ПРИМЕНЕНИЕ МИМОТОПОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БЕТТА-АМИЛОИДОЗОВ Российский патент 2015 года по МПК A61K38/08 A61K47/00 A61P25/16 A61P25/28 

Настоящее изобретение относится к применению мимотопов для профилактики, лечения и диагностики заболеваний, обусловленных образованием и(или) агрегацией β-амилоида (β-амилоидозы).

Различные дегенеративные заболевания характеризуются аномальными процессами полимеризации и накопления определенных белков. Так называемые протеинопатии включают неврологические заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, а также различные системные заболевания, включая амилоидозы. Настоящее изобретение относится к профилактике, лечению и диагностике протеинопатии, обусловленных белками β-амилоида и объединенных термином β-амилоидозы. Самая известная форма β-амилоидозов - болезнь Альцгеймера (БА). Другие примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, деменцию с тельцами Леви и деменцию при синдроме Дауна.

Для БА характерно аномальное накопление внеклеточных бляшек амилоида, тесно связанное с обширным астроцитозом и микроглиозом, а также дистрофией и гибелью нейронов. Эти амилоидные бляшки состоят в основном из белков амилоида β (Аβ) - Аβ40 и Аβ42, - получающихся их белка-предшественника амилоида (БПА), который экспрессируется на различных типах клеток нервной системы. Считается, что белки Аβ принимают прямое участие в патогенезе и прогрессировании БА.

В норме БПА подвергается превращениям за счет двух этапов расщепления с образованием известных на сегодняшний день форм Абета × -40/42/43. Первое расщепление происходит под воздействием ферментов 1 и 2, расщепляющих БПА в бета-сайте (ВАСЕ1 и ВАСЕ); второй этап протеолиза осуществляет комплекс гамма-секретазы (обзоры De Strooper et al., J Cell Sci 113 (2000): 1857-1870).

Ферменты ВАСЕ распознают два сайта на N-конце предполагаемого белка Аβ: первое взаимодействие ВАСЕ с БПА ведет к разрезанию последовательности DAEFR (положение 1 в АД) и образованию Abeta 1-Х. Или же ВАСЕ также может разрезать последовательность в будущем положении 11 в Аβ с образованием фрагмента 11-Х, Таким образом, превращения БРА, опосредованные ВАСЕ, ведут к образованию различных форм Аβ, где главным компонентом являются полноразмерные белки Abeta 1-40/42. Активность гамма-секретазы ведет к образованию 3 основных фрагментов: Aβ 1-40/42/43. После образования эти белки подвергаются дальнейшей обработке аминопептидазами с последующим поэтапным разрушением. Эти дальнейшие этапы ведут к образованию других форм, например, Aβ3-40/42 соответственно. У человека в среднем 60-85% материала амилоидных бляшек образовано производными Aβ40/42, которые укорочены на N-конце и часто модифицированы. Относительные количества укороченных с N-конца форм Aβ различаются по уровням Аβ, мутациям и активности ВАСЕ.

Самые часто встречающиеся укороченные формы Аβ - это Аβ3-40/42 и Aβ11-40/42. Оба пептида содержат на М-конце остаток глутамина, который часто превращен ферментами в пироглутамат, с образованием Aβ3 (рЕ) - 40/42 и Aβ11 (рЕ) - 40/42 соответственно. Поскольку аминоконец белков Abeta 3 (рЕ) и 11 (рЕ) блокирован внутренним лактамом, он защищен от протеолитического действия аминопептидаз, отличающихся от специфичных к пироглутамату, и, таким образом, он может оставаться в тканях стабильным.

Самая частая форма модифицированного амилоида, укороченного с N-конца, образуется белком 3 (рЕ) - 40/42, который, как полагают, составляет до 50% всех укороченных форм. Это означает, что на эти изоформы приходится 25-40% всех белков амилоида в головном мозге при БА. Другая часто встречающаяся форма укороченных пептидов Аβ - Аβ11-40/42: Naslund et al. и Huse et al. удалось продемонстрировать, что значимый уровень таких укороченных форм присутствует в головном мозге больных БА, а также у больных с субклинической БА. Кроме того, эти пептиды подвергаются внутримолекулярной дегидратации и образуют стабильные формы (рЕ) с последствиями, схожими с описанными в отношении 3 (рЕ) - 40/42.

Ранее показано, что укороченные и модифицированные пептиды более стабильны в тканях нервной системы, чем полноразмерный Аβ. Кроме того, укороченные с N-конца формы Аβ имеют более выраженные амилоидогенные свойства, чем неизмененные пептиды Аβ, таким образом ускоряя образование бляшек, а также они проявляют нейротоксические свойства при воздействии на нейроны в культуре и экспериментах in vivo. Укороченные формы Аβ можно выявить в диффузных скоплениях Аβ уже на ранних стадиях БА, и они могут участвовать в раннем образовании бляшек, действуя как отдельные «затравки» in vivo.

Имеются убедительные доказательства, что присутствие форм Аβ, укороченных с N-конца, коррелирует с нарастанием тяжести и ранним началом нейродегенерации в спорадических и семейных случаях болезни Альцгеймера, а также у больных с синдромом Дауна. Склонность к агрегации в сочетании с повышенной стабильностью этих пептидов превращают их в потенциально опасный фактор в развитии БА. Анализ больных, страдающих субклинической формой семейной БА или синдромом Дауна, убедительно продемонстрировал, что Aβ 3 (рЕ) - 42 можно выявить на самых ранних стадиях заболевания, также называемых «затравочными» стадиями. В это время неврологические симптомы отсутствуют или проявляются в минимальной степени, хотя начинают формироваться бляшки, содержащие формы пептидов Аβ 3 (рЕ) - 42. Таким образом, данные по таким больным предполагают связь между начальным образованием укороченных форм Аβ и началом заболевания, а также его прогрессированием.

В свете этих данных, видимо, важно уменьшить количество таких пептидных форм у больных с БА, чтобы замедлить прогрессирование заболевания, а также снизить токсичность и сопутствующее ухудшение когнитивных функций. Следовательно, оптимальная вакцина против. БА должна вызывать иммунный ответ, который направлен против самых частых форм пептидов Аβ, присутствующих в головном мозге больных с БА.

Фактически иммунотерапия, где использовалась активная и пассивная иммунизация против полноразмерных Аβ, приводила к уменьшению бляшек Аβ и оказывала благоприятное действие в отношении прогрессирования заболевания у экспериментальных животных с моделью БА. Эксперименты на мышах с моделью БА с использованием пассивной иммунизации четко продемонстрировали, что антитела, специфичные к N- и С-концам Аβ 40/42, способны уменьшать объем бляшек в головном мозге и также улучшать когнитивные функции у леченых животных, что следует из анализов поведения. Схожие находки получены в экспериментах с активной иммунизацией, где применяли различные методики индукции иммунного ответа на Аβ 40/42 у мышей. Во всех этих методиках использовали полноразмерные Аβ 40/42 или их фрагменты, содержащие неизмененную последовательность Аβ, ив большинстве случаев наблюдали уменьшение объема бляшек амилоида у трансгенных мышей с моделью БА. Важно, что у этих животных также наблюдали улучшение когнитивных функций. Strikingly, Lemere et al. (Am J Pathol 165 (2004): 283-297) удалось воспроизвести эти результаты у приматов, не относящихся к человекообразным, при этом выявлено четкое уменьшение бляшек и сопутствующих патологических изменений после активной иммунизации против полноразмерного Аβ. Однако первую IIa фазу клинического испытания у больных с БА с использованием полноразмерного Аβ 42 в качестве антигена пришлось прервать из-за тяжелых побочных эффектов, обусловленных воспалением тканей нервной системы, включая инфильтрацию головного мозга аутореактивными Т-лимфоцитами. Тем не менее, исследования, где изучали клинические эффекты у больных, леченых AN-1792, выявили, что у больных, у которых развился антительный ответ на Аβ 42, но не развился менингоэнцефалит, результаты тестов когнитивных функций были лучше, чем у больных, у которых иммунный ответ отсутствовал, что указывает на то, что иммунотерапия может оказаться полезным методом лечения БА.

Очень важно, что недавние результаты, полученные при аутопсии больных, прошедших вакцинацию AN1792, продемонстрировали исчезновение полноразмерных форм Аβ из головного мозга, но формы Аβ, укороченные с N-конца, сохранялись. Этот факт подчеркивает необходимость в изобретении новых вакцин, которые направлены против полноразмерных Аβ, a также форм, укороченных с N-конца, и модифицированных форм этой молекулы.

Индукция иммунного ответа на пептиды Аβ 40/42 у человека может влиять на снижение когнитивных функций у больных с БА, но безопасная вакцина против болезни Альцгеймера не должна вызывать образование аутореактивных Т-лимфоцитов. Вакцинация нативными пептидами Aβ 40/42 или их фрагментами несет риск аутоиммунного заболевания у больных, так как иммунный ответ не может быть направлен исключительно на Аβ.

Цель настоящего изобретения - получение соединений и лекарственных средств, которые можно применять для лечения и(или) профилактики В-амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера. Эти соединения не должны нести никакого риска или нести существенно сниженный риск аутоиммунных заболеваний при введении субъекту. Согласно другому аспекту настоящего изобретения, вышеуказанные соединения могут быть способны вызывать in vivo образование антител у субъекта к укороченным и(или) стабилизированным формам Аβ, которые обычно являются главными компонентами отложений амилоида.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность

$$X_{1}R{X}_{2}D{X}_3{(X_4)}_n{(X_5)}_m{(X_6)}_o(ФормулаI),$$

где:

X₁ - изолейцин (I) или валин (V),

X₂ - триптофан (W) или тирозин (Y),

Х₃ - треонин (Т), валин (V), аланин (А), метионин (М), глутамин (Q) или глицин (G),

Х₄ - пролин (Р), аланин (А), тирозин (Y), серин (S), цистеин (С) или глицин (G),

Х₅ - пролин (Р), лейцин (L), глицин (G) или цистеин (С),

Х₆ - цистеин (С)

n, m и - независимо друг от друга 0 или 1 причем вышеуказанное соединение обладает связывающей способностью антитела, которое специфично к эпитопу бета-пептида амилоида (Аβ), содержащему аминокислотную последовательность EFRHDSGY и(или) pEFRHDSGY для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения (3-амилоидозов.

Неожиданно оказалось, что соединение, содержащее аминокислотную последовательность формулы I, способно индуцировать in vivo образование антител, которые направлены против укороченных форм Аβ - Аβ рЕ3 - 40/42 и Аβ3 - 40/42. Образующиеся антитела способны связывать вышеуказанные фрагменты Ар с последующим разрушением бляшек Аβ.

Формула I и II и все другие пептидные молекулы, описанные в данном документе, имитируют естественные пептиды Аβ и варианты Аβ 1-40/42, Аβ рЕ3-40/42, Аβ 3-40/42 и Aβ 11-40/42 так, что соединения, содержащие аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, способны индуцировать образование соответствующих антител.

Изобретение, описанное в данном документе, относится к антигенам, которые не содержат последовательности нативного пептида Аβ и имитируют структуру неоэпитопов, не выявляющихся мимотопами, такими как описанные в WO 2004/062556. Такие вакцины против БА, основанные на мимотопах, будут, следовательно, индуцировать антительные ответы, направленные исключительно против аномальных молекул Аβ, упомянутый в данном документе, но не против родительских структур, таких как БПА. Кроме того, мимотопы не содержат потенциальные эпитопы Т-лимфоцитов и не вызывают образование вредных аутореактивных Т-лимфоцитов.

«β-амилоидозы», согласно употреблению в данном документе, означают различные нейродегенеративные заболевания, которые характеризуются аберрантной полимеризацией и накоплением специфических белков, - так называемые протеинопатии. Настоящее изобретение относится к профилактике, лечению и диагностике протеинопатии, обусловленных белками β-амилоида и объединенных термином β-амилоидозы. Самая известная форма β-амилоидозов - болезнь Альцгеймера (БА). Другие примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, деменцию с тельцами Леви и деменцию при синдроме Дауна. Другие примеры - деменция с тельцами Леви, миозит, спорадический миозит с тельцами включения, наследственное кровоизлияние в мозг с амилоидозом (голландского типа), мозговая амилоидная ангиопатия, Аβ-ассоциированный ангиит.

Согласно конкретному предпочтительному варианту настоящего изобретения, «β-амилоидозы» означают болезнь Альцгеймера.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения, соединение содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C), IRYDMAG (C), IRWDTSL (C), IRWDQP (C), IRWDG (C) и IRWDGG (C).

Конкретные предпочтительные соединения настоящего изобретения включают или состоят из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где С-конец вышеуказанного пептида может содержать или не содержать остаток цистеина (указанный скобками) так, что получающееся соединение может быть связано, например, с молекулой-носителем. Однако разумеется, также возможно связать цистеиновый остаток с N-концом вышеуказанного пептида.

Согласно конкретному предпочтительному варианту настоящего изобретения аминокислотная последовательность представляет собой IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C) или IRYDMAG (C).

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность

$$E{X}_{1}WH{X}_2{X}_3{(X_4)}_n{(X_5)}_m(ФормулаII),$$

где:

X₁ - валин (V), аргинин (R) или лейцин (L),

X₂ - аргинин (R) или глутаминовая кислота (Е),

Х₃ - аланин (А), гистидин (Н), лизин (К), лейцин (L), тирозин (Y) или глицин (G),

Х₄ - пролин (Р), гистидин (Н), фенилаланин (F), глутамин (Q) или цистеин (С)

Х₅ - цистеин (С),

n и m - независимо друг от друга 0 или 1,

причем вышеуказанное соединение обладает связывающей способностью антитела, которое специфично к эпитопу бета-пептида амилоида (Аβ), содержащему аминокислотную последовательность EVHHQKL, для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения β-амилоидозов.

Введение соединения, содержащего аминокислотную последовательность формулы II, вызывает иммунный ответ на укороченную форму Аβ - Aβ 11 - 40/42.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения, соединение содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей EVWHRHQ (С), ERWHEKH (С), EVWHRLQ (С), ELWHRYP (С), ELWHRAF (С), ELWHRA (C), EVWHRG (C), EVWHRH (C) и ERWHEK (C), предпочтительно EVWHRHQ (С), ERWHEKH (С), EVWHRLQ (С), ELWHRYP (С) и ELWHRAF (С).

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей QDFRHY (C), SEFKHG (C), TSFRHG (C), TSVFRH (C), TPFRHT (C), SQFRHY (C), LMFRHN (C), SAFRHH (C), LPFRHG (C), SHFRHG (C), ILFRHG (C), QFKHDL (C), NWFPHP (C), EEFKYS (C), NELRHST (C), GEMRHQP (C), DTYFPRS (C), VELRHSR (C), YSMRHDA (C), AANYFPR (C), SPNQFRH (C), SSSFFPR (C), EDWFFWH (C), SAGSFRH (C), QVMRHHA (C), SEFSHSS (C), QPNLFYH (C), ELFKHHL (C), TLHEFRH (C), ATFRHSP (C), APMYFPH (C), TYFSHSL (C), HEPLFSH (C), SLMRHSS (C), EFLRHTL (C), ATPLFRH (C), QELKRYY (C), THTDFRH (C), LHIPFRH (C), NELFKHF (C), SQYFPRP (C), DEHPFRH (C), MLPFRHG (C), SAMRHSL (C), TPLMFWH (C), LQFKHST (C), ATFRHST (C), TGLMFKH (C), AEFSHWH (C), QSEFKHW (C), AEFMHSV (C), ADHDFRH (C), DGLLFKH (C), IGFRHDS (C), SNSEFRR (C), SELRHST (C), THMEFRR (C), EELRHSV (C), QLFKHSP (C), YEFRHAQ (C), SNFRHSV (C), APIQFRH (C), AYFPHTS (C), NSSELRH (C), TEFRHKA (C), TSTEMWH (C), SQSYFKH (C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C) HEFRH и HEFRH (C) для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения β-амилоидозов.

Каждое из этих соединений способно вызывать in vivo образование антител, направленных против Аβ 1 - 40/42, Аβ рЕ3 - 40/42 и Аβ 3 - 40/42. Следовательно, эти соединения особенно хорошо подходят для лечения и(или) профилактики β-амилоидозов, таких как БА, поскольку введение одного соединения приводит к образования антител, способных распознавать три главные формы Аβ - Аβ1 - 40/42, Аβ рЕ3 - 40/42 и Аβ3 - 40/42.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения, соединение состоит из или содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей QDFRHY (C), SEFKHG (C), TSFRHG (C), TSVFRH (C), TPFRHT (C), SQFRHY (C), LMFRHN (C), SAFRHH (C), LPFRHG (C), SHFRHG (C), ILFRHG (C), QFKHDL (C), NWFPHP (C), EEFKYS (C), SPNQFRH (C), TLHEFRH (C), THTDFRH (C), DEHPFRH (C), QSEFKHW (C), ADHDFRH (C), DGLLFKH (C), EELRHSV (C), TEFRHKA (C), (C) SEFKH, SEFKH (C), (C) HEFRH и HEFRH (C) предпочтительно SEFKHG (C), TSVFRH (C), SQFRHY (C), LMFRHN (C), ILFRHG (C), SPNQFRH (C), ELFKHHL (C), TLHEFRH (C), THTDFRH(C), DEHPFRH (C), QSEFKHW (C), ADHDFRH (C), YEFRHAQ (C), TEFRHKA (C).

Аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, считаются мимотопами эпитопов Аβ, содержащих аминокислотные последовательности EFRHDSGY, pEFRHDSGY или EVHHQKL. Согласно настоящему изобретению, термин «мимотоп» означает молекулу, которая имеет конформацию, являющуюся топологическим эквивалентом эпитопа, который она имитирует. Мимотоп связывается с тем же самым антигенсвязывающим участком антитела, с которым специфически связывается нужный антиген. Мимотоп будет вызывать иммунный ответ у хозяина, проявляющийся в реакции на антиген, который он имитирует. Также мимотоп может действовать как конкурент за связывание эпитопа, который он имитирует в анализах торможения in vitro (например, в твердофазном иммуноферментном анализе), где участвуют эпитоп и антитело, связывающее вышеуказанный эпитоп. Однако мимотоп настоящего изобретения необязательно может предотвращать связывание эпитопа или конкурировать за связывание эпитопа, который он имитирует в анализах торможения in vitro, хотя он способен вызывать иммунный ответ при введении млекопитающему.

Согласно использованию в данном документе, термин «эпитоп» означает иммуногенный участок антигена, который распознается молекулой определенного антитела. Как правило, антиген имеет один или несколько эпитопов, каждый из которых способен связывать антитело, способное распознавать определенный эпитоп.

Мимотопы настоящего изобретения можно получать синтетическим путем с помощью методик химического синтеза, известных в данной области техники, либо в виде отдельного пептида, либо как часть другого пептида или полипептида. Или же пептидный мимотоп можно получать в микроорганизме, вырабатывающем этот пептидный мимотоп, который затем выделяют и, при необходимости, подвергают дополнительной очистке. Пептидный мимотоп можно получать в таких микроорганизмах, как бактерии, дрожжи или грибы, в клетках эукариотов, таких как клетки млекопитающих или насекомых, или с помощью рекомбинантного вирусного вектора, такого как аденовирус, поксивирус, вирус герпеса, вирус леса Семлики, бакуловирус, бактериофаг, вирус синдбис или вирус сендаи. Пригодные для получения пептидного мимотопа бактерии включают Е. coli, В. subtilis или любые другие бактерии, которые способны вырабатывать пептиды, такие как пептидный мимотоп. Пригодные для получения пептидного мимотопа типы дрожжей включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris или любые другие дрожжи, способные вырабатывать пептиды. Соответствующие методики известны в данной области техники. Также методики выделения и очистки пептидов, получающихся рекомбинантным путем, хорошо известны в данной области техники и включают, например, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию и т.д.

Для облегчения выделения пептидного мимотопа может быть изготовлен гибридный полипептид, где пептидный мимотоп трансляционно слит (ковалентно связан) с гетерологичным полипептидом, который обеспечивает выделение с помощью аффинной хроматографии. Типичные гетерологичные полипептиды - His-Tag (например, His₆: 6 остатков гистидина), GST-Tag (глутатион-S-трансфераза) и т.д. Гибридный полипептид не только облегчает очистку мимотопов, но и предупреждает разрушение полипептида мимотопа в процессе очистки. Если требуется удалить гетерологичный полипептид после очистки, гибридный полипептид может содержать сайт расщепления в месте соединения между пептидным мимотопом и гетерологичным полипептидом. Сайт расщепления состоит из аминокислотной последовательности, которая расщепляется ферментом, специфичным для этой аминокислотной последовательности в данном сайте (например, протеазами).

Мимотопы настоящего изобретения также могут быть модифицированы в или вблизи их N- и(или) С-конца так, чтобы с ними в вышеуказанным положениях был связан остаток цистеина. В предпочтительном варианте концевые остатки цистеина (расположенные на N- и С-концах пептида) используются для циклизации пептидов за счет дисульфидной связи. Остаток цистеина также может служить для связывания дополнительной молекулы (например, носителя) с вышеуказанным пептидом или соединением.

Мимотопы настоящего изобретения также могут быть использованы в различных анализах и наборах, в частности, в иммунологических анализах и наборах. Таким образом, особенно предпочтительно, чтобы мимотоп мог быть частью другого пептида или полипептида, в частности, фермента, который используется как репортер в иммунологических анализах. Такие ферменты-репортеры включают, например, щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена обыкновенного.

Мимотопы, согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой антигенные полипептиды, которые в своей аминокислотной последовательности отличаются от аминокислотной последовательности Аβ или от фрагментов Аβ. В этом отношении мимотопы настоящего изобретения могут включать не только аминокислотные замены одного или нескольких естественных остатков аминокислот, но также одну или несколько аминокислот, не встречающихся в естественных условиях (например, не относящихся к 20 «классическим» аминокислотам), или они могут быть полностью собраны из аминокислот, не встречающихся в естественных условиях. Кроме того, антигены настоящего изобретения, которые могут индуцировать образование антител, направленных против и связывающих Аβ 1 - 40/42, Аβ рЕ3 - 40/42, Аβ 3 - 40/42 и Аβ 11 - 40/42, могут быть собраны из D- или L-аминокислот или комбинаций DL-аминокислот и, на выбор, они могут быть уже модифицированы за счет дополнительных модификаций, замыкания в кольцо или получения производных. Подходящие антигены, индуцирующие образование антител, можно получить из пептидных библиотек, имеющихся в продаже. Предпочтительно эти пептиды должны состоять по крайней мере из 7 аминокислот, и предпочтительно их длина должна составлять до 16 аминокислот, предпочтительно до 14 или 20 аминокислот (например, от 5 до 16 аминокислотных остатков). Однако согласно настоящему изобретению более длинные пептиды тоже могут быть успешно использованы в качестве антигенов, индуцирующих образование антител. Кроме того, мимотопы настоящего изобретения также могут быть частью какого-либо полипептида и, следовательно, содержать на N- или С-конце по крайней мере один дополнительный аминокислотный остаток.

Для получения мимотопов настоящего изобретения (например, антигенов, индуцирующих образование антител, описанных в данном документе), конечно же, также пригодны библиотеки фагов и библиотеки пептидов, например, полученных с помощью методик комбинаторной химии или полученных путем высокопроизводительных методик скрининга наиболее меняющихся структур (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec.; 50 (6): 837-54).

Кроме того, согласно настоящему изобретению также могут быть использованы антигены, индуцирующие образование антител к Аβ 1 - 40/42, Аβ рЕ3 - 40/42, Аβ 3 - 40/42 и Aβ 11 - 40/42 и основанные на нуклеиновых кислотах, и их тоже можно найти с помощью большинства различных библиотек (олигонуклеотидов) (например, из 2-180 остатков нуклеиновых кислот) (например, Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700; Famulok et al., Ace. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, и т.д.). В антигенах на основе нуклеиновых кислот, индуцирующих образование антител, цепь нуклеиновой кислоты может быть получена, например, из естественных фосфорнодиэфирных соединений, или также из фосфотиоатов или комбинаций или химических вариантов (например, таких как пептид-нуклеиновая кислота), где в качестве нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, могут быть использованы в основном U, Т, А, С, G, Н и mC. 2'-Остатки нуклеотидов, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой, ОН, F, Cl, NH₂, O-метил, O-этил, O-пропил или O-бутил, где нуклеиновые кислоты также могут быть модифицированы различным образом, например, с использованием защитных групп, как они традиционно используются в синтезе олигонуклеотидов. Таким образом, антигены на основе аптамеров, индуцирующие образование антител, также являются предпочтительными антигенами, индуцирующими образование антител в объеме настоящего изобретения.

Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения соединение связывают с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно KLH (гемоцианином фиссуреллы), столбнячным токсином, альбуминсвязывающим белком, бычьим сывороточным альбумином, дендримером (MAP; Biol. Chem. 358: 581), пептидными линкерами (или фланкирующими участками regions), а также веществами-адъювантами, описанными в Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (в частности, в таблице 1 этого документа) и O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (в частности, эндогенные иммуномодулирующие соединения и системы доставки, описанные там), или их смесями. Конъюгированные химические соединения (например, с участием гетерофункциональных соединений, таких как GMBS и, конечно, других, таких как описаны в «Bioconjugate Techniques», Greg T.Hermanson) в данном контексте могут быть выбраны из реакций, известных специалисту в данной области техники. Кроме того, состав вакцин может быть дополнен адъювантом, предпочтительно малорастворимым алюминийсодержащим веществом, в частности, гидроксидом алюминия. Конечно, также могут быть использованы такие адъюванты, как гидрофосфат алюминия MF59, фосфат кальция, цитокины (например, ИЛ-2, ИЛ-12, ГМ-КСФ), сапонины (например, QS21), производные мурамил-l-аланил-d-изоглутамина, олиго-CpG, ЛПС, МПС, полифосфазены, эмульсии (например, эмульсия Фройнда, SAF), липосомы, виросомы, искомы, кохлеаты, полилактид-ко-гликолидные микрочастицы, полоксамерные частицы, вирусоподобные частицы, термолабильный энтеротоксин (ЛТ), холерный токсин (XT), мутантные токсины (например, LTK63 и LTR72), микрочастицы и(или) полимеризованные липосомы.

Соединение настоящего изобретения предпочтительно связано с носителем или адъювантом через линкер, который выбирают из группы, состоящей из NHS-поли(этиленоксида) (РЭО) (например, NHS-PEO₄-малеимид).

Вакцину, которая содержит настоящее соединение (мимотоп) и фармацевтически приемлемый носитель, можно вводить любым подходящим путем, например, внутрикожно, внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, интраназально, внутрь, подкожно и т.д., и в любом подходящем инжекторном устройстве (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). Соединение настоящего изобретения предпочтительно выпускать в фармацевтической форме для внутривенного, подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения (см., например, «Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations», Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).

Лекарственное средство (вакцина) согласно настоящему изобретению содержит соединение настоящего изобретения в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в частности, от 100 нг до 100 мкг, или же, например, от 100 фмоль до 10 мкмоль, предпочтительно до 10 пмоль до 1 мкмоль, в частности, от 100 пмоль до 100 нмоль. Типично вакцина может также содержать вспомогательные вещества, например, буферные растворы, стабилизаторы и т.д.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению соединения согласно определению выше для лечения и(или) уменьшения симптомов синуклеопатии.

Неожиданно оказалось, что соединения настоящего изобретения также можно использовать для лечения или уменьшения симптомов, обусловленных синуклеопатиями.

Амилоидозы и синуклеопатии обусловлены накоплением в головном мозге β-амилоида и α-синуклеина соответственно. У некоторых больных имеются клинические и морфологические проявления обоих заболеваний, что предполагает перекрывание механизмов патогенеза. Этих больных относят к страдающим вновь открытым синдромом, называемым деменцией с тельцами Леви или болезнью Паркинсона с деменцией (ДТЛ/БПД). Недавно на модели ДТЛ/БПД у трансгенных животных установлено, что суперэкспрессия и синуклеина, и белка-предшественника амилоида (чБПА) у мышей ведет к развитию когнитивных и двигательных нарушений, сопровождающихся утратой холинергических нейронов и уменьшением количества синаптических пузырьков, образованием обширных амилоидных бляшек и фибриллярных включений в нейронах, вступающих в иммунологическую реакцию с haSYN. Все эти признаки также обнаруживают при синдроме ДТЛ/БПД. Недавно описано, что обе молекулы способны взаимодействовать и образовывать гибридные олигомеры in vitro. Также обнаружено, что суперэкспрессия БПА может усугублять некоторые морфологические эффекты суперэкспрессии α-синуклеина. И наоборот, α-синуклеин способен усиливать секрецию и токсичность бета-пептидов амилоида и, возможно, также усиливать эффекты β-амилоида, что свидетельствует в поддержку перекрывания механизмов патогенеза при нейродегенеративном процессе.

Установлено, что при обеих протеинопатиях прогрессирующее накопление пептидных олигомеров является одним из главных проявлений токсичности, ведущим к различным изменениям, которые типичны либо для синуклеопатий, либо для амилоидозов. Несмотря на механическое сходство, предполагается, что α-синуклеин и Aβ вызывают разные, а также сходящиеся, патологические эффекты в отношении структурной целостности и функции головного мозга. Считается, что синуклеины влияют на моторную функцию гораздо сильнее, чем на когнитивную, в то время как пептиды и -амилоиды вызывают противоположные эффекты. Причина такого расхождения на сегодняшний день не установлена, но оно мешает точному выяснению взаимозависимости и эффектов обеих молекул.

Методика лечения, представленная в настоящем изобретении, описана как иммунотерапия, направленная на Aβ, что приведет к удалению главного внеклеточного амилоида. Такое лечение должно уменьшить изменения, вызванные амилоидом - от образования бляшек до гибели нейронов, - а также нарушения памяти и снижение когнитивных функций. Однако субклеточная локализация синуклеинов указывает, что эти внутриклеточные белки в основном активны на уровне синапсов, в частности, в синаптических пузырьках. Любопытно также, что скопления синуклеина, которые являются типичным морфологическим признаком синуклеопатий, в основном обнаруживаются внутри клеток. Кроме того, полагают, что механизм патогенеза синуклеопатий включает изменения внутри нейронов, начиная с нарушения функции митохондрий, накопления неправильно свернутых убиквитинированных или фосфорилированных белков, а также накопления альфа-синуклеина. Такие изменения в итоге приводят к изменениям функции синапсов, нарушению синаптической передачи и гибели дофаминергических нейронов с классическими проявлениями синуклеопатий. Aβ, наоборот, обнаруживается в основном во внеклеточном пространстве, и бляшки амилоида, а также волокна, протофибриллы и олигомеры бета-амилоида могут оказывать нейротоксическое воздействие при внесении во внеклеточное пространство или в ткань головного мозга. Таким образом, для опытного специалиста будет необычным, что методика, направленная в основном на внеклеточный амилоид, будет уменьшать симптомы синуклеопатий, таких как болезнь Паркинсона, которые влияют главным образом на внутриклеточные процессы, ведущие к развитию типичных симптомов, описанным ниже. Еще более неожиданно, что, как считается в настоящее время, перекрывающиеся эффекты обеих молекул обусловлены прямым взаимодействием двух белков, что должно происходить преимущественно внутри клеток. Согласно настоящему изобретению, термин «синуклеопатия» включает все нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся аномальными скоплениями синуклеина. Несколько нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь телец Леви (БТЛ), диффузную болезнь телец Леви (ДБТЛ), деменцию с тельцами Леви (ДТП), парксинсонизм с деменцией (БПД), множественную системную атрофию (МСА) и нейродегенерацию I типа с накоплением железа в головном мозге (НДНЖ I типа), объединены под названием синуклеопатии.

«Симптомы синуклеопатии» согласно употреблению в данном документе означают те симптомы синуклеопатии, в частности болезни Паркинсона, которые касаются двигательных и «немоторных» функций у больного, страдающего вышеуказанным заболеванием. «Двигательные симптомы» включают тремор в покое, брадикинезию, ригидность, нарушения равновесия, сгорбленную позу, дистонию, повышенную утомляемость, нарушения мелких движений и их координации, грубые нарушения координации, скудость движений (уменьшенный размах рук), акатизию, расстройства речи, такие как тихий голос или неразборчивая речь, вызванная отсутствием мышечного контроля, утрату выражения лица, или «лицо-маска», микрографию, трудности при глотании, нарушения половой функции, слюнотечение и т.д. «Немоторные» симптомы включают боль, деменцию или спутанность сознания, нарушения сна, запоры, кожные болезни, депрессию, страх или тревожность, нарушения памяти или заторможенность мышления, нарушения мочеиспускания, повышенную утомляемость и ноющие боли, потерю энергии, навязчивое поведение, судороги и т.д.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, синуклеопатию выбирают из группы, включающей болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, множественную системную атрофию и нейродегенерацию с накоплением железа в головном мозге. Особенно предпочтительна болезнь Паркинсона.

Другой аспект настоящего изобретения относится к пептиду, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности, которую выбирают из группы, содержащей IRWDTP (C), VRWDVYP (C), IRYDAPL (C), IRYDMAG (C), IRWDTSL (C), IRWDQP (C), IRWDG (C), IRWDGG (C), EVWHRHQ (C), ERWHEKH (C), EVWHRLQ (C), ELWHRYP (C), ELWHRAF (C), ELWHRA (C), EVWHRG (C), EVWHRH (C), ERWHEK (C), QDFRHY (C), SEFKHG (C), TSFRHG (C), TSVFRH (C), TPFRHT (C), SQFRHY (C), LMFRHN (C), SAFRHH (C), LPFRHG (C), SHFRHG (C), ILFRHG (C), QFKHDL (C), NWFPHP (C), EEFKYS (C), NELRHST (C), GEMRHQP (C), DTYFPRS (C), VELRHSR (C), YSMRHDA (C), AANYFPR (C), SPNQFRH (C), SSSFFPR (C), EDWFFWH (C), SAGSFRH (C), QVMRHHA (C), SEFSHSS (C), QPNLFYH (C), ELFKHHL (C), TLHEFRH (C), ATFRHSP (C), APMYFPH (C), TYFSHSL (C), HEPLFSH (C), SLMRHSS (C), EFLRHTL (C), ATPLFRH (C), QELKRYY (C), THTDFRH (C), LHIPFRH (C), NELFKHF (C), SQYFPRP (C), DEHPFRH (C), MLPFRHG (C), SAMRHSL (C), TPLMFWH (C), LQFKHST (C), ATFRHST (C), TGLMFKH (C), AEFSHWH (C), QSEFKHW (C), AEFMHSV (C), ADHDFRH (C), DGLLFKH (C), IGFRHDS (C), SNSEFRR (C), SELRHST (C), THMEFRR (C), EELRHSV (C), QLFKHSP (C), YEFRHAQ (C), SNFRHSV (C), APIQFRH (C), AYFPHTS (C), NSSELRH (C), TEFRHKA (C), TSTEMWH (C), SQSYFKH (C), (C) SEFKH, SEFKH (C), (C) HEFRH и HEFRH (C). Как указано путем использования скобок, пептиды настоящего изобретения могут содержать или не содержать остаток цистеина на С- или N-конце. Вследствие этого в объем настоящего изобретения также входят следующие аминокислотные последовательности: IRWDTP, VRWDVYP, IRYDAPL, IRYDMAG, IRWDTSL, IRWDQP, IRWDG, IRWDGG, EVWHRHQ, ERWHEKH, EVWHRLQ, ELWHRYP, ELWHRAF, ELWHRA, EVWHRG, EVWHRH, ERWHEK, QDFRHY, SEFKHG, TSFRHG, TSVFRH, TPFRHT, SQFRHY, LMFRHN, SAFRHH, LPFRHG, SHFRHG, ILFRHG, QFKHDL, NWFPHP, EEFKYS, NELRHST, GEMRHQP, DTYFPRS, VELRHSR, YSMRHDA, AANYFPR, SPNQFRH, SSSFFPR, EDWFFWH, SAGSFRH, QVMRHHA, SEFSHSS, QPNLFYH, ELFKHHL, TLHEFRH, ATFRHSP, APMYFPH, TYFSHSL, HEPLFSH, SLMRHSS, EFLRHTL, ATPLFRH, QELKRYY, THTDFRH, LHIPFRH, NELFKHF, SQYFPRP, DEHPFRH, MLPFRHG, SAMRHSL, TPLMFWH, LQFKHST, ATFRHST, TGLMFKH, AEFSHWH, QSEFKHW, AEFMHSV, ADHDFRH, DGLLFKH, IGFRHDS, SNSEFRR, SELRHST, THMEFRR, EELRHSV, QLFKHSP, YEFRHAQ, SNFRHSV, APIQFRH, AYFPHTS, NSSELRH, TEFRHKA, TSTEMWH, SQSYFKH, (C)SEFKH, SEFKH, HEFRH и HEFRH.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения пептид связан с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы.

Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической форме, предпочтительно вакцине, содержащей по крайней мере один пептид согласно настоящему изобретению. Вышеуказанная дозированная фармацевтическая форма может использоваться для лечения субъектов, страдающих β-амилоидозами, включая болезнь Альцгеймера, или профилактики образования бляшек Аβ у субъекта для замедления развития β-амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими рисунками и примерами, однако не налагающих каких-либо ограничений.

Фиг.1 отображает моноклональное антитело MV-001 к специфическим пептидам и рекомбинантным белкам;

Фиг.2 отображает связывание моноклонального антитела MV-003 со специфическими пептидами и рекомбинантными белками;

Фиг.3 отображает связывание моноклонального антитела MV-004 со специфическими пептидами и рекомбинантными белками;

Фиг.4 отображает типичные анализы связывания с мимотопами В-амилоида и укороченных с N-конца и(или) посттрансляционно модифицированных фрагментов β-амилоида;

Фиг.5 отображает типичные анализы связывания с мимотопами В-амилоида и укороченных с N-конца и(или) посттрансляционно модифицированных фрагментов β-амилоида;

Фиг.6 отображает примеры характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами (введенный пептид/посторонний пептид);

Фиг.7 отображает примеры характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами против фрагментов бета-амилоида;

Фиг.8 отображает примеры характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами против полноразмерного АМО/42.

Фиг.9 отображает области, покрытые бляшками амилоида. Tg2576 вводили 6-кратно с вакцинами из мимотопов, где в качестве адъюванта использован гидроксид алюминия, путем подкожного введения с месячными интервалами. Контрольные мыши получали только фосфатно-солевой буфер с гидроксидом алюминия. Области, покрытые бляшками амилоида, представлены в виде процента от контрольной группы. Gr1 … контрольная группа; Gr2 … получившие р4381; Gr3 … получившие р4390; Gr4 … получившие р4715

Фиг.10 отображает области, покрытые бляшками амилоида. Tg2576 6-кратно вводили вакцины AFFITOPE, где в качестве адъюванта использован гидроксид алюминия, путем подкожного введения с месячными интервалами. Контрольные мыши получали только фосфатно-солевой буфер с гидроксидом алюминия. Области, покрытые бляшками амилоида, представлены в виде процента от контрольной группы. Gr1 … контрольная группа; Gr2 … получившие р4395.

Примеры

Методики

Антитела, использованные для идентификации мимотопов согласно настоящему изобретению, выявляют аминокислотные последовательности - производные человеческого Aβ, но не связываются с полноразмерным человеческим БПА. Выявленные последовательности включают EFRHDS (=оригинальный эпитоп аа3-8 Аβ), p(E)FRHDS (=оригинальный эпитоп модифицированного аа3-8 Aβ), EVHHQK (=оригинальный эпитоп aa11-16 Aβ). Антитело может быть моноклональным или поликлональным антителом или какой-либо частью антитела или его производным; единственное условие - эта молекула антитела должна специфически распознавать по крайней мере один из вышеупомянутых эпитопов (производных человеческого Aβ), но не связываться с полноразмерным человеческим БПА.

Мимотопы идентифицированы и дополнительно исследованы с помощью таких моноклональных антител и библиотек пептидов.

Пример 1: Получение моноклональных антител для специфического распознавания β-амилоида и укорочениях с N-конца и(или) лосттрансляционно модифицированных фрагментов β-амилоида.

Пример 1а: Получение моноклонального антитела MV-001

Создано моноклональное антитело, полученное в эксперименте Alz-5 с гибридизацией: В эксперименте Alz-5 мышей С57/В16 многократно иммунизировали оригинальным эпитопом Aβ DAEFRHDSGYC, связанным с гемоцианином фиссуреллы и гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. Специфичная для пептида р4371 антител о продуцирующая гибридома выявлена с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (плашки для твердофазного иммуноферментного анализа, покрытые пептидами р1253 и р4371). Человеческий Аβ 40/42 (рекомбинантный белок) использовали в качестве положительного контроля: включены гибридомы, распознающие рекомбинантный белок, иммобилизованный на плашках для твердофазного иммуноферментного анализа, так как они специфически связывают и пептид, и полноразмерный Аβ. P1454 (человеческий Aβ 33-40) использовали в качестве пептида для отрицательного контроля. Кроме того, гибридомы исследовали на активность против р4373. Для дальнейшего получения антител использовали только гибридомы, не связывающие или не значимо связывающие р4373.

Клон гибридомы (MV-001 (внутреннее наименование 824; IgG1) очищали и анализировали на специфическое выявление р1253, р4371, р4373, р1454 и АВ. MV-001 распознавало введенный эпитоп (р1253), а также специфический эпитоп (р4371) и полноразмерный белок АВ (рекомбинантный белок; получен от Bachem AG, Бубендорф, Швейцария) в твердофазном иммуноферментном анализе. Однако оно не выявляло р1454 в твердофазном иммуноферментном анализе. Кроме того, антитела MV-001 в основном не распознавали пептид р4373, кодирующий пироглутаматный вариант Аβ 3-10 (титр в 30 раз ниже, чем титр оригинальных эпитопов).

Пример 1b: Получение моноклонального антитела MV-003

Создано моноклональное антитело, полученное в эксперименте Alz-16 с гибридизацией: В эксперименте Alz-16 мышей BalbC многократно иммунизировали эпитопом p(E)FRHDSC (р4373), связанным с гемоцианином фиссуреллы и гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. Специфичная для пептида р4373 антителопродуцирующая гибридома выявлена с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (плашки для твердофазного иммуноферментного анализа, покрытые пептидом р4373). р1253, р1454 и Aβ 40/42 использовали в качестве пептидов для отрицательного контроля. Кроме того, гибридомы исследовали на активность против р4371. Для дальнейшего получения антител, чтобы гарантировать специфичность к пироглутамату, использовали только гибридомы, не связывающие или не значимо связывающие р4371.

Клон гибридомы (MV-003 (внутреннее наименование D129; IgG1) очищали и анализировали на специфическое выявление р1253, р4371, р4373, р1454 и Аβ соответственно. MV-003 распознавала введенный эпитоп (р4373), но не распознавало р1454, р1253 и полноразмерный белок Аβ (рекомбинантный белок; получен от Bachem AG, Бубендорф, Швейцария) в твердофазном иммуноферментном анализе. Кроме того, антитела MV-003 в основном не распознавали пептид р4371, кодирующий нормальный вариант Аβ 3-10 (титр в 15 раз ниже, чем титр оригинального эпитопа).

Пример 1 с: Получение моноклонального антитела. MV-004

Создано моноклональное антитело, полученное в эксперименте Alz-15 с гибридизацией: В эксперименте Alz-15 мышей BalbC многократно иммунизировали эпитопом EVHHQKC (р4372), связанным с гемоцианином фиссуреллы и гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. Специфичная для пептида р4372 антител о продуцирующая гибридома выявлена с помощью твердо фазного иммуноферментного анализа (плашки для твердофазного иммуноферментного анализа, покрытые пептидом р4372). Р4376, р4378, р1454 и Аβ 40/42 использовали в качестве пептидов для отрицательного контроля. Для дальнейшего получения антител, чтобы гарантировать специфичность к свободному N-концу в положении aa11, использовали только гибридомы, не связывающие или не значимо связывающие р4376 и р4378.

Клон гибридомы (MV-004 (внутреннее наименование В204; IgG1) очищали и анализировали на специфическое выявление р4372, р4376, р4378, р1454 и Aβ соответственно. MV-004 распознавало введенный эпитоп (р4372), но не распознавало р1454, р4376 и р4378, а также полноразмерный белок Аβ (рекомбинантный белок; получен от Bachem AG, Бубендорф, Швейцария) в твердофазном иммуноферментном анализе. Отсутствие реакции с р4376 и р4378 указывает на высокую специфичность к свободному N-концу в положении aa11 в укороченном Аβ.

Пример 2: Фаговое отображение, твердофазныи иммуноферментный анализ связывания и торможения in vitro

Библиотеки фагового отображения, использованные в примере, включают: Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (библиотека 7-мерных линейных). Фаговое отображение выполнено согласно инструкции производителя (http://www.neb.com/).

После 2 или 3 последовательных циклов пэннинга собирали клоны отдельных фагов и проводили твердофазный иммуноферментный анализ с надосадочной жидкостью фагов на плашках, покрытых антителом, которое использовалось для процедуры пэннига. Клоны фагов, которые давали положительный результат в этом твердофазном иммуноферментном анализе (сильный сигнал мишени, но отсутствие сигнала неспецифического контроля), подвергали секвенированию. По последовательностям ДНК определяли последовательности пептидов. Эти пептиды синтезировали и исследовали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа связывания и торможения. Кроме того, создавали некоторые новые мимотопы путем комбинирования данных о последовательностях мимотопов, обнаруженных при скрининге, для идентификации консенсусной последовательности для вакцинации мимотопами.

1. Анализ связывания in vitro (твердофазный иммуноферментный анализ)

Пептиды, полученные с помощью фагового отображения, а также их варианты связывали с бычьим сывороточным альбумином и фиксировали на плашках для твердофазного иммуноферментного анализа (1 мкмоль; как указано соответствующими значениями), а затем инкубировали с моноклональным антителом, которое использовали для процедуры скрининга для анализа связывающей способности идентифицированных пептидов.

2. Анализ торможения in vitro (твердофазный иммуноферментный анализ)

Различные количества пептидов (концентрации в пределах от 10 мкг до 0,08 мкг; серийный разведения), полученные с помощью фагового отображения, инкубировали с моноклональным антителом, которое использовали в процедуре скрининга. Пептиды, уменьшающие последующее связывание антитела с оригинальным эпитопом, нанесенным на плашки для твердофазного иммуноферментного анализа, считали в том анализе ингибирующими.

Пример 3: Исследование мимотопов in vivo: анализ иммуногенности и перекрестной реактивности

1. Исследование мимотопов in vivo

Ингибирующие, а также неингибирующие пептиды связывали с гемоцианином фиссуреллы и вводили мышам (мыши дикого типа С57/В16; подкожное введение в бедро) вместе с соответствующим адъювантом (гидроксид алюминия). Животных вакцинировали 3-6 раз с двухнедельными интервалами и сыворотку брали также каждые 2 недели. В каждой пробе сыворотки определяли титры антител к введенным пептидам, а также титры антител к посторонним пептидам. Кроме того, определяли титры антител к рекомбинантному человеческому белку Aβ и к оригинальным пептидам соответственно. Как правило, сыворотки анализировали с использованием реакции с пептидами, связанными с бычьим сывороточным альбумином, и рекомбинантными полноразмерными белками, иммобилизованными на плашках для твердофазного иммуноферментного анализа. Титры определяли, используя специфические антитела к мышиному IgG. Подробные результаты приведены на фиг.6, 7 и 8 соответственно.

2. Результаты

2.1. Идентификация специфических моноклональных антител (мАТ), направленных против укороченных с N-конца и модифицированных форм Аβ:

На фиг.1 отображены характеристики моноклонального антитела MV-001 (внутреннее наименование 824; IgG1), полученного в эксперименте Alz-5, демонстрирующие специфичность к полноразмерному Аβ и Аβ, укороченному в положении Е3.

На фиг.2 отображены характеристики моноклонального антитела MV-003 (внутреннее наименование D129; IgG1), полученного в эксперименте Alz-16, демонстрирующие специфичность к укороченному Аβ и Аβ, посттрансляционно модифицированному в положении р(Е)3.

На фиг.3 отображены характеристики моноклонального антитела MV-004 (внутреннее наименование В204; IgG1), полученного в эксперименте Alz-15, демонстрирующие специфичность к Aβ, укороченному в положении Е11.

2.2. Скрининг специфическими мАТ, направленными против укороченных с N-конца и модифицированных форм Аβ:

2.2.1. Библиотека фагового отображения Ph.D. 7

2.2.1.1. Скрининг моноклональным антителом к р4373

Восемь последовательностей идентифицированы путем скрининга библиотек фагового отображения PhD 7 в этом скрининге: В таблице 1А суммированы идентифицированные пептиды и их связывающая способность в сравнении с оригинальным эпитопом.

2.2.1.2. Скрининг моноклональным антителом к р4372

Девять последовательностей идентифицированы путем скрининга библиотек фагового отображения PhD 7 в этом скрининге: В таблице 1 В суммированы идентифицированные пептиды и их связывающая способность в сравнении с оригинальным эпитопом.

2.2.1.3. Скрининг моноклональным антителом к р4371

Семьдесят одна последовательность идентифицирована путем скрининга библиотек фагового отображения PhD 7 и PhD12 в этом скрининге: В таблице 1C суммированы идентифицированные пептиды и их связывающая способность в сравнении с оригинальным эпитопом.

Таблица 1А Связывание мимотопов с родительским антителом MV-003 Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Последовательность Связывающая способность р4395 1 IRWDTPC 2 р4396 2 VRWDVYPC 1 р4397 3 IRYDAPLC 1 р4399 4 IRYDMAGC 1 р4728 5 IRWDTSLC 3 р4756 6 IRWDQPC 3 р4792 7 IRWDGC 1 р4793 8 IRWDGGC 2

Условные обозначения в таблице 1А: связывающая способность обозначена одним из следующих шифров: 1:Х означает коэффициент разведения родительского АВ.

Шифр связывания   ОД ½ макс. 1:Х 0 связывание отсутствует :0 1 слабое связывание :<16000 2 среднее связывание :16-60000 3 сильное связывание :>60000

Таблица 1В Связывание мимотопов с родительским антителом MV-004 Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Последовательность Связывающая способность р4417 9 EVWHRHQC 2 р4418 10 ERWHEKHC 3 р4419 11 EVWHRLQC 3 р4420 12 ELWHRYPC 2 р4665 13 ELWHRAFC 2 р4786 14 ELWHRAC 1 р4788 15 EVWHRGC 1 р4789 16 EVWHRHC 1 р4790 17 ERWHEKC 1

Условные обозначения в таблице 1 В: связывающая способность обозначена одним из следующих шифров: 1:Х означает коэффициент оазведения оодительского АВ.

Шифр связывания   ОД ½ макс. 1:Х 0 связывание отсутствует :0 1 слабое связывание :<24000 2 среднее связывание :24-96000 3 сильное связывание :>96000

Таблица 1C Связывание мимотопов с родительским антителом MV-001 Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Последовательность Связывающая способность р4380 18 QDFRHYC 2 р4381 19 SEFKHGC 3 р4382 20 TSFRHGC 2 р4383 21 TSVFRHC 3 р4384 22 TPFRHTC 2 р4385 23 SQFRHYC 2 р4386 24 LMFRHNC 3 р4387 25 SAFRHHC 2 р4388 26 LPFRHGC 2 р4389 27 SHFRHGC 2 р4390 28 ILFRHGC 3 р4391 29 QFKHDLC 2 р4392 30 NWFPHPC 1 р4393 31 EEFKYSC 2 р4701 32 NELRHSTC 3 р4702 33 GEMRHQPC 3 р4703 34 DTYFPRSC 2 р4704 35 VELRHSRC 2 р4705 36 YSMRHDAC 2 р4706 37 AANYFPRC 2 р4707 38 SPNQFRHC 3 р4708 39 SSSFFPRC 2 р4709 40 EDWFFWHC 1 р4710 41 SAGSFRHC 3 р4711 42 QVMRHHAC 2 р4712 43 SEFSHSSC 3 р4713 44 QPNLFYHC 1 р4714 45 ELFKHHLC 3 р4715 46 TLHEFRHC 3 р4716 47 ATFRHSPC 2 р4717 48 APMYFPHC 2 р4718 49 TYFSHSLC 2 р4719 50 HEPLFSHC 1 р4721 51 SLMRHSSC 2 р4722 52 EFLRHTLC 3 р4723 53 ATPLFRHC 3 р4724 54 QELKRYYC 1 р4725 55 THTDFRHC 3 р4726 56 LHIPFRHC 3 р4727 57 NELFKHFC 2 р4729 58 SQYFPRPC 2 р4730 59 DEHPFRHC 3 р4731 60 MLPFRHGC 2

р4732 61 SAMRHSLC 2 р4733 62 TPLMFWHC 1 р4734 63 LQFKHSTC 2 р4735 64 ATFRHSTC 2 р4736 65 TGLMFKHC 2 р4737 66 AEFSHWHC 2 р4738 67 QSEFKHWC 3 р4739 68 AEFMHSVC 2 р4740 69 ADHDFRHC 3 р4741 70 DGLLFKHC 3 р4742 71 IGFRHDSC 2 р4743 72 SNSEFRRC 3 р4744 73 SELRHSTC 3 р4745 74 THMEFRRC 3 р4746 75 EELRHSVC 3 р4747 76 QLFKHSPC 3 р4748 77 YEFRHAQC 3 р4749 78 SNFRHSVC 3 р4750 79 APIQFRHC 3 р4751 80 AYFPHTSC 2 р4752 81 NSSELRHC 3 р4753 82 TEFRHKAC 3 р4754 83 TSTEMWHC 1 р4755 84 SQSYFKHC 3 р4800 85 CSEFKH 3 р4801 86 SEFKHC 3 р4802 87 CHEFRH 3 р4803 88 HEFRHC 3

Условные обозначения в таблице 1C: связывающая способность обозначена одним из следующих шифров: 1:Х означает коэффициент разведения родительского АВ

Шифр связывания   ОД ½ макс. 1:Х 0 связывание отсутствует :0 1 слабое связывание :<4000 2 среднее связывание :4000-20000

3 сильное связывание :>20000

2.3. Исследование in vitro характеристик мимотопов, идентифицированных при скрининге библиотек фагового отображения с помощью моноклональных антител к укороченным с N-конца и модифицированным формам Аβ:

На фиг.4 и 5 представлены репрезентативные примеры анализов связывания и торможения, использованных для исследования характеристик мимотопов in vitro. Полученные данные суммированы в таблицах 1 и 2 соответственно.

Мимотопы MV-003: Из 8 представленных последовательностей 6 последовательностей тормозят специфичное к p(E)3-7Aβ моноклональное антитело в экспериментах с конкурентным связыванием in vitro: Идентифицированы еще 2 последовательности, которые не тормозят связывание моноклонального антитела в экспериментах с конкурентным торможением in vitro, но сохраняют связывающую способность родительского антитела (таблица 2А).

Мимотопы MV-004: Все 9 представленных последовательностей тормозят связывание моноклонального антитела, специфически связывающегося с N-концом укороченного в положении E11 Аβ в экспериментах с конкурентным связыванием in vitro: (таблица 2В).

Мимотопы MV-001: Из 71 представленной последовательности 27 последовательностей тормозят связывание моноклонального антитела, специфичного к Аβ, укороченного в положении Е3, в экспериментах с конкурентным связыванием in vitro: Идентифицированы еще 44 последовательности, которые не тормозят связывание моноклонального антитела в экспериментах с конкурентным связыванием in vitro, но сохраняют связывающую способность родительского антитела (таблица 2С).

Таблица 2. Мимотопы, описанные в настоящем изобретении, давшие положительные результаты в анализах торможения

Таблица 2А Мимотопы MV-003 Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Последовательность Ингибирующая способность р4395 1 IRWDTPC 1 р4397 3 IRYDAPLC 1 р4728 5 IRWDTSLC 2 р4756 6 IRWDQPC 1 р4792 7 IRWDGC 1 р4793 8 IRWDGGC 1

Условные обозначения в таблице 2А: ингибирующая способность обозначена одним из следующих шифров:

Слабое торможение означает, что для уменьшения связывания AT требуется больше пептида, чем оригинального эпитопа; сильное торможение означает, что для уменьшения связывания AT требуются одинаковые количества пептидов - мимотопа и оригинального пептида. Мимотопы сравнивают с оригинальным пептидом в качестве стандарта. Для расчета конкурентной способности в сравнении с оригинальным пептидом использовано ОД при 10 мкг пептида, использованного в данном анализе.

Шифр конкурентной способности   0 Отсутствие торможения (ОД при 10 мкг пептида больше чем в 12 раз, чем у оригинального пептида) 1 Слабее, чем у оригинального пептида (ОД в 10 мкг пептида в 12 раз меньше, чем у оригинального пептида) 2 Сильное торможение (как у оригинального пептида; ОД в 10 мкг пептида в 5 раз меньше, чем у оригинального пептида)

Таблица 2В Мимотопы MV-004 Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Последовательность Ингибирующая способность р4417 9 EVWHRHQC 1 р4418 10 ERWHEKHC 2 р4419 11 EVWHRLQC 2 р4420 12 ELWHRYPC 1 р4665 13 ELWHRAFC 2 р4786 14 ELWHRAC 1 р4788 15 EVWHRGC 1 р4789 16 EVWHRHC 1 р4790 17 ERWHEKC 2

Условные обозначения в таблице 2В: ингибирующая способность обозначена одним из следующих шифров:

Слабое торможение означает, что для уменьшения связывания AT требуется больше пептида, чем оригинального эпитопа; сильное торможение означает, что для уменьшения связывания AT требуются одинаковые количества пептидов - мимотопа и оригинального пептида. Мимотопы сравнивают с оригинальным пептидом в качестве стандарта. Для расчета конкурентной способности в сравнении с оригинальным пептидом использовано ОД при 10 мкг пептида, использованного в данном анализе.

Шифр конкурентной способности   0 Отсутствие торможения (ОД при 10 мкг пептида больше чем в 5 раз, чем у оригинального пептида) 1 Слабее, чем у оригинального пептида (ОД в 10 мкг пептида в 5 раз меньше, чем у оригинального пептида) 2 Сильное торможение (как у оригинального пептида; ОД в 10 мкг пептида в 2 раз меньше, чем у оригинального пептида)

Таблица 2С Мимотопы MV-001 Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Последовательность Ингибирующая способность р4380 18 QDFRHYC 1 р4381 19 SEFKHGC 1 р4382 20 TSFRHGC 1 р4383 21 TSVFRHC 1 р4384 22 TPFRHTC 1 р4385 23 SQFRHYC 1 р4386 24 LMFRHNC 1 р4387 25 SAFRHHC 1 р4388 26 LPFRHGC 1 р4389 27 SHFRHGC 1 р4390 28 ILFRHGC 1 р4391 29 QFKHDLC 1 р4392 30 NWFPHPC 1 р4393 31 EEFKYSC 1 р4707 38 SPNQFRHC 1 р4715 46 TLHEFRHC 2 р4725 55 THTDFRHC 1 р4730 59 DEHPFRHC 1 р4738 67 QSEFKHWC 1 р4740 69 ADHDFRHC 1 р4741 70 DGLLFKHC 1 р4746 75 EELRHSVC 1 р4753 82 TEFRHKAC 2 р4800 85 CSEFKH 2 р4801 86 SEFKHC 1 р4802 87 CHEFRH 2 р4803 88 HEFRHC 2

Условные обозначения в таблице 1C: ингибирующая способность обозначена одним из следующих шифров:

Слабое торможение означает, что для уменьшения связывания AT требуется больше пептида, чем оригинального эпитопа; сильное торможение означает, что для уменьшения связывания AT требуются одинаковые количества пептидов - мимотопа и оригинального пептида. Мимотопы сравнивают с оригинальным пептидом в качестве стандарта. Для расчета конкурентной способности в сравнении с оригинальным пептидом использовано ОД при 10 мкг пептида, использованного в данном анализе.

Шифр конкурентной способности   0 Отсутствие торможения (ОД при 10 мкг пептида больше чем в 3 раза, чем у оригинального пептида) 1 Слабее, чем у оригинального пептида (ОД в 10

  мкг пептида в 3 раза меньше, чем у оригинального пептида) 2 Сильное торможение (как у оригинального пептида; ОД в 10 мкг пептида в 2 раза меньше, чем у оригинального пептида)

Таблица 3 Пептиды - не мимотопы Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Последовательность р1253 89 DAEFRHDSGYC р4371 90 EFRHDS-C р4372 91 EVHHQK-C р4373 92 p(E)FRHDS-C р4374 93 p(E)VHHQKLVFC р4376 94 GYEVHHQKC р4377 95 EVHHQKLVFC р4378 96 C-EVHHQKLVFF р1454 97 CGLMVGGVV Aβ1-40 98 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII GLMVGGVV Aβ1-42 99 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAII GLMVGGVVIA sAPPalpha 100 Альфа-секретаза давала продукт расщепления - производное человеческого БПА (gi:112927)

2.4. Исследование In vitro мимотопов, идентифицированных при скрининге библиотек фагового отображения с помощью моноклонального антитела к укороченным с N-конца и модифицированным формам Аβ:

Самок мышей С57/bl6, 5-6 на группу, подкожно иммунизировали 30 мкг пептида, связанного с гемоцианином фиссуреллы. В контрольных группах соответственно вводили оригинальный эпитоп, связанный с гемоцианином фиссуреллы. В качестве адъюванта применяли гидроксид алюминия (всегда 1 мг на одну мышь). Все введенные пептиды проявили способность специфично связываться с моноклональными антителами, хотя некоторые пептиды не тормозили связывание оригинального эпитопа с родительским антителом in vitro (в анализах торможения in vitro). Для измерения титра антител проводили твердофазный иммуноферментный анализ с сыворотками мышей после каждой вакцинации с двухнедельными интервалами (см. Фиг.6 и 7 соответственно). Лунки на плашке для твердофазного иммуноферментного анализа покрывали мимотопом, связанным с бычьим сывороточным альбумином, и посторонним пептидом, связанным с бычьим сывороточным альбумином (отрицательный контроль). Положительный контроль проводили с помощью реакции родительского антитела с соответствующим конъюгатом мимотопа с бычьим сывороточным альбумином. Детекцию выполняли с использованием IgG к мышиным антителам. Кроме того, рекомбинантные белки иммобилизовывали на плашках для твердофазного иммуноферментного анализа и проводили соответствующие реакции с сыворотками. На Фиг.6-8 отображены репрезентативные примеры анализов, использованных для исследования мимотопов in vivo.

На фиг.6 приведены примеры исследования характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами, путем анализа иммунного ответа против введенного пептида и постороннего пептида, содержащего отличающуюся последовательность. Во всех трех представленных примерах оригинальные эпитопы и мимотопы вызывают иммунный ответ против введенных пептидов, но не вызывают соответствующий иммунный ответ против отличающейся последовательности (р1454).

Как пример мимотопов MV-003, на фиг.6A отображены оригинальный эпитоп р4373 и мимотопы р4395, р4396, р4397 и р4399. Все вакцины вызывали схожий иммунный ответ на соответствующие мимотопы. Ни у животных, вакцинированных оригинальным эпитопом р4373, ни у животных, вакцинированных мимотопами р4395, р4396, р4397 или р4399, не выявлялись значимые титры антител к постороннему пептиду (в 11-25 раз меньше, чем введенные пептиды).

Как пример мимотопов MV-004, на фиг.6В отображены оригинальный эпитоп р4372 и мимотопы р4417, р4418, р4419 и р4420. Все вакцины вызывали схожий иммунный ответ на соответствующие мимотопы. Ни у животных, вакцинированных оригинальным эпитопом р4372, ни у животных, вакцинированных мимотопами р4417, р4418, р4419 и р4420, не выявлялись значимые титры антител к постороннему пептиду р1454 (в 20-80 раз меньше, чем на введенные пептиды).

Как пример мимотопов MV-001, на фиг.6С отображены оригинальный эпитоп р4371 и мимотопы р4381, р4382 и р4390. Все вакцины вызывали схожий иммунный ответ на соответствующие мимотопы. Ни у животных, вакцинированных оригинальным эпитопом р4371, ни у животных, вакцинированных мимотопами р4381, р4382 и р4390, не выявлялись значимые титры антител к постороннему пептиду р1454 (больше чем в 10 раз меньше, чем введенные пептиды).

На фиг.7 приведены примеры исследования характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами, направленного на соответствующий оригинальный эпитоп родительского антитела, а также пептидов - производных других форм укороченных форм Aβ.

Как пример мимотопов MV-003, на фиг.7 отображены оригинальный эпитоп р4373 и мимотопы р4395, р4396, р4397 и р4399. Три четверти мимотопов вызывали выявляемый иммунный ответ на оригинальный эпитоп р4373. Схожее явление можно выявить, анализируя перекрестную реактивность с немодифицированной формой, такой как представленный р4371. Вакцина с оригинальным эпитопом р4373 и две четверти вакцин с мимотопами приводят к появлению титров соответствующих антител к р4371. Удивительно, что мимотопы, отобранные антителом MV-003, которое специфически связывается с р4373, также вызывают перекрестную иммунную реактивность с немодифицированной формой оригинального эпитопа.

Как пример мимотопов MV-004, на фиг.7В отображены оригинальный эпитоп р4372 и мимотопы р4417, р4418, р4419 и р4420. Три четверти вакцин с мимотопами вызывали выявляемый иммунный ответ на оригинальный эпитоп р4372.

Как пример мимотопов MV-001, на фиг.7С отображены оригинальный эпитоп р4371 и мимотопы р4381, р4382 и р4390. Все отображенные вакцины с мимотопами вызывают выявляемый иммунный ответ на оригинальный эпитоп р4371. Явление, схожее с описанным в отношении мимотопов - производных MV-003, можно выявить, анализируя перекрестную реактивность в отношении пироглутаматной формы, такой как представленный р4373. Вакцина с оригинальным эпитопом р4371 и все вакцины с мимотопами приводят к появлению значимых титров антител к р4373. Как ни странно, но мимотопы, отобранные MV-001, которое специфически связывается с р4371, вызывают иммунологическую перекрестную реактивность, более выраженную в отношении модифицированной формы оригинального эпитопа, чем оригинального эпитопа или родительского антитела. Таким образом, эти мимотопы могут (но необязательно будут) удивительным образом вызывать более широкую иммунологическую реактивность, чем родительское антитело и могут использоваться для целенаправленного воздействия на более обширный ряд форм Аβ.

Фиг.8 отображает примеры исследования характеристик иммунного ответа на полноразмерный Аβ in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами. Как ни странно, но мимотопы, отобранные с использованием MV-001 и MV-003, вызывают перекрестную реактивность не только с укороченными или модифицированными короткими эпитопами, использованными для получения антител, но также вызывают и с полноразмерными, немодифицированными формами Аβ с той же эффективностью, что и оригинальная последовательность, и даже эффективнее, чем р4371/р4373. В отношении оригинального эпитопа MV-002, а также идентифицированных мимотопов, такая перекрестная реактивность не выявлялась, что указывают на перенос специфичности антитела на свободный N-конец немодифицированных Аβ 11 - 40/42. Таким образом, мимотопы, описанные в настоящем изобретении, являются оптимизированным кандидатами для вакцин, направленных против широкого спектра естественных форм пептидов Аβ, обнаруженных в головном мозге больных с БА. Эти формы включают, но не ограничиваются перечисленным, Аβ 1 - 40/42 и укороченные с N-конца формы, такие как Аβ 3 - 40/42 и Aβ (рЕ)3 - 40/42, а также немодифицированный Аβ 11 - 40/42 соответственно.

В таблицах 4 и 5 приведены дополнительные примеры иммунного ответа на полноразмерный Aβ, вызванного вакцинацией мимотопами, с использованием мимотопов - производных MV-001 и MV-003.

Таблица 4 Исследование характеристик мимотопов in vivo: MV-001 Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Выявление Аβ/укороченных/модифицированных форм р4381 19 + р4383 21 + р4385 23 + р4386 24 + р4390 28 + р4707 38 + р4714 45 + р4715 46 + р4725 55 + р4730 59 + р4738 67 + р4740 69 + р4748 77 + р4753 82 +

Все пептиды, перечисленные в таблице 4, вызывают специфические иммунологические реакции с полноразмерными и(или) укороченными и модифицированными формами АЕ>или их фрагментами.

Таблица 5 Исследование характеристик мимотопов in vivo: MV-003 Внутренний номер пептида Идентификационный номер последовательности Выявление Аβ/укороченных/модифицированных форм р4395 1 + р4396 2 + р4397 3 + р4399 4 +

Все пептиды, перечисленные в таблице 5, вызывают специфические иммунологические реакции с полноразмерными и(или) укороченными и модифицированными формами Аβ или их фрагментами.

2.5: Исследование характеристик мимотопов in vivo в отношении эффективности, проявляющейся уменьшением признаков модели болезни Альцгеймера, у трансгенных животных

Для изучения доклинической эффективности вакцин с мимотопами использовали модель БА у мышей Tg2576. У этой линии трансгенных мышей экспрессируется человеческий БПА, несущий двойную шведскую мутацию 670/671 в положении аа под контролем промотора белка приона хомячка (БПр), что ведет к суперэкспрессии этого белка. В настоящее время это самые широко применяющиеся модели БА в научных исследованиях. В модели Tg2576 воспроизводятся различные основные морфологические признаки БА, включая характерное отложение бляшек амилоида и астроцитоз. Как и все другие модельные системы БА, существующие на сегодняшний день, эта модель не отражает все кардинальные нейропатологические признаки БА.

Чтобы оценить, может ли лечение мимотопами предупреждать накопление Аβ в головном озге, мышам Tg2576 вводили подкожно 6 раз с месячными интервалами конюъгаты пептид-гемоцианин фиссуреллы, адсорбированный на гидроксиде алюминия (адъювант) или фосфатно-солевой буфер, адсорбированный на гидроксиде алюминия (обозначенный как ФСБ или контроль). В срок до 8 недель после последней иммунизации животных забивали, извлекали головной мозг и анализировали массу Аβ (патологические изменения, схожие с БА). Мышей забивали под глубокой анестезией. Затем извлекали головной мозг, фиксировали в 4% параформальдегиде и обезвоживали пошагово в серии растворов этилового спирта, а затем инкубировали в ксилене и заливали парафином. Головной мозг, залитый парафином, разрезали на срезы толщиной 7 мкм с помощью микротома, и срезы помещали на предметные стекла.

В качестве методики оценки патологии, схожей с БА, у животных Tg2576 мы анализировали относительную площадь, занятую отложениями амилоида в головном мозге леченых животных. Этот анализ проводили с помощью программы автоматического распознавания областей. Для идентификации бляшек срезы окрашивали моноклональным антителом (мАТ) 3А5 (специфичным к Аβ 40/42). Животных, леченых мимотопами, сравнивали с контрольными животными. Всех животных забивали в возрасте 13,5-14 месяцев. Для анализа выбирали 3 стекла на одно животное с препаратами коры головного мозга гиппокампа, окрашенными мАТ 3А5, а затем документировали с использованием системы Mirax (Zeiss). Для расчета площади, занятой бляшками амилоида, мы анализировали до четырех отдельных срезов на один препарат, и срезы, имеющие в тканях артефакты и аномальную интенсивность окрашивания, исключали после просмотра полученных изображений.

В отношении мимотопов - производных MV001 выполняли анализ площади по трем типичным кандидатам. Анализ выполняли после многократной вакцинации вакцинами с конъюгатом пептид-гемоцианин фиссуреллы. В контрольной группе выявлена средняя занятая относительная площадь 0,35%, а у животных, леченых мимотопами, 0,11, 0,14 и 0,22% соответственно. Это соответствует уменьшению после лечения мимотопами на 67% во 2-й группе, 60% уменьшение в 3-й группе и 36% в 4-й группе (см. Фиг.9).

Схожую картину можно обнаружить в отношении группы мимотопов - производных MV-003. Здесь приведен пример р4395. Как описано в отношении мимотопов - производных MV001, выполнен анализ площади, занятой бляшками амилоида после вакцинации пептидным конъюгатом. В контрольной группе выявлена средняя занятая относительная площадь 0,35%, а у животных, леченых мимотопами, 0,21%. Это соответствует уменьшению на 38% во 2-й группе, леченой мимотопами (см. Фиг.10).

Таким образом, эти данные четко указывают на благоприятный эффект вакцинации вакцинами с мимотопами при лечении модели БА у трансгенных животных.

Группа изобретений относится к медицине и касается применения по меньшей мере одного пептида, выбранного из группы, включающей SEFKHG(С), TLHEFRH(С), ILFRHG(С), TSVFRH(C), SQFRHY(С), LMFRHN(С), SPNQFRH(С), ELFKHHL(С), THTDFRH(С), DEHPFRH(С), QSEFKHW(С), ADHDFRH(С), YEFRHAQ(С) и TEFRHKA(С), для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера. Группа изобретений также касается вакцины, содержащей по меньшей мере один указанный пептид, предназначенной для индукции иммунного ответа, направленного против Аβ. Группа изобретений обеспечивает благоприятный эффект вакцинации вакцинами с мимотопами при лечении болезни Альцгеймера. 6 н. и 18 з.п. ф-лы, 3 пр., 10 ил., 5 табл.

1. Применение по меньшей мере одного пептида, выбранного из группы, включающей SEFKHG(С), TLHEFRH(С), ILFRHG(С), TSVFRH(C), SQFRHY(С), LMFRHN(С), SPNQFRH(С), ELFKHHL(С), THTDFRH(С), DEHPFRH(С), QSEFKHW(С), ADHDFRH(С), YEFRHAQ(С) и TEFRHKA(С), для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера.

2. Применение по п.1, при котором пептид связан с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы.

3. Применение по п.1, при котором пептид выпускают в фармацевтической форме для внутривенного, подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения.

4. Применение по п.1, при котором пептид выпускают в фармацевтической форме вместе с адъювантом, предпочтительно гидроксидом алюминия.

5. Применение по п.1, при котором пептид содержится в лекарственном средстве в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в частности, от 100 нг до 10 мкг.

6. Применение по меньшей мере одного пептида, выбранного из группы, включающей IRWDTP(C), VRWDVYP(C), IRYDAPL(С), IRYDMAG(С), IRWDTSL(C), IRWDQP(C), IRWDG(C) и IRWDGG(С), для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера.

7. Применение по п.6, при котором пептид связан с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы.

8. Применение по п.6, при котором пептид выпускают в фармацевтической форме для внутривенного, подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения.

9. Применение по п.6, при котором пептид выпускают в фармацевтической форме вместе с адъювантом, предпочтительно гидроксидом алюминия.

10. Применение по п.6, при котором пептид содержится в лекарственном средстве в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в частности, от 100 нг до 10 мкг.

11. Применение по меньшей мере одного пептида, выбранного из группы, включающей EVWHRHQ(С), ERWHEKH(С), EVWHRLQ(С), ELWHRYP(С), ELWHRAF(С), ELWHRA(С), EVWHRG(C), EVWHRH(C) и ERWHEK(С), предпочтительно EVWHRHQ(С), ERWHEKH(С), EVWHRLQ(С), ELWHRYP(С) и ELWHRAF(С), для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера.

12. Применение по п.11, при котором пептид связан с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы.

13. Применение по п.11, при котором пептид выпускают в фармацевтической форме для внутривенного, подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения.

14. Применение по п.11, при котором пептид выпускают в фармацевтической форме вместе с адъювантом, предпочтительно гидроксидом алюминия.

15. Применение по п.11, при котором пептид содержится в лекарственном средстве в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в частности, от 100 нг до 10 мкг.

16. Применение по меньшей мере одного пептида, выбранного из группы, включающей QDFRHY(С), SEFKHG(С), TSFRHG(C), TSVFRH(C), TPFRHT(С), SQFRHY(С), LMFRHN(С), SAFRHH(С), LPFRHG(С), SHFRHG(С), ILFRHG(С), QFKHDL(С), NWFPHP(С), EEFKYS(С), NELRHST(С), GEMRHQP(С), DTYFPRS(С), VELRHSR(С), YSMRHDA(С), AANYFPR(С), SPNQFRH(С), SSSFFPR(C), EDWFFWH(С), SAGSFRH(С), QVMRHHA(С), SEFSHSS(C), QPNLFYH(С), ELFKHHL(С), TLHEFRH(С), ATFRHSP(С), APMYFPH(С), TYFSHSL(С), HEPLFSH(С), SLMRHSS(С), EFLRHTL(С), ATPLFRH(С), QELKRYY(С), THTDFRH(С), LHIPFRH(С), NELFKHF(С), SQYFPRP(C), DEHPFRH(C), MLPFRHG(C), SAMRHSL(C), TPLMFWH(С), LQFKHST(С), ATFRHST(С), TGLMFKH(С), AEFSHWH(С), QSEFKHW(С), AEFMHSV(C), ADHDFRH(С), DGLLFKH(C), IGFRHDS(C), SNSEFRR(C), SELRHST(C), THMEFRR(C), EELRHSV(C), QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C), SNFRHSV(C), APIQFRH(C), AYFPHTS(C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMWH(C), SQSYFKH(C), (C)SEFKH, SEFKH(C), (C)HEFRH и HEFRH(C), для производства лекарственного средства для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера.

17. Применение по п.16, при котором пептид выбирают из группы, включающей QDFRHY(С), SEFKHG(С), TSFRHG(С), TSVFRH(C), TPFRHT(С), SQFRHY(С), LMFRHN(С), SAFRHH(С), LPFRHG(С), SHFRHG(С), ILFRHG(С), QFKHDL(С), NWFPHP(С), EEFKYS(С), SPNQFRH(С), TLHEFRH(С), THTDFRH(С), DEHPFRH(С), QSEFKHW(С), ADHDFRH(С), DGLLFKH(С), EELRHSV(С), TEFRHKA(С), (С)SEFKH, SEFKH(С), (С)HEFRH и HEFRH(С) предпочтительно SEFKHG(С), TSVFRH(C), SQFRHY(С), LMFRHN(С), ILFRHG(С), SPNQFRH(С), ELFKHHL(С), TLHEFRH(С), THTDFRH(С), DEHPFRH(С), QSEFKHW(С), ADHDFRH(С), YEFRHAQ(С), TEFRHKA(С).

18. Применение по п.16, при котором пептид связан с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы.

19. Применение по п.16, при котором пептид выпускают в фармацевтической форме для внутривенного, подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения.

20. Применение по п.16, при котором пептид выпускают в фармацевтической форме вместе с адъювантом, предпочтительно гидроксидом алюминия.

21. Применение по п.16, при котором пептид содержится в лекарственном средстве в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в частности, от 100 нг до 10 мкг.

22. Пептид, выбранный из группы, содержащей IRWDTP(C), VRWDVYP(С), IRYDAPL(С), IRYDMAG(С), IRWDTSL(С), IRWDQP(С), IRWDG(C), IRWDGG(C), EVWHRHQ(С), ERWHEKH(С), EVWHRLQ(С), ELWHRYP(С), ELWHRAF(С), ELWHRA(С), EVWHRG(С), EVWHRH(С), ERWHEK(С), QDFRHY(С), SEFKHG(С), TSFRHG(С), TSVFRH(C), TPFRHT(С), SQFRHY(С), LMFRHN(С), SAFRHH(С), LPFRHG(С), SHFRHG(С), ILFRHG(С), QFKHDL(С), NWFPHP(С), EEFKYS(С), NELRHST(С), GEMRHQP(С), DTYFPRS(С), VELRHSR(С), YSMRHDA(C), AANYFPR(С), SPNQFRH(С), SSSFFPR(C), EDWFFWH(C), SAGSFRH(C), QVMRHHA(С), SEFSHSS(C), QPNLFYH(C), ELFKHHL(C), TLHEFRH(C), ATFRHSP(C), APMYFPH(C), TYFSHSL(C), HEPLFSH(C), SLMRHSS(C), EFLRHTL(C), ATPLFRH(C), QELKRYY(C), THTDFRH(C), LHIPFRH(C), NELFKHF(C), SQYFPRP(C), DEHPFRH(C), MLPFRHG(C), SAMRHSL(C), TPLMFWH(С), LQFKHST(C), ATFRHST(C), TGLMFKH(C), AEFSHWH(C), QSEFKHW(C), AEFMHSV(C), ADHDFRH(C), DGLLFKH(C), IGFRHDS(C), SNSEFRR(C), SELRHST(C), THMEFRR(C), EELRHSV(C), QLFKHSP(C), YEFRHAQ(C), SNFRHSV(C), APIQFRH(C), AYFPHTS(C), NSSELRH(C), TEFRHKA(C), TSTEMWH(C), SQSYFKH(С), (C)SEFKH, SEFKH(С), (C)HEFRH и HEFRH(С), способный вызывать иммунный ответ, направленный против Аβ.

23. Пептид по п.22, связанный с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы.

24. Вакцина, содержащая по меньшей мере один пептид по п.22 или 23, предназначенная для индукции иммунного ответа, направленного против Аβ.