РАСТВОР ДЛЯ ФИКСАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК Российский патент 2015 года по МПК A01N1/02 G01N1/30 

Описание патента на изобретение RU2551570C2

Настоящее изобретение относится к раствору для фиксации биологических клеток (фиксирующий раствор), предназначенному для сохранения in vitro цитологического образца, типа содержащего спирт раствора для фиксации клеток. Более конкретно изобретение относится к области цитологии.

Фиксирующие растворы или фиксаторы предусмотрены для сохранения и консервации цитологических проб или образцов, включая клетки, для их последующего анализа цитологом. Образцы клеток могут быть, например, получены пункцией иглой, промыванием, соскабливанием или сбором мочи у пациента. Клетки могут быть клетками любого органа, например матки, печени, желудка, молочной железы, и тому подобными. Образец клеток может быть, например, образцом жидкости, более конкретно мочи, асцита, плевральной или перикардиальной жидкости; мазком, более конкретно мазком из шейки матки, мазком из влагалища; пункцией органа, более конкретно наружного органа, такого как молочная железа, щитовидная железа или внутреннего органа, такого как поджелудочная железа или печень и тому подобных.

Под «цитологическим фиксатором» или «цитологическим фиксирующим раствором» подразумевают раствор, обычно применяемый при цитологических анализах для фиксации клеток.

Фиксация является операцией, предназначенной для максимально возможного сохранения морфологии клеток в том состоянии, в котором они находились до их отбора. Самыми лучшими фиксаторами являются те, которые, оказывая быстрое действие, вызывают минимально возможное число вторичных или искусственных изменений, способных помешать анализу внутренней морфологии клеток.

Известен и давно применяется, в частности в сельскохозяйственной и ветеринарной области, уксусный формальдегидный спирт или AFA. AFA содержит метиловый или этиловый спирт, формалин и ледяную уксусную кислоту. Формалин представляет собой смесь, состоящую из муравьиной кислоты, формальдегида, параформальдегида и метанола. Примером является AFA компании Locquin, имеющий следующий состав:

Этиловый спирт крепостью 80° 100 см3 Лабораторный формалин концентрацией 38% 10 см3 Ледяная уксусная кислота 5 см3 Сахароза 10 г Дистиллированная вода 20 см3

Так, ледяная уксусная кислота разрушает эритроциты и растворяет их содержимое, вследствие чего образуются отложения гемоглобина, очень мешающие при анализе после стандартного окрашивания, более конкретно по Папаниколау, или окрашивания по Май-Грюнвальду-Гимзе (MGG), или очень мешающие при имуноцитохимических или других исследованиях. Более того, с позиции нормативных актов при такой концентрации этиловый спирт считается воспламеняющимся веществом, а формалин - токсичным и канцерогенным веществом.

Цель изобретения заключается в предоставлении раствора для фиксации биологических клеток, обеспечивающего хорошую сохранность целостности ядерных клеток и эритроцитов для их анализа, но менее опасного для пользователя.

В этой связи объектом изобретения является раствор для фиксации биологических клеток вышеназванного типа, содержащий физраствор для предотвращения осмотического шока на уровне клеточной стенки, формалин и полиэтиленгликоль для сохранения размера и целостности ядерных клеток и эритроцитов, фиксированных упомянутым раствором.

Согласно другим аспектам изобретения раствор для фиксации биологических клеток обладает одним или несколькими следующими свойствами:

- фиксирующий раствор не содержит ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты для сохранения целостности эритроцитов.

- спирт является этанолом или изопропанолом;

- спирт является смесью этанола и изопропанола;

- количество спирта значительно ниже 45% по объему фиксирующего раствора;

- количество формалина по существу составляет от около 0,2 до 1% по объему фиксирующего раствора.

- фиксирующий раствор содержит буфер, гарантирующий, что рН фиксирующего раствора по существу составляет от 6,4 до 7,4; и

- фиксирующий раствор содержит от 80% до 95% по объему:

- 590 мл физраствора,

- 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®),

- 203 мл изопропилового спирта,

- 193 мл чистого этанола,

- 0,01% по объему азида натрия,

и от 20% до 5% по объему формалина, забуференного из расчета 4%.

Так, этот раствор обеспечивает лучшую сохранность клеточных соотношений, более конкретно размеров ядра относительно размеров клетки, и, более конкретно прекрасную сохранность эритроцитов.

Кроме того, этот фиксирующий раствор слабовоспламеним, нетоксичен и не канцерогенен.

Изобретение будет лучше понятно при ознакомлении с описанием ниже, приведенным только для примера и составленного со ссылками на рисунки, на которых:

- фигура 1 представляет собой фотографию образца клеток, полученного из молочной железы, который был сохранен в фиксирующем растворе по изобретению,

- фигура 2 представляет собой фотографию образца клеток, отобранного из щитовидной железы, который был сохранен в фиксирующем растворе по изобретению.

Настоящее изобретение относится к фиксирующему раствору, предназначенному для сохранения in vitro цитологического образца, содержащего биологические клетки, предназначенные для анализа цитологом.

Фиксирующий раствор содержит изотонический раствор хлорида натрия или физраствор вместо дистиллированной или деионизированной воды, обычно применяемой в качестве основы традиционно использующихся фиксирующих растворов.

Физраствор известен давно, он содержит хлорид натрия, растворенный в дистиллированной воде из расчета 9 граммов хлорида натрия на 1 литр воды. Физраствор является изоосмолярным, что поддерживает клетки в состоянии правильной осмолярности, предотвращающем любой осмотический шок на уровне клеточной стенки и, следовательно, разрушение клеток разрывом цитоплазматических и ядерных мембран. Осмолярность физраствора составляет 308 мОсмоль на литр.

Осмолярность представляет собой концентрацию среды. Это возвращает нас к понятию осмоса, который является диффузией растворителя через полупроницаемую мембрану, разделяющую два раствора с различной концентрацией, например, фиксирующий раствор и цитоплазматическую жидкость клеток.

Кроме того, фиксирующий раствор содержит спирт для сохранения клеток в их состоянии, фиксируя их в спиртовой среде.

Предпочтительно количество спирта значительно ниже 45% по объему фиксирующего раствора с тем, чтобы он был слабовоспламенимым. Таким образом, это небольшое содержание спирта позволяет легче транспортировать и хранить фиксирующий раствор, поскольку он менее опасен. Более конкретно под слабой воспламеняемостью подразумевают то, что раствор по изобретению не требует нанесения на упаковку раствора значка безопасности, предупреждающего о воспламеняемости продукта.

Более конкретно спирт является этанолом или изопропанолом.

По одному из вариантов осуществления изобретения спирт является смесью этанола и изопропанола.

Однако спирт является обезвоживающим уменьшающим веществом, изменяющим таким образом размер клеток за счет сокращения ядра и цитоплазмы.

Для компенсации этого недостатка фиксирующий раствор также содержит формалин для сохранения размера клеток. Факт, что фиксирующий раствор может также содержать Carbowax® или полиэтиленгликоль, известен и опубликован Саккоманно (Saccomanno) и коллегами. Известен и опубликован тот факт, что формалин может сочетаться с веществами, удаляющими соли кальция или антиагрегантами, такими как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и ее соли. Также известен и опубликован тот факт, что к образцам, содержащим слизь, можно добавлять муколитическое вещество, в частности дитиотреитол (DTT) или ацетилцистеин.

Формалин позволяет сохранить эритроциты и ядерные клетки, не лизируя их и гарантируя соотношение по размеру, что позволяет цитологу ставить более точный диагноз.

Более конкретно, как можно видеть на фигурах 1 и 2, образцы клеток, которые хранили в фиксирующем растворе по изобретению эритроциты, отмеченные цифрой 1 на фигурах, прекрасно сохранились и не нарушены, что позволяет провести точный анализ этих образцов.

Предпочтительно количество формалина по существу составляет от около 0,2 до 1% по объему фиксирующего раствора. При такой концентрации формалин или формальдегид считается простым раздражающим средством по токсикологическому реестру, выпущенному Национальным институтом научных исследований и безопасности (INRS), в отличие от обычно применяемых концентраций от 1 до 25%, при которых формалин является коррозионным и канцерогенным. Таким образом упаковка раствора по изобретению также не требует нанесения значка безопасности, предупреждающего о том, что продукт является коррозионно-опасным.

Следовательно, при концентрации ниже 1% с раствором можно безопасно совершать манипуляции, поскольку уровень мер предосторожности для совершения манипуляций с ним ниже.

Известно, что фиксирующий раствор может содержать противомикробную добавку.

Фиксирующий раствор содержит буфер, гарантирующий уровень рН фиксирующего раствора по существу от 6,4 до 7,4. Этот диапазон рН соответствует оптимальным условиям хранения клеток и крови тела человека.

Приведенные ниже примеры иллюстрирую изобретение, не ограничивая его объем.

Пример 1

Раствор, образованный на 80% по объему из:

- 590 мл физраствора,

- 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®),

- 203 мл изопропилового спирта,

- 193 мл чистого этанола,

- 0,01% по объему азида натрия,

и на 20% по объему забуференного 4% формалина.

В одном из вариантов раствор может быть образован из 90% по объему указанной выше смеси и из 10% по объему забуференного 4% формалина или из 95% по объему указанной выше смеси и из 5% по объему забуференного 4% формалина.

Следует также отметить, что фиксирующий раствор по изобретению не содержит ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты. Эти продукты лизируют эритроциты, при разрушении которых высвобождается гемоглобин, который оседает на клетках. Некоторые типы окрашивания, например окрашивание по Папаниколау, с учетом сложности красителей, объединяющих несколько ядерных красителей и гемоглобина, делают в этом случае цитологический анализ, и более конкретно исследование ядра очень трудным, если ни невозможным. Иммуноцитохимические исследования также зачастую оказываются затрудненными отложениями гемоглобина.

Использование фиксирующего раствора по изобретению улучшает последующие анализы образца с окрашиванием по Папаниколау или Иммуноцитохимические исследования образца, фиксированного в фиксирующем растворе, описанном в настоящем документе и не содержащем ни ацетона или соединений класса кетонов, ни уксусной кислоты.

Таким образом, описанный выше фиксирующий раствор обеспечивает прекрасную сохранность целостности ядерных клеток и эритроцитов для их анализа.

Похожие патенты RU2551570C2

название год авторы номер документа
АВТОМАТИЧЕСКИЙ СПОСОБ И АВТОМАТ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ И АНАЛИЗА МНОЖЕСТВА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ 2011
  • Пельтье Эрик
RU2556994C2
Способ изготовления клеточного блока клеточного материала 2019
  • Тихонов Яков Николаевич
  • Назарова Ирина Владимировна
  • Рева Иван Владимирович
  • Цегольник Екатерина Вадимовна
  • Тудаков Владислав Сергеевич
  • Рева Галина Витальевна
  • Енина Светлана Владимировна
  • Горелик Максим Зимулович
  • Олексенко Олеся Михайловна
  • Коцюрбий Евгений Анатольевич
  • Тилик Татьяна Валерьевна
  • Толмачёв Валерий Евгеньевич
RU2722661C1
СИСТЕМА И НАБОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ 2012
  • Кумар Сунил
  • Джаявантх Санджай
  • Наик Сариф Кумар
  • Кесварпу Пайял
  • Чакрабарти Бисваруп
RU2619784C2
Способ получения цитогенетических препаратов клеток эпителия для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации 2019
  • Шкаврова Татьяна Геннадьевна
  • Голуб Елена Викторовна
  • Михайлова Галина Фёдоровна
  • Цепенко Виктория Викторовна
  • Иванов Сергей Анатольевич
  • Каприн Андрей Дмитриевич
RU2706220C1
Способ комплексной морфологической диагностики рака яичников 2015
  • Леонов Михаил Генрихович
  • Беляева Софья Александровна
  • Ершова Янина Хаим-Беньяминовна
RU2640189C2
Способ многоцветной иммуноцитохимической диагностики паранеоплазии шейки матки 2020
  • Зиновьев Святослав Владимирович
  • Москвичев Максим Андреевич
  • Уткин Олег Владимирович
  • Круглова Ирина Александровна
  • Кузнецова Софья Алексеевна
  • Грачев Алексей Николаевич
  • Круглова Ольга Владимировна
RU2753236C1
Способ получения клеточных блоков для цитологической и иммуноцитохимической диагностики злокачественных новообразований 2023
  • Леонов Михаил Генрихович
  • Павлюк Карлыгаш Сагумбаевна
  • Славнова Елена Николаевна
  • Размахаев Георгий Сергеевич
RU2818060C1
СПОСОБ ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ 2014
  • Леонов Михаил Генрихович
  • Тхагапсо Андзаур Асланович
  • Ершова Янина Хаим-Беньяминовна
RU2547567C1
СПОСОБ ОКРАСКИ ЯДРЫШКОВЫХ ОРГАНИЗАТОРОВ НА ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ И ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ МАЗКАХ 2010
  • Бобров Игорь Петрович
  • Черданцева Татьяна Михайловна
  • Брюханов Валерий Михайлович
  • Климачев Владимир Васильевич
  • Лазарев Александр Федорович
  • Авдалян Ашот Миружанович
RU2447438C2
Способ проведения цитологического исследования при дифференциальной диагностике узловых образований щитовидной железы 2019
  • Рева Иван Владимирович
  • Рева Галина Витальевна
  • Калинин Илья Олегович
  • Григорян Виктория Самвеловна
  • Цегольник Екатерина Вадимовна
  • Тудаков Владислав Сергеевич
  • Гармаш Адель Игоревна
  • Гармаш Роман Александрович
  • Зудина Анна Алексеевна
  • Барановская Ирина Анатольевна
  • Пуга Дмитрий Петрович
  • Можилевская Екатерина Сергеевна
  • Накоренок Анна Анатольевна
  • Гордзиевская Яна Владимировна
RU2712080C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 551 570 C2

Реферат патента 2015 года РАСТВОР ДЛЯ ФИКСАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Изобретение относится к раствору для фиксации биологических клеток. Фиксирующий раствор предназначен для сохранения in vitro цитологического образца, содержащего ядерные клетки и эритроциты. Он содержит от 80% до 95% по объему смеси: 590 мл физраствора, 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®), 203 мл изопропилового спирта, 193 мл чистого этанола, 0,01% по объему азида натрия, и от 20% до 5% по объему забуференного 4% формалина, pH фиксирующего раствора находится в диапазоне от 6,4 до 7,4. Изобретение позволяет обеспечить хорошую сохранность целостности ядерных клеток. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Формула изобретения RU 2 551 570 C2

1. Фиксирующий раствор, предназначенный для сохранения in vitro цитологического образца, содержащего ядерные клетки и эритроциты, характеризующийся тем, что он содержит от 80% до 95% по объему:
- 590 мл физраствора,
- 10 мл полиэтилен гликоля (Carbowax®),
- 203 мл изопропилового спирта,
- 193 мл чистого этанола,
- 0,01% по объему азида натрия,
и от 20% до 5% по объему забуференного 4% формалина.

2. Фиксирующий раствор по п. 1, характеризующийся тем, что он содержит буфер, обеспечивающий pH фиксирующего раствора от 6,4 до 7,4.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2551570C2

Топчак-трактор для канатной вспашки 1923
  • Берман С.Л.
SU2002A1
US 4857300 A 15.08.1989
Способ извлечения битумов из бурых углей 1948
  • Голованов Н.Г.
SU76372A1
СПОСОБ ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР 1998
  • Архипов С.А.
RU2194279C2

RU 2 551 570 C2

Авторы

Пельтье Эрик

Даты

2015-05-27Публикация

2011-01-20Подача