СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИКОПРОТЕИНА-Р ЛИНЕСТРЕНОЛОМ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2015 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для внедрения в практику фармаколога и клинического фармаколога с целью прогнозирования возможной принадлежности изучаемых лекарственных препаратов к субстратам мембранного белка - транспортера гликопротеина-Р (Pgp), а также использования линестренола в качестве положительного контроля пониженной активности Pgp при поиске веществ аналогичного действия.

Гликопротеин-Р (Pgp) представляет собой эффлюксный АТФ-зависимый белок-транспортер, участвующий в переносе субстратов из клетки, а также препятствующий их всасыванию в кишечнике [1]. Pgp локализован на мембране энтероцитов, в гепатоцитах, эпителиоцитах почечных канальцев и коры надпочечников, эндотелиоцитах гистогематических барьеров. Известно, что многие гормональные вещества, например половые стероиды, глюкокортикоиды, тиреоидные гормоны, способны модулировать функциональную активность и экспрессию Pgp [2, 3, 4, 5].

Известно, что для определения локализации Pgp в организме, а также обнаружения потенциальных субстратов белка-транспортера в качестве ингибиторов Pgp в настоящее время предложено значительное количество веществ, таких как верапамил, циклоспорин, кетоконазол, тариквидар, хинидин и др. [6, 7].

Известен способ моделирования состояния ингибирования функциональной активности Pgp верапамилом в дозе 9 мг/кг, предложенный в эксперименте на кроликах, для анализа участия его в фармакокинетике омепразола [8]. Но верапамил является препаратом с выраженным влиянием на сердечно-сосудистую систему: обладает гипотензивным действием, снижает ЧСС, т.е. применяется по строгим показаниям. Назначение его пациентам без данных показаний может приводить к выраженной гипотензии, брадикардии, AV-блокаде, сонливости, аллергическим реакциям и т.д. Кроме того, в присутствии более сильного ингибитора Pgp, например тариквидара, верапамил ведет себя как субстрат и проникает через гематоэнцефалический барьер [9].

Известен способ моделирования состояния селективного ингибирования функциональной активности Pgp в гематоэнцефалическом барьере с использованием тариквидара. Вещество применялся на культурах клеток с повышенной экспрессией гена MDR1 (человеческого) и Mdr1a (мышиного) [10] и на крысах линии Wistar Unilever в дозе 15 мг/кг с последующей оценкой проницаемости гематоэнцефалического барьера для субстратов белка-транспортера методом позитронно-эмиссионной томографии [9].

Известен способ моделирования состояния ингибирования функциональной активности Pgp циклоспорином, например, при оценке распределения, фармакокинетики и метаболизма глибенкламида [11]. В исследовании на ВИЧ-инфицированных взрослых добровольцах показано, что циклоспорин в дозе 4 мг/кг ингибирует Pgp Т-лимфоцитов крови. Однако циклоспорин не может использоваться в терапии ВИЧ-инфекции в качестве ингибитора Pgp из-за своих иммуносупрессорных свойств [12]. Также циклоспорин как ингибитор, применяемый в клинической практике, характеризуется значительной токсичностью [13], а именно нежелательным действием на печень, почки, желудочно-кишечный тракт, систему кроветворения, развитием аллергических реакций.

Известен способ моделирования состояния ингибирования функциональной активности Pgp кетоконазолом (400 мг один раз в день в течение 4 дней) на здоровых добровольцах [14]. Однако в исследовании Choo и соавт. [15] ингибирующее действие кетоконазола объясняется главным образом СУР3А-опосредованным ингибированием, и в меньшей степени влиянием на гликопротеин-Р. Кроме того, исследования на добровольцах должны проходить в соответствии с правилами Good clinical practices (GCP), они требуют получения разрешения в этическом комитете, госпитализации добровольцев в стационар для круглосуточного наблюдения за их состоянием и многократного забора крови через каждый час в течение всего периода действия лекарственного средства. Крысы как объект исследования (тест-система) не пригодны для оценки функциональной активности Pgp по фармакокинетике маркерных субстратов из-за невозможности многократного забора крови (в связи с малым ее количеством у данного животного).

Изучение ингибиторов Pgp в настоящее время проводится с помощью флуорометрического анализа с использованием кальцеин-АМ как субстрата Pgp и двух различных клеточных систем: L-MDR1 клеток (модель человеческого гликопротеина-Р) и эндотелиальных клеток капилляров свиного мозга (pBCECs, модель для гематоэнцефалического барьера). Обе клеточные системы пригодны для оценки ингибирующего действия препаратов на функционирование белка-транспортера [16]. Активно используется для оценки ингибирующей активности препаратов и клеточная линия раковых клеток кишечника Сасо-2, а в качестве субстратов применяют родамин-123 или кальцеин-АМ [17]. Однако работа с культурой клеток сопряжена со значительными техническими и методическими сложностями, требует дорогостоящего лабораторного оборудования, поэтому методика не доступна большинству лабораторий. Следует отметить, что для подтверждения результатов принадлежности веществ к субстратам или модуляторам функциональной активность транспортного белка Pgp после их изучения in vitro на следующем этапе необходимо выполнять исследования на целостном организме.

Моделирование состояния ингибирования активности Pgp у кроликов с использованием линестренола на настоящий момент в литературе не описано. Линестренол - синтетический прогестин, является пролекарством, после приема внутрь быстро всасывается и превращается в фармакологически активный метаболит норэтистерон (НЭТ). Максимальный уровень НЭТ в плазме крови достигается через ~2-4 часа после приема внутрь в дозе 0,5 мг. Он связывается с рецепторами прогестерона в органах-мишенях.

Норэтистерон (НЭТ) на 96% связывается с белками плазмы, преимущественно с альбуминами (61%) и в меньшей степени с глобулинами, связывающими половые гормоны (35%). Выведение линестренола и его метаболита происходит почками и через кишечник в соотношении 1,5:1.

В своих исследованиях Kim W.Y. с коллегами изучали влияние на модуляцию Pgp различных стероидных гормонов, в том числе и норэтистерона. Исследование проводилось на культуре клеток карциномы ободочной кишки человека - LSI 80. Результаты показали, что норэтистерон не является субстратом белка-транспортера и не изменяет АТФазной каталитической активности. По мнению авторов, необходимы дальнейшие исследования в условиях целостного организма [18].

Целью изобретения является создание такой модели ингибирования функциональной активности Pgp, которая соответствовала бы этическим принципам и нормам, не сопровождалась проявлением побочных эффектов вводимого вещества при исследовании на добровольцах, а при изучении на животных была бы методически обоснована и не требовала дорогостоящего лабораторного спецоборудования, материалов и комплектующих для проведения исследований на культурах клеток.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве ингибитора Pgp выбран синтетический прогестаген - линестренол, относительно безопасный и экономически доступный препарат, который вводится перорально один раз в день курсом 14, 21 или 28 дней в дозе 110 мкг/кг массы, а в качестве адекватной и удобной тест-системы используются кролики.

Описание способа

Для решения поставленной задачи авторами выполнен эксперимент на 10 половозрелых кроликах-самках породы шиншилла, массой 4500±200 г, находящихся в состоянии течки. Линестренол (препарат «Экслютон» (0,5 мг линестренола) производитель: «Organon», Нидерланды) вводили животным per os в дозе 110 мкг/кг массы линестренола 1 раз в сутки в 12 часов дня. За сутки до начала эксперимента, через 14, 21 и 28 дней введения препарата у кроликов определяли функциональную активность Pgp по фармакокинетике его маркерного субстрата - фексофенадина. Фексофенадин (препарат «Телфаст» 180 мг; производитель: Aventis Pharma, Италия) вводили животным перорально с помощью металлического зонда в дозе 67,5 мг/кг массы [19, 20]. Фексофенадин был выбран в качестве примера субстратов Pgp в связи с тем, что его фармакокинетика зависит исключительно от функционирования Pgp. Через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа от момента введения препарата из ушной вены кроликов забирали кровь в объеме 5 мл. Для получения плазмы пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут и хранили до анализа при температуре -29°C. Содержание фексофенадина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Стайер» с ультрафиолетовым детектором и колонке «Beckman Coulter» 4,6×250 мм, зернением 5 мкм. Экстракцию и хроматографирование маркерного субстрата осуществляли по методу Раменской Г.В. с соавт. [21] в модификации Черных И.В. [22]. Анализ выполняли при длине волны 220 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин.

Количественное определение фексофенадина выполняли по методу абсолютной калибровки по высоте пиков с использованием стандарта фексофенадина (Strasbourg cedex). Примененный метод хроматографического анализа обладал следующими характеристиками: время удерживания - 13,1 мин; предел обнаружения фексофенадина в плазме крови 50 нг/мл.

Расчет концентрации фексофенадина осуществляли с помощью программы «Мультихром». Фармакокинетические параметры - максимальную концентрацию (C_max, нг/мл), время достижения максимальной концентрации (T_max, ч), период полувыведения (Т_1/2, ч), площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время (AUC_0-t, нг·ч/мл; AUC_0-∞, нг·ч/мл), среднее время удерживания (МКТ₂₄, ч; MRT, ч), константу элиминации (K_e1, 17 ч), общий клиренс (Cl, л/ч) объем распределения (Yd, л) рассчитывали модельно-независимым методом с использованием программы Kinetica 5.0. Коэффициент абсорбции (C_max/AUC_0-∞) рассчитывали с помощью офисного пакета «Microsoft Excel 2010».

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с использованием программы Statistica 8.0. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Наличие статистически достоверных межгрупповых различий определяли по критерию Ньюмена-Кейлса после проведения дисперсионного анализа повторных измерений (тест ANOVA - для показателей, имеющих нормальное распределение, критерий Фридмана - для показателей, распределение которых отличалось от нормального).

Полученные данные представлены в виде среднего арифметического значения (М) и стандартной ошибки средней арифметической (m) в случае нормального распределения признака или в виде медианы, верхнего и нижнего квартиля - при распределении признака, отличном от нормального (Таблица 1)

Таблица 1 Основные фармакокинетические параметры фексофенадина при введении линестренола (M±m - при нормальном распределении признака; медиана, нижний и верхний квартиль - при распределении признака, отличном от нормального) Изучаемые параметры Исходные значения n=10 Линестренол 14 дней n=10 Линестренол 21 день n=10 Линестренол 28 день n=10 C_max, нг/мл 292,40±29,95 746,89±163,81* 891,12±142,48* 962,81±114,04* T_max, ч 4,0±0,15 3,9±0,1 3,8±0,13 3,7±0,26 T_1/2, ч 4,29 (2,50; 8,55) 14,65 (9,22; 21,42)* 10,31 (5,96; 16,22) 14,21 (8,06; 23,03)* AUC_0-24, нг·ч/мл 2362,75±414,53 6618,68±898,45 * 7380,95±1147,1 3 10014,86±866,7 AUC_0-∞, нг·ч/мл 2177,09 (1378,56; 3456,15) 10177,50* (7080,77; 13611, 02) 10080,41* (4209,44; 15756, 40) 15476,25* (11012,71; 19846,4) C_max/AUC_0-24 0,14 (0,11;0,21) 0,08 (0,03;0,1)* 0,12 (0,09; 0,17) 0,09 (0,07; 0,12) C_max/AUC_0-∞ 0,11 (0,099;0,15) 0,04 (0,02;0,07)* 0,09 (0,06;0,16) 0,05 (0,04;0,11)* MRT₂₄, ч 8,95±0,59 10,62±0,41* 9,35±0,54 10,46±0,48* MRT, ч 9,60 (8,11; 15,51) 22,77 (14,54; 31,11)* 17,52 (9,96; 24,28)* 23,21 (19,18; 31,51)* Cl, л/ч 137,58 (77,86; 209,59) 9,60 (8,11; 15,51)* 9,60 (8,11; 15,51)* 9,60 (8,11; 15,51)* Vd, n 1202,11 (1025,58; 2231,12) 724,13 (355,31; 1259,72)* 483,8 (361,6; 694,71)* 410,20 (316,25; 596,51)* K_el, 1/4 0,175±0,031 0,051±0,008* 0,080±0,015* 0,055±0,01* Примечание: * - p<0,05 - достоверные различия со значениями у интактных животных (исходные значения);

Введение кроликам линестренола в дозе 110 мкг/кг в течение 14 дней приводило к достоверному (р<0,05) повышению C_max фексофенадина на 155,4%, AUC_0-24 на 180,1%, AUC_0-∞ на 367,5%, T_1/2 на 241,5%, MRT₂₄ на 18,7%, MRT на 137,2%, снижению Cl на 82,2%, Vd на 39,8%, K_el на 70,9%, C_max/AUC_0-24 на 42,9% и C_max/AUC_0-∞ на 63,6% по сравнению с исходными показателями.

Применение исследуемого линестренола в течение 21 дня сопровождалось достоверным (р<0,05) изменением изучаемых фармакокинетических показателей: наблюдалось повышение C_max фексофенадина на 204,8%, AUC_0-∞ на 363,0%, MRT на 82,5%, снижение Cl на 80,3%, Vd на 59,7%, K_el на 54,3% в сравнении с данными интактных животных.

После введения изучаемого препарата курсом 28 дней наблюдалось достоверное (р<0,05) увеличение C_max фексофенадина на 229,3%, AUC_0-∞ на 610,9%, T_1/2 на 231,2%, MRT₂₄ на 16,9%, MRT на 141,8%, снижению С1 на 86,8%, Vd на 65,9%, K_el на 68,9% и C_max/AUC_0-∞ на 54,5% по сравнению с фармакокинетическими параметрами фексофенадина полученными до введения препарата.

В проведенном исследовании изучено влияние вещества линестренола на функциональную активность Pgp. Достоверное повышение значений C_max, AUC_0-24, AUC_0-∞, T_1/2, MRT, MRT₂₄, а также снижение значений Cl, K_el и Vd фексофенадина могут служить доказательством ингибирующего влияния норэтистерона на функциональную активность белка-транспортера Pgp в печени и почках - органах, ответственных за выведение фексофенадина.

Использование предлагаемого способа моделирования состояния ингибирования функциональной активности Pgp на кроликах позволяет применять линестренол в качестве положительного контроля пониженной функциональной активности белка-транспортера при поиске веществ аналогичного действия, а также для прогнозирования потенциальных субстратов Pgp при изучении лекарственных веществ на этапе доклинических исследований.

Источники информации

1. Schinkel A.H. The physiological function of drug-transporting P-glycoproteins / A.H. Schinkel // Cancer Biology. - 1997. - №8. - P.161-170.

2. The structure and functions of P-glycoprotein / Y. Li [et al.] // Curr. Med. Chem. - 2010. - Vol.17, №8. - P.786-800.

3. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализованной медицины: руководство для врачей / В.Г. Кукес [и др.]. - М.: ГЭОТАР - Медиа, 2008. - 304 с.

4. Якушева Е.Н. Дозозависимое влияние тироксина на функциональную активность гликопротеина-Р в эксперименте / Е.Н. Якушева, А.В. Щулькин, А.С. Бирюкова // Биомедицина. - 2012. - №2. - С.53-60.

5. In vitro and ex vivo evidence for modulation of P-glycoprotein activity by progestins / M. Fröhlich [et al.] // Biochem Pharmacol. - 2004. - Vol.68, №12. - P.2409-2416.

6. Machavaram K.K. Effect of ketoconazole and rifampicin on the pharmacokinetics of ranitidine in healthy human volunteers: a possible role of P-glycoprotein / K.K. Machavaram, J. Gundu, M.R. Yamsani // Drug Metabol. Drug Interact. - 2006. - Vol.22, №1. - P.47-65.

7. Fox E. Tariquidar (XR9576): a P-glycoprotein drug efflux pumpinhibitor / E. Fox, S.E. Bates // Expert Rev. Anticancer Ther. - 2007. - Vol.7, №4. - p.447-459.

8. Involvement of cytochrome P450 3A4 and P-glycoprotein in first-pass intestinal extraction of omeprazole in rabbits. / H.M. Fang [et al.] // Acta Pharmacol Sin. - 2009. - Vol.30. - P.1566-1572.

9. Tariquidar-induced P-glycoprotein inhibition at the rat blood-brain barrier studied with (R)-11C-verapamil and PET / J.P. Bankstahl [et al.] // J Nucl Med. - 2008. - Vol.49. - P.1328-1335.

10. (R)-[(11)C]verapamil is selectively transported by murine and human P-glycoprotein at the blood-brain barrier, and not by MRP1 and BCRP / K. Romermann [et al.] // Nucl Med Biol. - 2013. - Vol.40, №7. - P.873-878.

11. Effects of Selected OATP and/or ABC Transporter Inhibitors on the Brain and Whole-Body Distribution of Glyburide / N. Toumier [et al.] // AAPS J. - 2013. - Vol.15, №4. - P.1082-1090.

12. Oral cyclosporin A inhibits CD4 Т cell P-glycoprotein activity in HIV-infected adults initiating treatment with nucleoside reverse transcriptase inhibitors / T. Hulgan [et al.] // J Clin Pharmacol. - 2009. - Vol.65, №11 - P.1081-1088.

13. Cyclosporine Nephrotoxicity / By Emmanuel [et al.] // Bennett Seminars in Nephrology. - 2003. - Vol.23, №5. - P.465-476.

14. Inhibitory effect of ketoconazole on the pharmacokinetics of a multireceptor tyrosine kinase inhibitor BMS-690514 in healthy participants: assessing the mechanism of the interaction with physiologically-based pharmacokinetic simulations / Z. Yang [et al.] // J. Clin Pharmacol. - 2013. - Vol.53, №2. - P.217-227.

15. Pharmacological inhibition of P-glycoprotein transport enhances the distribution ofHIV-1 protease inhibitors into brain and testes. / E.F. Choo [et al.] // Drug Metab Dispos. - 2000. - Vol.28, №6. - P.655-660.

16. Inhibition of P-glycoprotein by newer antidepressants. / J. Weiss [et al.] // J Pharmacol Exp Ther.- 2003. - Vol.305, №1. - P.197-204.

17. Influence of combinations of digitonin with selected phenolics, terpenoids, and alkaloids on the expression and activity of P-glycoprotein in leukaemia and colon cancer cells. / S.Y. Eid [et al.] // Phytomedicine. - 2013. - Vol.21, №1. - P.47-61

18. Kim W.Y. P-glycoprotein (P-gp/MDR1)-mediated efflux of sex-steroid hormones and modulation of P-gp expression in vitro / W.Y. Kim, L.Z. Benet // Pharm Res. - 2004. - Vol.21, №7. - P.1284-1293.

19. Колхир С.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина-Р для оптимизации фармакотерапии: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.00.25 / С.В. Колхир; ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова. - М., 2007. - 21 с.

20. Скуридина Е.А. Особенности фармакокинетики фексофенадина при совместном применения с верапамилом и негрустином: автореф. дис. канд. фармац. наук: 15.00.02 / Е.А. Скуридина; ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова. - М., 2007. - 24 с.

21. Раменская Г.В. Разработка методики количественного определения маркера активности P-гликопротеина фексофенадина в плазме крови / Г.В. Раменская, Е.А. Скуридина, Л.М. Красных // Хим.-фармац. журн. - 2006. - Т.40, №12. - С.47-50.

22. Черных И.В. Разработка методики определения концентрации фексофенадина в плазме крови методом ВЭЖХ на хроматографе Stayer / И.В. Черных // Материалы межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Аспирантские чтения 2012». - Рязань, 2012. - С.96-98.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для моделирования состояния ингибирования функциональной активности гликопротеина-Р линестренолом в организме. Для этого при проведении эксперимента in vivo вводят препарат-ингибитор линестренол кроликам внутрижелудочно в суточной дозе 110 мкг/кг массы тела животного курсом 14, 21 или 28 дней. Изобретение позволяет использовать линестренол в качестве положительного контроля пониженной активности гликопротеина-Р для прогнозирования принадлежности изучаемых лекарственных веществ к субстратам белка-транспортера. 1 табл.

Способ моделирования состояния ингибирования функциональной активности гликопротеина-Р линестренолом в организме, представляющий собой введение препарата-ингибитора, отличающийся тем, что в качестве такого препарата используют линестренол, который при проведении эксперимента in vivo вводят кроликам внутрижелудочно в суточной дозе 110 мкг/кг массы тела животного курсом 14, 21 или 28 дней.