной конструкции, HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021), показаны в SEQ ID №№15, 18, 21 и 24, соответственно.

Анализы эффективности in vitro

Анти-TFPI4P36-антитело способно нейтрализовать TFPI-опосредованное ингибирование фактора свертывания Ха (FXa) и комплекса тканевого фактора (TF) и фактора VIIa (FVIIa). Активности мышиного и гуманизированного вариантов антитела TFPI4F36 измеряли в анализе протромбинового времени с разведенным тромбопластином (dPT-анализ). Анализ dPT использовали для измерения прокоагулянтной активности анти-TFPI антител. Увеличение концентраций анти-TFPI антител в плазме сокращает время свертывания dPT.

Пример 4: Очистка, кристаллизация и структура Fab-фрагмента MuTFPI4F36 (Fab) и второго домена Кунитца (К2) человеческого ингибитора пути тканевого Фактора (TFPI)

Фрагмент TFPI, включая его второй домен Кунитца (К2) и С-концевую Hise-метку (SEQ ID №2), совместно кристаллизовали с Fab-фрагментом (Fab) MuTFPI4F36. Структуру комплекса определяли способом рентгеновской кристаллографии. Было установлено, что К2-связывающий эпитоп содержит остатки E10, Е11, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 и L50. Было установлено, что паратоп в Fab содержит остатки Е31, S32, D33, Y37, А96, Т97, Н98 и F99 из легкой цепи MuTFPI4F36 (SEQ ID №4) и остатки N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, Р61, D62, Q65, Y102, D103 и D106 из тяжелой цепи MuTFPI4F36 (SEQ ID №8).

Материалы и способы

Аналитическая эксклюзионная хроматография (хроматография, основанная на разделении молекул по размеру)

Аналитическую эксклюзионную хроматографию (SEC) проводили с использованием колонки Biosep S-3000 (300×7,80 мм) (Phenomenex), элюировали в PBS-буфере (10 мМ фосфат, 150 мМ NaCl, 3 мМ KCl, рН 7,5) со скоростью потока 0,8 мл/мин.

Получение и очистка Fab/K2-комплекса.

Комплекс Fab/K2 получали путем смешивания Fab (0,27 мг/мл в PBS буфере, рН 7,4) и К2 (0,29 мг/мл в PBS, рН 7,4) в молярном соотношении 1:1,5 (5,4 мг Fab и 1,4 мг К2). Комплекс концентрировали на центробежном фильтрующем устройстве (Amicon, граница отсечки по молекулярному весу задерживаемых компонентов 10 кДа) до концентрации ~6,7 мг/мл. Для удаления лишнего К2 концентрированный образец подвергали гель-фильтрации на колонке Superdex 75 (CV300), элюировали в PBS-буфере, рН 7,4 со скоростью потока 1 мл/мин. Фракции, содержащие комплекс Fab/K2, объединяли и концентрировали до концентрации белка 9,2 мг/мл. Этот раствор использовали для кристаллизации.

Кристаллизация комплекса Fab/K2.

Комплекс Fab/K2 кристаллизовали в виде стержней, используя методику висячей капли, с помощью раствора осадителя, содержащего 0,2 М раствор трехосновного цитрата калия (рН 8,0) и 20% (w/v) ПЭГ 3350.

Определение кристаллической структуры.

Структуру комплекса Fab/K2 определяли способом молекулярной замены с помощью PDB-структур 1F8T и 1TFX в качестве матриц для Fab- и K2-молекул, соответственно.

Результаты

Комплекс Fab и K2 получали путем добавления избытка К2 к раствору Fab. На фиг.6 показано образование комплекса, контролируемое аналитической эксклюзионной хроматографией (SEC, size exclusion chromatography). Этот способ отделяет молекулы в зависимости от их молекулярного размера от более крупных частиц, элюируя частицы тем раньше, чем они меньше. Пики, соответствующие К2 и Fab, хорошо разделяются благодаря большой разнице в молекулярной массе (MW ~8 кДа и 48 кДа, соответственно). Добавление К2 к раствору Fab привело к ожидаемому незначительному сдвигу позиции пика по отношению к более короткому времени удерживания. Комплекс легко отделяется и получается в чистом виде путем отделения избытка К2 с помощью препаративной SEC.

Условия кристаллизации комплекса Fab/K2 проверяли с помощью нескольких коммерческих экранов кристаллизации. Методика висячей капли позволяет получить кристаллы в виде стержней, подходящие для рентгеноструктурного анализа монокристалла, и структуру определяют способом молекулярной замены с использованием структур, хранящихся в PDB в качестве матриц. На фиг.7 показана общая структура комплекса Fab/K2. Показаны легкая и тяжелая цепи, составляющие Fab-молекулу, и продемонстрирована ожидаемая иммуноглобулиновая β-сэндвич-укладка, характерная для молекул антитела. Также показаны CDR-петли, образующие контакт с антигеном и определяющие специфичность и аффинность антитела.

Антиген, К2, демонстрирует характерную единую антипараллельную β-складчатость (β1 (I20-N26) и β2 (Q31-Y37)) и N-концевую α-спираль (α1, L50-I56), что определяет укладку Кунитца (фиг.8). Присутствует также дополнительная 3₁₀-спираль около N-конца (α0, D5-F8), затем петля 1 (L1, L9-Y19), ведущая к β1, которая связана с β2 через короткую петлю (Lβ, N27-K30). В С-концевом сегменте петля 2 (L2, G38-T49) связывает β2 с α1. Наконец, характерные три дисульфидные связи (С7-С57, С16-С40 и С33-С53) связывают α0 с α1, L1 с L2 и β2 с α1, соответственно.

Две структуры К2 сохранены во всемирной базе данных белков (PDB). Одна структура, 1ADZ, определена с помощью ЯМР-спектроскопии и представляет собой свободную растворенную структуру, в то время как другая, 1TFX, определена способом рентгеновской кристаллографии и представляет собой К2 в комплексе со свиным трипсином. На фиг.9 показано структурное наложение К2, представленное 1ADZ, 1TFX и К2 молекулой в комплексе с Fab. Следы основы очень похожи во всех трех структурах, подтверждая, что укладка Кунитца с его тремя стабилизирующими дисульфидными связями довольно жесткая.

Описание К2-связываюшего эпитопа MuTFPI4F36

Связывающий эпитоп для антигена К2, определяемый как остатки в К2, содержащие по меньшей мере один тяжелый атом боковой цепи, расположенный на расстоянии 4 Å или менее от тяжелого атома в Fab, содержит остатки E10, Е11, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, Q28, Q31, E33, R34, F35, K36 и L50 (фиг.10). Контактирующие остатки в К2 находятся в L1 (E10, Е11, Р13, R17, Y19), в β-складчатой структуре (Т21, Y23, Q31, E33, R34, F35, K36) и связывающей петле, Lβ (Q28) и, наконец, единственный в α1 (L50). На фиг.10 показан связывающий эпитоп, отмеченный и в три 3D-структуре К2, и в первичной аминокислотной последовательности.

Описание паратопа MuTFPI4F36

Паратоп во фрагменте MuTFPI4F36 Fab определяли по той же рентгеновской структуре комплекса MuTFPI4F36 Fab и К2-домена TFPI. Паратоп определяется как остатки в MuTFPI4F36 Fab, имеющие тяжелый атом на расстоянии менее 4 Å от тяжелого атома в К2-домене. Контактные остатки в легкой цепи находятся в позиции остатков Е31, S32, D33, Y37, А96, Т97, Н98 и F99 из SEQ ID №4. Контактные остатки в легкой цепи находятся в позиции остатков N31, R53, S54, S56, Y57, Y59, F60, Р61, D62, Q65, Y102, D103 и D106 из SEQ ID №8. Расположение паратопа показано на фиг.3.

Пример 5: Структура комплекса K2/HzTFPI4F36 Fab

Используя методологию, аналогичную описанной для определения трехмерной структуры связи MuTFPI4F36 Fab с К2, была определена структура комплекса Fab-фрагмента из гуманизированного антитела, HzTFPI4F36, и К2. Как и ожидалось, было выявлено, что Fab из HzTFPI4F36 связывается с той же областью на К2, что и мышиный Fab, из которого он был получен. Общее сходство структур двух комплексов видно на фиг.11, где лентовидные следы матрицы накладываются на комплексы K2/TFPI4F36 Fab и K2/HzTFPI4F36 Fab. Было установлено, что эпитоп (определяемый по границе отсечки 4 Å) на К2 для HzTFPI4F36 содержит остатки E10, Е11, D12, Р13, R17, Y19, Т21, Y23, F24, N26, Q28, Q31, С32, E33, R34, K36 и L50. По сравнению со структурой K2/MuTFPI4F36 Fab мышиного происхождения D12, F24, N26 и С32 находятся в гуманизированном комплексе K2/HzTFPI4F36 в пределах границы отсечки 4 Å, в то время как F35 находится снаружи. Это отражает незначительные различия в ориентации боковой цепи в пределах связывающих поверхностей комплексов K2/MuTFPI4F36 Fab и K2/HzTFPI4F36 Fab, несмотря на то, что CDR-области MuTFPI4F36 и HzTFPI4F36 являются идентичными.

Примеры 6-8

Функцию HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021) сравнивали с функцией всех (четырех) коммерчески доступных моноклональных антител, о некоторых из которых указано, что они связываются с К2-доменом TFPI; некоторые из них не были описаны в отношении связывания.

Пример 6: Анализ нейтрализации TFPI: ингибирование FXa

Используемыми в анализе материалами был буфер BSA (50 мМ Hepes; 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl₂, 0,1 мг/мл BSA, pH 7,4) и реагенты, указанные в таблице 5.

Таблица 5 Используемые материалы Реагент Компания/Ссылка Концентрация в стоковом растворе Конечная концентрация (разведение в буфере BSA) Человеческий FXa Enzyme Research Laboratory 21,7 мкМ 5 нМ Человеческий TFPI Reference: Pedersen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, p.16786-16793 Лиофилизированный в 10 мМ глицилглицине, 100 мМ NaCl; 165 мМ маннитоловом буфере, pH 7,0. Восстановленный в воде. 6 нМ МКА TFPI4F36 Current invention   5-150 нМ МКА 0281 Ab systems     МКА 4904 AD     МКА 2974 R&D systems     МКА 29741 R&D systems     S2765 Chromogenix 20 мМ 1 мМ

Способ:

Рекомбинантный человеческий TFPI полной длины (конечная концентрация 6 нМ) смешивали в буфере BSA с повышающимися концентрациями МКА, представляющего интерес (конечная концентрация: 5-150 нМ), в течение 30 мин. Добавляли FXa и инкубировали смесь еще в течение 30 мин. Добавляли хромогенный субстрат S2765 и измеряли абсорбцию при 405 нм в течение 15 мин на Spectramax. 100% активность представляла собой активность FXa без добавления TFPI.

Таблица 6 Нейтрализация TFPI-ингибирования FXa Компания ID МКА IC₅₀ нМ % нейтрализации TFPI при 150 нМ Данное изобретение HzTFPI4F36 (МКА TFPI2021) 12,6 100% AbNova МКА 0281 Нет данных <10% American Diagnotica МКА 4904 Нет данных <10% R&Dsystems МКА 2974 29,4 90% R&Dsystems МКА 29741 Нет данных <10%

Заключение:

При 150 нМ HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021) полностью нейтрализовало TFPI-ингибирование FXa. С МКА 0281, МКА 4904 и МКА 29741 не было обнаружено почти никакой активности.

Пример 7: Анализ нейтрализации TFPI: ингибирование FVIIa/TF/FXA

Используемыми в анализе материалами был буфер BSA (50 мМ Hepes; 0,1 М NaCl, 5 мМ CaCl2, 0,1 мг/мл BSA, рН 7,4), ЭДТА: 50 мМ и реагенты, указанные в таблице 7.

Таблица 7 Реагент
  Компания/Ссылка Концентрация в стоковом растворе Конечная концентрация разведение в буфере BSA) МКА 2974 МКА TFPI4F36 R&D systems данное изобретение 3330 нМ 75300 нМ Варьирует (5-150 нМ) NovoSeven Novo Nordisk 27 мкМ 1 пкМ Носители HTI Фосфолипидные носители кат. № PCPS-02 № W1115- 75% PC - 25% PS 2,0 мМ 10 мкМ S-2765 Chromogenix 35 мМ 0,5 мМ FX American Diagnostica inc. Бычий фактор Х Продукт №510 Лот №050920 растворен 50% глицерин/вода 165 мкМ 160 нМ TFPI Reference: Pedersen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, p.16786-16793 18,6 мкМ 1 нМ TF (Innovin) Dade Behring#2010-01-11 #536975 vial diss. in 10 ml H₂O 2,8 нМ (6 нМ) 1 пкМ

Способ:

Добавляли все компоненты в конечных концентрациях, указанных в таблице. В микротитровальные лунки добавляли 25 мкл FX, 25 мкл TFPI-MKA в различных концентрациях, 25 мкл человеческого TFPI, 25 мкл FVIIa-TF (innovin). Инкубировали в течение 40 мин при комнатной температуре. Добавляли 50 мкл ЭДТА, затем 50 мкл S-2765. Смешивали и анализировали планшет в течение 15 мин при 405 нм в Spectramax. 100% активность представляла собой активность FVIIa/TF/FX, полученная в отсутствие TFPI.

Таблица 8 Нейтрализация TFPI-ингибирования FVIIa/TF/FX Компания ID МКА IC₅₀ нМ % нейтрализации TFPI при 150 нМ Данное изобретение HzTFPI4F36 (МКА TFPI2021) 3,8 нМ 100% AbNova MKA 0281 Нет данных Нет данных American Diagnotica MKA 4904 Нет данных Нет данных R&Dsystems MKA 2974 Нет данных 53% R&Dsystems MKA 29741 Нет данных Нет данных

Заключение:

В концентрации 150 нМ MKA TFPI2021 полностью нейтрализовало TFPI-ингибирование FXa. MKA 2974 также достигает насыщения, но не полностью нейтрализует TFPI (53% нейтрализация).

Пример 8: Анализ взаимодействия при связывании

Используемые материалы указаны в таблице 9.

Таблица 9 Реагент Компания TFPI Лиофилизированный в 10 мМ глицилглицине, 100 мМ NaCl; 165 мМ маннитоловом буфере, рН 7,0. Восстановленный в воде. MKA TFPI2021 Данное изобретение MKA 0281 Ab systems MKA 4904 AD MKA 2974 R&D systems MKA 29741 R&D systems Все другие реагенты Biacore

Способ:

Анализ взаимодействия при связывании проводили путем поверхностного плазменного резонанса на инструменте Biacore Т-100. Захват соотвествующего моноклонального антитела при фиксированной концентрации получали путем прямой иммобилизации на чипе СМ5 МКА до уровня 500-1000 RU в 10 мМ растворе ацетата натрия, рН 4,5-5,0. Четырехкратные разведения рекомбинантного человеческого TFPI полной длины или человеческого TFPI короткой формы (1-161 аминокислотные остатки) от 200 нМ до 0,2 нМ проверяли на связывание с иммобилизованным МКА. Электродный буфер и буфер для разведения: 10 мМ HEPES, 150 мМ, 0,005% р20, рН 7,4. Регенерацию проводили с помощью 10 мМ глицина, рН 1,7. Определение кинетических констант и констант связывания (k_on, k_off, K_D) получали, предполагая 1:1 взаимодействие TFPI и антитела, представляющего интерес, с использованием программного обеспечения для оценки Biacore T100. Результаты представлены в таблице 10. Конкуренцию различных МКА при связывании с TFPI для МКА TFPI2021 («МКА 2021», HzTFPI4F36) получали путем иммобилизации МКА TFPI2021 до 5000 RU на чипе СМ5 с последующим связыванием 50 нМ TFPI, и последующего изменения различных концентраций моноклональных антител (2974, 0281, 4904, 29741), подлежащих конкурентному анализу. Результаты представлены в таблице 11. Регенерацию чипа проводили с помощью 10 мМ глицина, рН 1,7.

Таблица 10 Анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Связывание с человеческим TFPI полной длины. Кинетические константы и константы связывания. (Производитель ID МКА ka (1/Mc) kd (1/c) K_D (М) K_D нМ Данное изобретение МКА 2021 2,39Е+06 3,58Е-05 1,50Е-11 0,015 AbNova МКА 0281 3,99Е+05 0,001436 3,60Е-09 3,60 American Diagnotica МКА 4904 1,42Е+05 00,1294 9,14Е-09 9,14 R&Dsystems МКА 2974 1,39Е+06 0,001202 8,64Е-10 0,864 R&Dsystems МКА 29741 9,51Е+05 0,003165 3,33Е-09 3,33

Таблица 11 SPR-анализ. Константы связывания для связывания с человеческим TFPI полной длины и TFPI₁₆₁(K1- и K2-домены). Конкуренция с МКА TFPI2021. Производитель 10 МКА K_D (М) TFPI K_D (М) TFPI₁₆₁ Сравнение с МКА 4F36 Данное изобретение МКА TFPI2021 1,50Е-11 4,55Е-11 Да AbNova MKA 0281 3,60E-09 7,28E-09 Нет American Diagnotica MKA 4904 9,14E-09 Нет связывания Нет R&Dsystems MKA 2974 8,64E-10 3,12E-09 Да R&Dsystems MKA 29741 3,33E-09 Нет связывания Нет

Заключение

MKA TFPI2021 связывается с TFPI с более высокой аффинностью, чем любое из других тестируемых моноклональных антител (K_D 15 часов). Только MKA 2974 конкурирует за связывание того же сайта, что и MKA TFPI4F36.

Пример 9: Нейтрализация TFPI на эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC)

Эндотелиальные клетки конститутивно экспрессируют TFPI в форме, которая прикреплена к поверхности клетки через гликозилфосфатидилинозитоловый (GPI) якорь. GPI-заякоренный TFPI специфически ингибирует TF-опосредованную активность, когда TF экспрессируется на одной и той же клетке с TFPI. Чтобы продемонстрировать, что HzTFPI4F36 (MKA TFPI2021) нейтрализует ингибирование путем клеточного связывания TFPI гораздо более эффективно, чем MKA 2974, мы применяли эндотелиальные клетки пупочной вены человека HUVEC, а для того, чтобы индуцировать экспрессию TF, эти клетки стимулировали ФНОα (Sigma RBI) и IL1β (Roche) до тестирования FVIIa/TF-катализированной активации FX.

HUVEC-клетки культивировали для слияния в 96-луночных планшетах в среде ЕВМ-2 (Clonetics) и стимулировали 20 нг/мл ФНОα и 20 нг/мл IL1β в течение 2 часов перед тестированием. Тестирование проводили в 25 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 3,5 мМ KCl, 5 мМ CaCl₂, 1 мг/мл BSA (0,1%), рН 7,4, и затем проводили активацию FX в присутствии антитела (0-20 нМ) и с добавлением 50 пкМ FVIIa и 50 нМ FX. Образование FXa измеряли с 0,6 мМ хромогенным субстратом, S-2765 (Chromogenix), и калибровали по отношению к кривой стандарта FXa.

На фиг.12 показаны результаты, что ингибирование связанного с клеткой TFPI было отменено 0-20 нМ HzTFPI4F36 или MKA 2974. TF/FVIIa-опосредованную активацию FX стимулировали HzTFPI4F36 с половиной концентрации максимального эффекта (ЕС50 ~1 нМ), тогда как стимуляция образования FXa почти не наблюдалась с МКА 2974 при 20 нм.

Таким образом, этот пример показывает, что HzTFPI4F36, в отличие от МКА 2974, эффективно нейтрализует ингибирование TF/FVIIa-опосредованной активации FX связанным с клеткой TFPI.

Пример 10: Нейтрализация TFPI-ингибирования активности TF/FVII на человеческих клетках карциномы молочной железы MDA-MB 231.

Клетки MDA-MB 231 конститутивно экспрессируют высокий уровень TF и незначительные количества TFPI на поверхности. Активация FX, опосредованная TF/FVIIa клеточной поверхности, может быть ингибирована экзогенно добавленным TFPI. Чтобы продемонстрировать, что HzTFPI4F36 нейтрализует этот тип TFPI-ингибирования гораздо более эффективно, чем МКА 2974, мы применяли клетки MDA-MB 231 и тестировали способность различных концентраций антитела отменять TFPI-ингибирование FVIIa/TF-катализируемой активации FX.

Клетки MDA-MB 231 культивировали для слияния в 96-луночных планшетах в среде DMEM Gibco кат. №31966-021 с добавлением 10% FCS и 1% P/S. Тестирование проводили в 25 мМ HEPES, 137 мМ NaCl, 3,5 мМ KCl, 5 мМ CaCl₂, 1 мг/мл BSA (0,1%), рН 7,4, и затем проводили активацию FX в присутствии антитела (0-20 нМ) и с добавлением 2,5 нМ человеческого рекомбинантного TFPI полной длины, 100 пкМ FVIIa и 50 нМ FX. Образование FXa измеряли с 0,6 мМ хромогенным субстратом, S-2765 (Chromogenix), и калибровали по отношению к кривой стандарта FXa. Абсорбцию при длине волны 405 нм измеряли непрерывно, и активность FXa определяли путем измерения наклона кривой процесса через 15 минут после начала реакции.

На фиг.13 показаны результаты, что ингибирование TFPI было отменено 0-20 нМ HzTFPI4F36 или МКА 2974. TF/FVIIa-опосредованную активацию FX стимулировали HzTFPI4F36 с половиной концентрации максимального эффекта (ЕС50 ~2 нМ), тогда как стимуляция образования FXa была получена при значительно более высокой концентрации МКА 2974 (ЕС50>20 нм).

Пример 11: Картирование эпитопов связывания анти-TFPI-моноклональных антител, HzTFPI4F36 и МКА 2974, с помощью иммуноферментного анализа

Эпитоп связывания для HzTFPI4F36 на домене Кунитца 2 (К2) TFPI картировали путем раскрытия кристаллической структуры комплекса TFPI-K2/HzTFPI4F36. Влияние мутации одного аминокислотного остатка в TFPI внутри (E10, R17 и Y19) и вне (D5) эпитопа связывания для HzTFPI4F36 на аффинность связывания с HzTFPI4F36 и МКА 2974 (R&Dsystems) анализировали с помощью ИФА. Варианты TFPI экспрессировали в клетках HEK293-F и проводили ИФА с использованием кондиционированной среды от клеточных культур.

С помощью ИФА оценивали концентрации мутантов TFPI-WT и TFPI, которые связывают TFPI K1 (МКА 4903, American Diagnostica) и K3 (МКА 4F110, собственной разработки) и, следовательно, не влияют на мутации. Влияние мутаций на связывание с HzTFPI4F36 анализировали с помощью МКА 4903 и HzTFPI4F36 в ИФА. Влияние на связывание МКА 2974 определяли с помощью ИФА с МКА 2974 и МКА 4F110.

Влияние мутаций на связывание TFPI-Кунитца 2 с HzTFPI4F36 и МКА 2974, соответственно, рассчитано относительно TFPI-WT (100% связывание) и показано на фиг.14. Количества корректировали по различиям в уровнях экспрессии.

Заключение:

Аланиновая мутация трех аминокислотных остатков в эпитопе связывания для HzTFPI4F36 привела к снижению связывания с HzTFPI4F36, тогда как аланиновая замена остатка, находящегося за пределами эпитопа (TFPI-D5A), не имела эффекта. Только один из четырех аланиновых мутантов, TFPI-Y19A, сократил связывание с МКА 2974.

В заключение, HzTFPI4F36 и МКА 2974 имеют различные, но перекрывающиеся эпитопы связывания, расположенные на TFPI-Кунитца 2.

Пример 12: Исследования in vivo

У кроликов вызывали временную гемофилию путем внутривенного введения 2000 RBU/кг моноклональных анти-FVIII-антител. Через 10 минут кроликам вводили 12000 ЕД/кг анти-TFPI-антитела (4F36; 1,93 мг/кг). Кровотечение из кутикулы вызывали через 45 минут после введения анти-FVIII-антитела.

Антитело 4F36 вызвало значительное сокращение времени кровотечения из кутикулы (фиг.15). Введение антитела 4F36 не приводило к значительному снижению числа тромбоцитов (фиг.18).

Проводили аналогичный эксперимент, в котором три группы по восемь временно гемофильных кроликов получали либо изотипическое контрольное антитело (группа отрицательного контроля), 2 мг/кг анти-TFPI (МКА 4F36), либо 9 мг/кг NovoSeven (группа положительного контроля) через 5 минут после начала кровотечения из кутикулы. Результаты показаны на фиг.16: введение МКА 4F36 привело к значительному снижению потери крови (примерно 85%) у всех реципиентов, демонстрируя, что МКА 4F36 может быть использовано «по требованию».

Пример 13: Оценка отношения доза-эффект у кролика

Отношение доза-эффект гуманизированного МКА HzTFPI4F36 рассматривали на модели кролика с гемофилией. У кроликов вызывали временную гемофилию путем внутривенного введения моноклонального анти-FVIII-антитела. Через 10 минут кроликам вводили 0,5, 1, 2 мг/кг HzTFPI4F36 или изотипического контрольного антитела. Еще через 35 минут вызывали кровотечение из кутикулы, за которым следовал 60-минутный период наблюдения. HzTFPI4F36 значительно и в зависимости от дозы уменьшало время кровотечения, а также потерю крови при увеличении дозы от 0,5 до 2 мг/кг (фиг.17). Таким образом, значительное сокращение времени кровотечения и кровопотери было достигнуто с 1 мг/кг HzTFPI4F36, что соответствует плазменной концентрации 18780 нг/мл HzTFPI4F36. Нормализация кровотечения была достигнута с 2 мг/кг, что соответствует плазменной концентрации 30980 нг/мл HzTFPI4F36.

Эти данные свидетельствуют о том, что «эффективная концентрация» HzTFPI4F36, т.е. концентрация в плазме крови, необходимая для нормализации в данной модели, находится в диапазоне от 18780 до 30980 нг/мл.

Пример 14: PK/PD у кроликов - «Длительность действия»

Было выполнено фармакокинетическое изучение HzTFPI4F36 у кроликов, которым вводили 20 мг/кг. В заранее определенные моменты времени в период исследования у кроликов были взяты образцы крови для получения фармакокинетических профилей путем измерения в ИФА свободного HzTFPI4F36 (показано на фиг.3 ниже). Изучение влияния проводили на 4 день (96 часов), 7 день (168 часов) и 10 день (240 часов) после введения, используя модель кровотечения из кутикулы у кроликов с временной гемофилией, моменты времени указаны на фиг 19.

Фармакокинетический профиль является двухфазным, свидетельствуя об опосредованном мишенью клиренсе. Таким образом, над изгибом кривой представлен избыток свободного МКА (МКА_{свободное}>TFPI_общий), под изгибом: МКА_{свободное}<TFPI_общий. При хорошем соответствии с фармакокинетическим профилем и время кровотечения, и кровопотеря были значительно уменьшены как на 4, так и на 7 день после введения внутривенно 20 мг/кг HzTFPI4F36, в то время как после 10 дня существенного влияния не наблюдалось (фиг.20).

Эти данные подтверждают, что эффективная концентрация HzTFPI4F36 в плазме на модели кровотечения из кутикулы у гемофильных кроликов находится между 18780 и 30980 нг/мл, что близко к пределу насыщения TFPI (кривая изгиба). Соответственно, однократная внутривенная доза 20 мг/кг HzTFPI4F36 уменьшает кровотечение из кутикулы по меньшей мере на 7 дней, что соответствует периоду времени, когда концентрация в плазме крови выше «эффективной концентрации»

Пример 15: Фармакокинетическая модель, основанная на данных ФК у обезьян

Фармакокинетическую оценку проводили на основе фармакокинетического исследования на обезьянах, которым вводили одно- и многократные дозы (фиг.21). Уровни доз находились в диапазоне от 2 до 200 мг/кг.

ФК-профиль у обезьяны (20 мг/кг, верхняя панель) похож на профиль у кролика, указывая на наличие аналогичного распределения растворимого и связанного с эндотелием TFPI. Таким образом, эти данные показывают, что данные об эффекте у кролика могут быть использованы для прогнозирования диапазона эффекта у обезьяны. Кроме того, аффинность HzTFPI4F36 к TFPI человека, обезьяны и кролика аналогична (тот же эпитоп), и аналогичное распределение TFPI в тканях этих трех видов позволяет прогнозировать дозу у обезьяны и человека.

Пример 16: Моделирование

На основе модели, представленной выше, стало возможно провести серию модельных экспериментов. Главной целью моделирования было описание оптимального режима дозирования с несколькими установленными дозами. Концентрация мишени (TFPI) была не известна, но данные о влиянии у кролика, приведенные выше, позволяют предположить, что если мишень находится вблизи уровня насыщения 30000 нг/мл, то на модели кровотечения получается полный эффект. Таким образом, главной целью моделирования была оценка того, какие уровни доз в течение определенного периода времени могут привести к полному насыщению. На фиг.22 показано моделирование с подкожным введением 1 мг/кг. На фиг.23 показано моделирование с внутривенным введением 15 мг/кг HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021) раз в три недели. На фиг.24 показано моделирование с внутривенным введением 20 мг/кг HzTFPI4F36 (МКА TFPI 2021) раз в две недели.

Таким образом, исходя из описанного выше моделирования, для человека можно сделать следующее прогнозирование режима дозирования:

Таблица 12 Режим дозирования Тип дозы Доза Режим дозирования Подкожное введение 1 мг/кг Раз в два дня Внутривенное введение 10-20 мг/кг Раз в 2-4 недели

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Предложено моноклональное антитело, которое специфически связывается со вторым доменом Кунитца ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), которое характеризуется тем, что содержит 6 CDR. Описаны: экспрессирующая указанное антитело клетка и применение антитела для лечения субъекта с коагулопатией. Использование изобретения обеспечивает новые антитела, которые могут найти применение в терапии для уменьшения времени свертывания крови. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 24 ил., 12 табл., 16 пр.

1. Моноклональное антитело, которое способно специфически связывать второй домен Кунитца (К2) ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), где тяжелая цепь указанного антитела включает:
-CDR1-последовательность аминокислот с 31 по 35 (NYAMS) из SEQ ID № 18; и
-CDR2-последовательность аминокислот с 50 по 66 (TISRSGSYSYFPDSVQG) из SEQ ID №18; и
-CDR3-последовательность аминокислот с 99 по 110 (LGGYDEGDAMDS) из SEQ ID №18;
и где легкая цепь указанного антитела включает:
-CDR1-последовательность аминокислот с 24 по 39 (KSSQSLLESDGKTYLN) из SEQ ID №15; и
-CDR2-последовательность аминокислот с 55 по 61 (LVSILDS) из SEQ ID № 15; и
-CDR3-последовательность аминокислот с 94 по 102 (LQATHFPQT) из SEQ ID №15.

2. Моноклональное антитело по п. 1, где легкая цепь указанного антитела включает SEQ ID №15, а тяжелая цепь указанного антитела включает SEQ ID №18.

3. Моноклональное антитело по п. 1, где легкая цепь указанного антитела включает SEQ ID №21, а тяжелая цепь указанного антитела включает SEQ ID №24.

4. Эукариотическая клетка, которая экспрессирует моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп. 1-3.

5. Применение моноклонального антитела по любому из пп. 1-3 для лечения субъекта с коагулопатией.

6. Применение по п. 5, где указанный субъект имеет любую врожденную, приобретенную и/или ятрогенную коагулопатию, такую как гемофилия А, с или без ингибиторов, и гемофилия В, с или без ингибиторов.