ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS FOETIDUS 379-К - ПРОДУЦЕНТ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 C12N9/24 C12N9/42 C12R1/66 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно микробиологической промышленности, и касается создания нового штамма гриба Aspergillus foetidus - продуцента пектолитических ферментов, применяемых в пищевой промышленности для осветления соков, гидролиза пектинсодержащего сырья, в сельском хозяйстве и других отраслях АПК, где требуется расщепление пектиновых веществ.

Штамм получен селекцией с использованием эффективных методов мутагенеза из известного штамма Aspergillus foetidus 37 (ЦMПM-F-270), применяемого для твердофазного культивирования при производстве пектиназ. Изобретение обеспечивает получение нового штамма - продуцента пектолитических ферментов для глубинного культивирования, и получение комплексного ферментного препарата пектолитического действия.

Пектолитические ферменты имеют большое промышленное значение в различных отраслях биотехнологии: при получении пектинов; для интенсификации производства соков из плодово-ягодного сырья и осветления вин; для получения пищевых красителей и таннинов; при обработке текстильных волокон (Микробные ферменты и биотехнология. Под ред. В.М.Фогарти. - М.: Агропромиздат, 1986). В связи с этим, селекция новых штаммов - продуцентов пектиназ - актуальна.

Известны штаммы - продуценты пектолитических ферментов из рода Aspergillus - Aspergillus awamori 16, Aspergillus foetidus 7 (И.М.Грачева, А.Ю.Кривова, Технология ферментных препаратов. - М.: «Элевар», 2000). Недостатками этих продуцентов являются их низкая продуктивность, недостаточно изученный комплекс ферментов, синтезируемых данными штаммами.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus foetidus 37, регистрационный номер ЦМПМ-F-270 (Патент СССР №1206303, C12N 9/14, 1986). Недостатком этого штамма является то, что он был создан для культивирования твердофазным методом, и поэтому при глубинном способе он синтезирует низкий уровень активности пектолитических ферментов и других минорных ферментов.

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является создание штамма гриба Aspergillus foetidus - продуцента пектолитических ферментов с широким комплексом сопутствующих ферментов, для глубинного культивирования.

Технический результат, получаемый от создания и использования данного нового селекционированного штамма Aspergillus foetidus 379-K, заключается в получении доминирующих пектолитических ферментов с высоким уровнем активности эндополигалактуроназы в составе комплекса и сопуствующих β-глюканаз, ксиланаз, целлюлаз, маннаназ и хитиназ при глубинном способе культивирования для использования в различных отраслях АПК.

Задача решается созданием нового штамма из известного штамма Aspergillus foetidus 37 с использованием генетических и селекционных методов.

В результате многоступенчатой селекции и мутагенеза после 3-кратного УФ-облучения и неоднократного отбора был получен штамм Aspergillus foetidus 379-K - продуцент пектиназ.

Проводили сравнительную характеристику уровня активности синтезируемых ферментов заявляемым мутантным штаммом и ранее известным штаммом. Активности ферментов определяли методами, описанными в ГОСТе (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса). Сравнительные показатели уровней активности ферментов в культуральной жидкости штамма Aspergillus foetidus 379-K с прототипом представлены в таблице 1.

Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый активный штамм Aspergillus foetidus 379-K, обладающий высоким уровнем синтеза пектиназ, в том числе полигалактуроназы, уровень активности которой, при культивировании глубинным способом, превышает в 6 раз уровень активности известного штамма, что позволяет повысить эффективность технологических процессов получения комплексного ферментного препарата пектолитического действия и применения его в производстве плодово-ягодных соков и морсов.

Кроме того, уровень активности β-глюканазы, маннаназы, ксиланазы и хитиназы существенно превышает уровень активности в культуральной жидкости известного штамма. Наличие высокого уровня активности указанных ферментов повышает эффективность использования ферментного препарата, полученного на основе заявленного штамма Aspergillus foetidus 379-K при гидролизе растительных и микробных субстратов в пищевой промышленности.

Штамм Aspergillus foetidus 379-K депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ генетики 25 июня 2007 года под коллекционным номером ВКПМ F-962.

Штамм Aspergillus foetidus 379-K имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

По морфологическим признакам культура представляет сильно ветвящийся мицелий, разделенный перегородками. Конидии, образуемые микромицетом, гладкие. Форма конидий круглая, редко встречается овальной формы. Цвет конидий темно- коричневый, почти черный, но из-за обильного образования воздушного мицелия имеют более серый оттенок. Колонии выпуклые с небольшой возвышенностью в центре. Обратная сторона колонии светло-коричневая. Поверхность колонии слегка складчатая.

На среде сусло-агар колонии круглые, к 5 суткам достигают 35-37 мм, имеют мозговидную складчатость. Центральная зона колонии - зона обильного спороношения - диаметром 10-12 мм черного цвета с темно-оливковым оттенком и обильным образованием воздушного мицелия. Край колонии ровный. Обратная сторона колонии светло-коричневого цвета.

На среде цитрусового пектина с агаром размер колонии достигает 15-17 мм. Колонии плоские. Центральная зона колонии - зона обильного спороношения - диаметром 3-3,5 мм темно-серого цвета.

Физиолого-биохимическая характеристика.

Ассимилирует нитратные и аммонийные соли. Культура слабо усваивает глюкозу, мальтозу и сахарозу.

Дыхание аэробное. Оптимальная температура роста 28-32°С; оптимальное значение рН для роста и биосинтеза гриба 5,3-5,5. Рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,7 до 3,5. Патогенными свойствами не обладает.

Штамм Aspergillus foetidus 379-K использовали для получения пектолитических ферментов.

Для ферментативной обработки плодово-ягодного сырья может быть использован концентрированный ферментный препарат, полученный осаждением этанолом из культуральной жидкости грибов Aspergillus foetidus 379-K и Aspergillus foetidus 37 в соотношении 1:3. Сравнительная характеристика концентрированных ферментных препаратов, полученных на основе штаммов Aspergillus foetidus 379-K и известного Aspergillus foetidus 37, приведена в таблице 2.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus foetidus 379-K культивируют на питательной среде следующего состава, %: неосветленные свекловичные волокна - 3,0; пшеничные отруби - 0,5; (NH₄)₂SO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄ - 0,1; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Ферментационную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 100 см³ питательной среды на качалке 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 96 часов. Активность пектолитических ферментов в культуральной жидкости гриба Aspergillus foetidus 379-К составляет: ПкС - 2,6 ед/см³; Эндо-ПгС - 1,35 ед/см³; ПэС - 0,96 ед/см³.

Таблица 1 Сравнительные показатели активностей ферментов в культуральной жидкости грибов Aspergillus foetidus 37 и 379-K. Активности ферментов Aspergillus foetidus   Штамм 37 Штамм 379-K Общая пектолитическая, ед. ПкС/г 0,4 2,6 Эндополигалактуроназная, ед. Эндо-ПгС/г 0,28 1,85 Пектинэстеразная, ед. ПэС/г 0,45 0,96 В-Глюканазная, ед. β-ГкС/г 0,368 2,44 Целлюлолитическая, ед. ЦС/г 0,141 0,92 Ксиланазная, ед. КС/г 0,083 0,54 Маннаназная, ед. МС/г следы 0,18 Хитиназная, ед. ХС/г следы 0,014

Таблица 2 Сравнительная характеристика концентрированных ферментных препаратов пектолитического действия, полученных осаждением спиртом из культуральной жидкости Aspergillus foetidus 37 и 379-K. Активности ферментов Aspergillus foetidus   Штамм 37 Штамм 379-K Общая пектолитическая, ед. ПкС/г 83,6 397,0 Эндополигалактуроназная, 66,8 245,5 ед. Эндо-ПгС/г     Пектинэстеразная, ед. ПэС/г 85,1 125,5 В-Глюканазная, ед. β-ГкС/г 81,2 395,0 Целлюлолитическая, ед. ЦС/г 29,6 165,5 Ксиланазная, ед. КС/г 18,9 89,7 Маннаназная, ед. МС/г следы 4,53 Хитиназная, ед. ХС/г следы 34,3

Пример 2. Штамм Aspergillus foetidus 379-K культивируют на питательной среде следующего состава, %: неосветленные свекловичные волокна - 3,0; пшеничные отруби - 0,5; (NH₄)SO₄ - 0,5; КН₂РО₄ - 0,1; MgSO₄ - 0,1; остальное - водопроводная вода, рН - естественный. Ферментационную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 100 см питательной среды на качалке 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 48 часов. Активность пектолитических ферментов составляет: ПкС - 2,02 ед./см³; Эндо - ПгС - 1,85 ед./см³; ПэС - 0,84 ед./см³.

Пример 3. Культивирование продуцентов Aspergillus foetidus 379-K и известного Aspergillus foetidus 37 проводили аналогично, как описано в примере 1. Получение концентрированных ферментных препаратов осуществляли методом осаждения этанолом из культуральной жидкости в соотношении 1:3. рН культуральной жидкости 3,2. Сравнительная характеристика приведена в таблице 2.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно микробиологической промышленности. Получен новый штамм гриба-продуцента пектолитических ферментов Aspergillus foetidus 379-K (ВКПМ F-962). Использование данного штамма Aspergillus foetidus 379-K позволяет получить комплекс пектолитических ферментов с высоким уровнем активности эндополигалактуроназы, β-глюканаз, ксиланаз, целлюлаз, маннаназ и хитиназ. Штамм получен многоступенчатой селекцией из штамма Aspergillus foetidus 37 (ЦМПМ-Р-270) с использованием мутагенеза. Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии и на скошенном сусло-агаре. 2 табл.

Штамм гриба Aspergillus foetidus ВКПМ F-962 - продуцент пектолитических ферментов.