ТЕХНОЛОГИЯ ОПЫТНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2015 года по МПК A61K35/20 A23J1/20 A23J3/08 

Область техники настоящего изобретения

Изобретение относится к молочной промышленности. Изобретение может применяться для получения опытной фракции лактоферрина человека с целью его использования в специализированном питании, в том числе восстановительном у недоношенных детей, ослабленных пациентов, для восстановления неспецифического иммунитета, активации противомикробной защиты, в том числе в сочетании с антибиотикотерапией, а также в качестве самостоятельного иммуномодулирущего средства.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Известен способ получения лактоферрина человека из женского молока, который состоит в обезжиривании, удалении казеинов, фракционировании сульфатом аммония, диализе и лиофилизации продукта, отличающийся тем, что фракционирование ведут ступенчато: сначала добавляют сульфат аммония до концентрации 35-45% от насыщения, осадок удаляют, затем к супернатанту добавляют сульфат аммония до концентрации 70-80% от насыщения; а перед диализом осадок растворяют в дистиллированной воде, инкубируют с 1,3-3,7М хлоридом натрия при рН 3,6-4,4 и удаляют образующийся осадок при помощи фильтрования (см. патент РФ №1709606).

Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ получения лактоферрина, включающий хроматографию лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 M натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина 0,05М натрий-фосфатным буфером, ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию раствора лактоферрина, в котором согласно изобретению в качестве молочного сырья используют сырое коровье молоко, хроматографию лактоферрина из сырого коровьего молока проводят в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина проводят 0,05 M натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на вторую хроматографию лактоферрина во вторую колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 M натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина со второй колонки проводят 0,05 M натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании вновь собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию (патент RU 2 390 253 С 1).

Постановка задачи и раскрытие изобретения

Задачей изобретения является возможность получения рекомбинантного лактоферрина человека из молока коз-продуцентов, свободного от липополисахаридов. Следует заметить, что карбоксиметилцеллюлоза является слабым катионообменником. Мы предлагаем использовать в качестве сорбента для получения рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных коз сильный катионообменник, содержащий сульфопропильные группы (сульфопропил-сефароза, сефадекс, целлюлоза). При этом происходит более полное и быстрое извлечение лактоферрина из молока за счет более прочного связывания с сильным катионообменником.

Использование натрий-ацетатного буфера (вместо фосфатного) является более удачным, т. к. фосфатный буфер может давать нерастворимый осадок фосфатов кальция (кальций является составной частью молока), который загрязняет сорбент, приводя к более частой его регенерации. Кроме того, лактоферрин относится к белкам, которые связываются с эндотоксином, или липополисахаридом (ЛПС). Липополисахариды (ЛПС), или бактериальные эндотоксины, - это фрагменты клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Показано, что эндотоксины даже в очень низких концентрациях существенно воздействуют на организм животных и человека. Удаление связанного с лактоферрином ЛПС не только устраняет возможное токсическое действие эндотоксина, но и существенно повышает антибактериальную активность лактоферрина.

В предлагаемом способе получения лактоферрина сорбцию лактоферрина проводят либо из цельного, либо из обезжиренного молока, либо из молочной сыворотки на сорбенте, несущем сульфопропильные группы (SP- сефароза, SP-сефадекс, SP-целлюлоза), уравновешенным 20 мМ натрий- ацетатным буфером рН 7,0. После промывки сорбента 20 мМ натрийацетатным буфером рН 7,0, содержащим 0,1 M натрия хлористого, проводили ступенчатую промывку (2 объема колонки) 20 мМ натрий-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим 0,3 M натрия хлористого и 10 % этанола, для разрушения комплекса лактоферрин-ЛПС и удаления ЛПС. Последующую промывку 20 мМ натрий-ацетатным буфером, содержащим 0, 3 M натрия хлористого, проводят для удаления этанола. Элюция лактоферрина, свободного от эндотоксина, осуществляется в градиенте хлористого натрия 0,3 - 1,0 М. Фракции, содержащие лактоферрин, объединяют, раствор обессоливают диализом или гель-фильтрацией (или ультрафильтрацией), лиофильно высушивают. Чистота целевого продукта - более 90%, препарат не содержит связанного ЛПС, что приводит к увеличению антибактериальной активности.

Пример 1. 60 л козьего молока трансгенных коз, содержащего рекомбинантный лактоферрин человека, пропускают через колонку с сорбентом - сульфопропил-сефарозой (1, 5 л), уравновешенной 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 7,0, со скоростью 100-300 см/час. После промывки уравновешивающим буфером сорбент промывают (2 объема колонки) 10% этанолом в 20 мМ натрий-ацетатном буфере рН 7,0, содержащим 0,3 M натрия хлористого, затем 20 мМ натрий-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим 0, 3 M натрия хлористого. Элюцию лактоферрина проводят в градиенте натрия хлористого 0,3 - 1,0 М. Фракции, содержащие лактоферрин, объединяют, обессоливают диализом (или гель-фильтрацией или ультрафильтрацией), лиофильно высушивают. Получают 74 г лактоферрина чистотой более 90%, не содержащего связанного эндотоксина.

Основание осуществления изобретения

Лактоферрин является высококонсервативным, мономерным 80-кДа белком, полипептидная цепь состоит из 690 аминокислот. Основным источником лактоферрина в организме млекопитающих являются мукозальные клетки эпителия, которые обеспечивают секрецию лактоферрина и обогащение им грудного молока. Кроме мукозальных клеток, его также секретируют нейтрофилы.

Лактоферрин представляет собой наиболее ценную белковую фракцию грудного молока млекопитающих. Биологические функции лактоферрина весьма разнообразны; будучи выделенным в высокоочищенную субстанцию, он обладает иммуномодулирующим, противовирусным, противобактериальным эффектом. Лактоферрин принадлежит к семейству т.н. трансферринов - особый вид специфических белков, осуществляющих транспортную функцию железа. Будучи апо-белком, лактоферрин осуществляет секвестрацию железа у микроорганизмов, что способствует обеднению их железом и дальнейшей гибели. Дополнительным преимуществом лактоферрина является его способность к связыванию с липополисахаридами бактериальной стенки, что усиливает вероятность сближения с микроорганизмами и, соответственно, создает условия для секвестрации железа.

Лактоферрин является одним из немногих белков, чья пространственная структура при попадании в желудочно-кишечный тракт не разрушается ферментами на пептиды, в отличие от многих других белков. Это обстоятельство позволяет использовать лактоферрин для перорального введения, что дает ценные преимущества при изготовлении готовой лекарственной или пищевой формы белка.

Таким образом, лактоферрин представляет собой уникальное природное соединение, которое может применяться для лечения и профилактики иммунодефицитов, бактериальных и вирусных инфекций как у взрослых, так и у детей. Отдельной строкой можно выделить использование лактоферрина при вскармливании недоношенных младенцев. Кроме вышеперечисленных свойств у лактоферрина обнаруживаются и другие, не менее уникальные биологические активности, а именно: укрепление костной ткани (Amini & Nair, 2011), заживление ран (Ashby et al., 2011), индукция апоптоза опухолевых клеток (Wang et al., 2011; Xu et al., 2010), многие другие.

Поскольку источником лактоферрина является грудное молоко, для получения высококонцентрированной фракции целевого белка необходимо разработать ряд высокотехнологичных приемов. Учитывая тот факт, что для получения лактоферрина в промышленных масштабах использовать в качестве сырья грудное женское молоко не представляется возможным, с этой целью необходимо разработать технологии получения, идентификации и разделения лактоферринов из молока трансгенных животных, в частности коз.

Способ получения рекомбинантного лактоферрина человека, свободного от липополисахаридов, включающий ионообменную хроматографию молока трансгенных коз на сильном катионообменнике, несущем сульфопропильные группы, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого, обессоливание, после применяют ступенчатую промывку сорбента натрий-ацетатным буфером, содержащим натрий хлористый и этанол для удаления связанных с лактоферрином липополисахоридов, лиофильное высушивание при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет получить рекомбинантный лактоферрин человека, свободный от липополисахаридов. 1 пр.

Способ получения рекомбинантного лактоферрина человека, свободного от липополисахаридов, из молока, включающий ионообменную хроматографию на сильном катионообменнике, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого 0,3-1,0 М, обессоливание, лиофильное высушивание, отличающийся тем, что в качестве молочного сырья используют молоко трансгенных коз, хроматографию проводят на сильном катионообменнике, несущем сульфопропильные группы, используют натрий-ацетатный буфер, применяют ступенчатую промывку сорбента 20 мМ натрий-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим 0,3 М натрия хлористого и 10% этанола для удаления связанных с лактоферрином липополисахоридов.