Способ получения лактоферрина Российский патент 2020 года по МПК G01N30/96 G01N30/02 A61K35/20 A61K38/40 C07K1/18 C07K14/79 

Изобретение относится к биотехнологии.

Коммерческие препараты лактоферрина чистотой 90% и менее, содержат как белки молока, так и возможна контаминация ЛПС, с которыми лактоферрин образует прочный комплекс. Из белков молока возможны примеси лактопероксидазы, ангиогенина и иммуноглобулинов.

Ввиду того, что лактоферрин - многофункциональный белок, обладающий антибактериальной, противовирусной, иммуномодулирующей активностями, он может использоваться в качестве фармацевтической основы для создания многих препаратов. Препарат лактоферрина, полученный по предложенному методу, может быть использован в качестве активной основы как фармацевтических препаратов широкого спектра действия (например, для восстановления слизистой оболочки ЖКТ при гастроэнтерологических заболеваниях, в качестве противоопухолевого агента, как антибактериальное средство при разных бактериальных инфекциях глаз и кожи, для лечения инфекционных заболеваний дыхательных путей, в профилактике остеопороза), также пищевых БАД в том числе в питании новорожденных.

Известен способ получения лактоферрина из коровьего молока, заключающийся в хроматографии лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина 0,05М натрий-фосфатным буфером, ультрафильтрации, обессоливания и лиофилизации раствора лактоферрина, в котором, согласно изобретению, в качестве молочного сырья используют сырое коровье молоко, хроматографию лактоферрина из сырого коровьего молока проводят в колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на вторую хроматографию лактоферрина во вторую колонку с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, уравновешенным 0,05 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,7, элюирование лактоферрина со второй колонки проводят 0,05 М натрий-фосфатным буфером, в градиенте концентраций хлорида натрия 0,1-1,2 М, при элюировании вновь собирают фракции раствора лактоферрина с оптической плотностью 0,5 ед. при длине волны 280 нм и направляют их на ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию. Недостатком этого способа является двухстадийная очистка, а также возможная контаминация ЛПС из-за его достаточно прочного связывания с лактоферрином. Известна также технология получения рекомбинантного лактоферрина человека из молока коз-продуцентов (патент RU 2554742). Способ включает ионообменную хроматографию на сильном катионообменнике, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого 0,3-1,0 М, обессоливание, лиофильное высушивание. Способ отличается тем, что в качестве молочного сырья используют молоко трансгенных коз, хроматографию проводят на сильном катионообменнике, несущем сульфопропильные группы, используют натрий-ацетатный буфер, применяют ступенчатую промывку сорбента 20 мМ натрий-ацетатным буфером рН 7,0, содержащим 0,3 М натрия хлористого и 10% этанола для удаления связанного с лактоферрином ЛПС.

Область изобретения.

Изобретение относится к качеству лактоферрина и направлено на доочистку коммерческих (промышленных) препаратов лактоферрина, содержащих 90% и менее лактоферрина в образце. При этом происходит удаление сторонних белков молока и удаление ЛПС, которые обладают сродством к лактоферрину и находятся в связанном с ними виде, ухудшая качество лактоферрина и влияя на его антибактериальную активность. К белкам-контаминантам, в частности, относится ангиогенин, молекулярная масса которого ок 15 кДа, а изоэлектрическая точка 9,5, что близко по свойствам к лактоферрину, содержание ангиогенина, по литературным данным, 1-8 мг/л молока. При получении лактоферрина в промышленных масштабах может происходить увеличение содержания ангиогенина в несколько раз, что отрицательным образом может сказываться на здоровье потребителя продукции. Кроме того, белками-контаминантами могут быть лактопероксидаза, которая имеет молекулярную массу ок 80 кДа, как и лактоферрин, а также иммуноглобулины молока.

Поэтому доочистка промышленных препаратов лактоферрина, которые предполагается использовать в качестве фармацевтической субстанции, является предпочтительным. Известно, что рост и развитие желудочно-кишечного тракта новорожденных животных, вскармливаемых материнским молоком, интенсивнее, чем у вскармливаемых молочными смесями. Значительная роль в росте и развитии новорожденного принадлежит лактоферрину, поэтому введение его в рацион питания новорожденных является предпочтительным. В Японии компания Morinaga Milk Industry Co. Ltd с 1986 г. производит детское питание, обогащенное коровьим лактоферрином. Защитные свойства ЛФ против микробных и вирусных инфекций продемонстрированы во многих научных работах и к настоящему времени известно о проведении несколько клинических испытаний терапевтических препаратов на основе этого белка. Тем не менее, наши современные знания позволяют определить ЛФ не только, как ключевой компонент первичной защитной системы организма, но и как многофункциональный регуляторный фактор, который взаимодействует и влияет на микробные, вирусные или клеточные компоненты, вовлеченные в процесс инфекции.

Известно, что лактоферрин коровьего молока проявляет бактериостатическую активность по отношению к бактериям. Наиболее чувствительны к его действию штаммы E.coli. Было показано, что лактоферрин вызывает изменение проницаемости наружной мембраны некоторых грам-отрицательных бактерий. Дестабилизация клеточной стенки бактерий может быть результатом неспецифического связывания с лактоферрином кальция и магния. Таким образом, лактоферрин способен выщеплять молекулы липополисахаридов (эндотоксинов) из наружной мембраны грам-отрицательных бактерий, связываясь с ними. Ингибирование лактоферрином бактериальной сорбции на небиологические и клеточные поверхности.

Микробиологическая адгезия и последующая колонизация и образование биопленки на небиологические поверхности, например, хирургический и медицинский инструмент, является серьезной проблемой приводящей к различным заболеваниям и воспалениям. Основной подход для решения этой проблемы заключается в создании новых композиционных материалов, которые обладают минимальной специфичностью к сорбированию микрофлоры. В связи с этим, очень привлекательной выглядит возможность использования ЛФ, как нового компонента, защищающего поверхность от микробиологической адгезии. В практическом аспекте покрытие ЛФ-ном глазных линз приводит к защите их поверхности от P. aeruginosa (Williams Т. J., Schneider R. R and Willcox M. D. (2003) The effect of protein-coated contact lenses on the adhesion and viability of gram negative bacteria. Curr. Eye Res. 27: 227-235).

Отмечен ряд ингибирующих влияний лактоферрина на различные звенья иммунных и воспалительных реакций. Ингибирующее действие лактоферрина находится в обратной зависимости от степени насыщенности его железом.

Отмечена положительная роль лактоферрина в профилактике остеопороза (Молекулярный механизм влияния лактферрина на костеобразование. Критический обзор. П.Е. Садчиков, И.Л. Гольдман, С.В. Разин, А.Д. Черноусов, Л.И. Алексеева, Е.Р. Садчикова. Журнал Остеопороз и остеопатии, 2016, №3 стр 12-64).

Имеется патент (2465004 RU)» Применение апо-формы лактоферрина человека в качестве антигипоксанта и стабилизатора гипоксия-индуцибельного фактора -1 альфа.» Кроме того, имеются данные о положительном влиянии лактоферрина в профилактике болезни Альцгеймера и Паркинсона.

Поэтому доочистка промышленных образцов лактоферрина для применения в качестве фармацевтической основы является актуальной.

Раскрытие изобретения

Сырьем для получения лактоферрина являются различные лактоферрин-содержащие препараты чистотой 90% и менее. К ним относятся коммерческие препараты лактоферрина, чистота которых сильно варьирует по содержанию белка, содержание ЛПС зачастую не контролируется.

К сорбентам-катионообменникам, которые могут быть использованы по данному изобретению, относятся сорбенты, содержащие карбоксиметильные или сульфопропильные группы. Основой этих сорбентов может служить целлюлоза, декстран, агароза, полиакрил и др.

Способ получения лактоферрина, заключающийся в том, что растворяют сухой лактоферрин-содержащий препарат чистотой 90% и менее, в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,35М NaCl, далее проводят фильтрование от нерастворенной взвеси через фильтр 2,5 мкм, внесение на колонку с катионообменным сорбентом, промывку 10 мМ фосфатным буфером рН 7,5, содержащим 0,35 М NaCl и 0,01% твин-20, для удаления липополисахарида, связанного с лактоферрином, элюцию лактоферрина в градиенте NaCl 0,35-1,0 М, обессоливание путем диализа или диафильтрации или гель-фильтрации, микрофильтрацию через фильтр 0,22 мкм и лиофильное высушивание. Способ позволяет получить лактоферрин чистотой 99%, не содержащий ЛПС.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения лактоферрина. Способ получения лактоферрина заключается в том, что сухой лактоферрин-содержащий препарат чистотой 90% и менее растворяют в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,35М NaCl, далее проводят фильтрование от нерастворенной взвеси через фильтр 2,5 мкм, внесение на колонку с катионообменным сорбентом, промывку 10 мМ фосфатным буфером рН 7,5, содержащим 0,35 М NaCl и 0,01% твин-20, для удаления липополисахарида, связанного с лактоферрином, элюцию лактоферрина в градиенте NaCl 0,35-1,0 М, обессоливание путем диализа или диафильтрации или гель-фильтрации, микрофильтрацию через фильтр 0,22 мкм и лиофильное высушивание. Способ позволяет получить лактоферрин чистотой 99%, не содержащий ЛПС.

Способ получения лактоферрина, заключающийся в том, что растворяют сухой лактоферрин-содержащий препарат чистотой 90% и менее в 10 мМ фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 0,35М NaCl, далее проводят фильтрование от нерастворенной взвеси через фильтр 2,5 мкм, внесение на колонку с катионообменным сорбентом, промывку 10 мМ фосфатным буфером рН 7,5, содержащим 0,35 М NaCl и 0,01% твин-20, для удаления липополисахарида, связанного с лактоферрином, элюцию лактоферрина в градиенте NaCl 0,35-1,0 М, обессоливание путем диализа или диафильтрации или гель-фильтрации, микрофильтрацию через фильтр 0,22 мкм и лиофильное высушивание.