СПОСОБ КРУПНОМАСШТАБНОГО ПОЛУЧЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2013 года по МПК C07K1/14 C07K14/535 C12N15/27 C07K1/18 C07K1/36 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к производству рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека (рчГ-КСФ) в промышленном масштабе и представляет собой способ получения выделения и очистки рекомбинантного человеческого Г-КСФ в качестве препарата, в том числе медицинского назначения, из биомассы бактериальных клеток, содержащих рекомбинантную плазмидную ДНК с геном Г-КСФ человека.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека является основным регулятором выработки нейтрофилов. Г-КСФ - гликопротеин с молекулярной массой 18-20 кДа, изоэлектрической точкой 5.5, проявляющий активность в мономерной форме (Dr. Ken Alibek 27s lecture G-CSF). Он продуцируется многими клетками организма: стромальными клетками костного мозга, эндотелиальными клетками, макрофагами, гранулоцитами, фибробластами, астроцитами (Dr. Ken Alibek).

Функциями Г-КСФ являются: стимуляция, дифференциация и функциональная активация клеток-предшественников нейтрофилов; влияние на иммунную систему путем регуляции функций Т-клеток и дендритных клеток (Dr. Ken Alibek); влияние на нервную систему через оказание противовоспалительного действия, подавление апоптоза и стимуляцию нейрогенеза (Solaroglu I, et al, A novel neuroprotectant granulocyte-colony stimulating factor, Stroke 2006).

В медицине применяется рекомбинантный Г-КСФ как гликозилированный, так негликозилированный. Его клинический эффект не зависит от гликозилирования молекулы (Bönig Н, Silbermann S, et al. Glycosylated vs non-glycosylated granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) - results of a prospective randomised monocentre study, 2001; Hoglund M. Glycosylated and non-glycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) - what is the difference? Med Oncol. 1998 Dec)

Рекомбинантный Г-КСФ человека широко применяется в онкологии и гематологии при лечении нейтропении разной этиологии (David С. et al, «А Randomized Controlled Phase 3 Trial of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor (Filgrastim) for Treatmentof Severe Chronic NeutropeniaBlood», 1993), аутоиммунных болезней человека (Rutella S et al, Granulocyte colony-stimulating factor: a novel mediator of T-cell tolerance, 2005), инфаркта миокарда, инсульта, ВИЧ-инфекции (Dr. Kuritzkes. Neutropenia, Neutrophil Dysfunction, and Bacterial Infection in Patients with Human Immunodeficiency Virus Disease: The Role of Granulocyte Colony-Stimulating Factor, 2000), нейтропении у новорожденных (A Randomized, Placebo-Controlled Trial of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor Administration in Newborn Infants With Presumed Sepsis: Significant Induction of Peripheral and Bone Marrow Neutrophilia Blood, 1994).

Растущие потребности в Г-КСФ, высокая эффективность в терапии целого ряда заболеваний иммунной и кроветворной систем, высокая стоимость зарубежных аналогов делают актуальной задачей разработку крупномасштабного способа его получения.

Использование микробиологического синтеза на основе технологии рекомбинантных молекул ДНК обеспечивает возможность масштабирования процесса получения целевого продукта с высоким выходом из сравнительно недорого и безопасного сырья.

В литературе описаны несколько способов получения рчГ-КСФ из клеток Е. coli (Welte К. et al // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, V.82, No.5, p.1526-1530; Nomura H. et al. // EMBO J., 1985, V.5, No.5, p.891-896; Morioka E. et al. // Res. Exp. Med. (Berl.), 1990, V.190, No.4, p.229-238). Однако в одних применяются органические растворители, приводящие к частичной денатурации белка (Welte K. et al), в других используются дорогостоящие реактивы, например, окисленный глютатион (Morioka Е et al). Общим недостатком является низкий выход целевого белка, а масштабирование описанных процессов осложнено применением хроматографии с низкими скоростями.

Известен способ получения Г-КСФ из клеток E.coli SG20050, трансформированных плазмидой pGGF8 (RU 2201962). Клетки разрушали при помощи ультразвука, тела включения отмывали и растворяли при помощи 8М мочевины, ренатурацию рчГ-КСФ проводили разбавлением нейтральным буфером. Хроматографическую очистку рчГ-КСФ осуществляли при помощи одноэтапной ионообменной хроматографии на двух последовательно соединенных колонках с ДЕАЕ-целлюлозой и SP-сефарозой при pH 4.4 с последующим элюированием целевого белка с колонки с SP-сефарозой в линейном градиенте хлористого натрия (0-0.4 M) в 20 мМ натрий ацетатном буфере при рН 4.4-4.5. Выход целевого продукта составил 24-30 мг из одного литра культуры клеток E.Coli SG20050/pGGF8. Очищенный препарат содержал 200 нг бактериальных белков и 80 пкг ДНК на 1 мг рчГ-КСФ. К недостаткам этого способа относятся большие потери целевого белка на подготовительных этапах при отмывке НФК, а также на основных этапах в связи с низкой эффективностью процесса ренатурации. Получаемые препараты рчГ-КСФ характеризуются значительным содержанием примесных белков и ДНК штамма-продуцента (около 200 нг и 80 пк на 1 мг рчГ-КСФ соответственно).

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения рчГ-КСФ из клеток E.coli SG20050/pGGF8 (RU 2278870), в котором трансформированные клетки E.coli/pGGF8, выращенные как описано ранее (RU 2326169), разрушают при помощи френч-пресса или ультразвука при температуре (6±3)°C. Тела включения, содержащие рчГ-КСФ, отделяют от фракции растворимых клеточных белков при помощи лабораторного центрифугирования. Для удаления примесных бактериальных белков тела включения отмывают буферным раствором с рН 7-9, содержащим детергенты и 2 М мочевины. Осадок тел включения снова отделяют центрифугированием и растворяют в буферном растворе с рН 7-9, содержащим 8 M мочевины и 10-30 мМ 2-меркаптоэтанола или 2-5 мМ дитиотреитола. Ренатурацию восстановленного рчГ-КСФ проводят разбавлением буферным раствором с рН 7-9, содержащим детергенты, глицерин и ЭДТА до концентрации суммарного белка 0.1-0.3 мг/мл при температуре (4-20)°C в течение 20-48 часов или при помощи диализа в диализных трубках восстановленного рчГ-КСФ против буферного раствора с pH 7-9, содержащего детергенты, глицерин и ЭДТА при температуре (4-20)°C в течение 20-48 часов.

После окончания процесса ренатурации полученный раствор окисленного белка пропускают через хроматографическую колонку диаметром 50-90 мм с анионообменным сорбентом, уравновешенным буферным раствором с pH 7-9, с объемной скоростью 5-10 мл/мин. К объединенным фракциям, не связавшимся с сорбентом, добавляют уксусную кислоту до pH 4-5, и полученный раствор наносят на хроматографические колонки с анионообменным и катионообенным сорбентами диаметром 50 мм и 25 мм с высотой слоя сорбента 50 и 70 мм соответственно. РчГ-КСФ элюируют с катионообменного сорбента в линейном градиенте хлорида натрия с объемной скоростью 1-2 мл/мин. Фракции, содержащие целевой белок, объединяют и диализуют в диализных трубках против буферного раствора с pH 4-5. Получаемые препараты рчГ-КСФ содержат 25-33 нг примесных белков и 10-13 пк ДНК штамма-продуцента на 1 мг рчГ-КСФ.

Недостатками способа-прототипа являются:

1) Описанный способ является лабораторным, осуществляется на лабораторном оборудовании (лабораторные центрифуги, хроматографические колонки малых размеров, FPLC с максимальной скоростью потока 10 мл/мин и т.д.) с соответствующими методами (элюирование в линейном градиенте, диализ в диализных трубках и т.д.) и подходами, что делает описанный процесс открытым и дискретным. Однако прямой перенос результатов получения целевого белка от лабораторной технологии к промышленному способу является неочевидным, так как методы теории подобия, позволяющие получать критерии масштабирования, в биотехнологии непригодны;

2) Лабораторное количество клеток, вовлеченное в технологический процесс 10 грамм, не позволяет получить целевой белок в достаточном для производства количестве.

Задачей изобретения является разработка и поиск оптимальных условий для крупномасштабного получения (15-20 г за один цикл), выделения и очистки Г-КСФ человека с высокой степенью гомогенности и чистоты, а также с улучшенным качеством, пригодного для создания лекарственного препарата, в том числе медицинского назначения.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем:

1) Культуральную жидкость, полученную со стадии культивирования штамма-продуцента E.coli в ферментере, рабочим объемом 250 л, концентрируют в 10 раз, клетки разрушают при помощи френч-пресса и нерастворимые фракции клеток (НФК) сепарируют.

2) Для удаления примесных бактериальных белков НФК отмывают буферным раствором рН 7-9, содержащим детергенты и мочевину. НФК снова отделяют сепарированием.

3) Отмытый осадок тел включения растворяют в буфере pH 8.0±0.5, содержащем Трис HCl, мочевину и 2-меркаптоэтанола в течение 20 часов.

4) Ренатурацию восстановленного белка проводят 10-кратным разбавлением, добавляя раствор денатурированного белка в охлажденный буфер. Ренатурация заканчивается через 70-90 часов. Процент гомогенности ренатурированного белка составляет 60-80%.

5) Раствор ренатурированного белка подвергают дополнительной очистке от примесных белков, пропуская через колонку с анионообменным сорбентом со скоростью 500-700 мл/мин, уравновешенную буферным раствором pH 7-9. В общем объеме не связавшихся с сорбентом фракций понижают pH буфера до значений 4-5. Осадок, сформировавшийся при температуре 10-12°C в течение 24 часов, отделяют с помощью мембран.

6) Концентрирование целевого белка проводится на последовательно соединенных колонках с анионообменным и катионообменным сорбентами. Фракции, содержащие рчГ-КСФ, с гомогенностью по ВЭЖХ выше 80% объединяют. При этом рабочий объем раствора белка уменьшается в 40-50 раз.

7) Очистку проводят с помощью катионообменной хроматографии в режиме рецикла фракций для повышения степени извлечения целевого белка и увеличения его чистоты и гомогенности по ВЭЖХ.

8) Объединенные целевые фракции рчГ-КСФ диафильтруют на ультрафильтрационных мембранах с порогом отсечения 10 кДа.

В качестве детергентов используются неионные детергенты тритон X-100, твин-20 или их смесь.

Процесс очистки рчГ-КСФ является закрытым. Все операции проводятся в стерильных условиях с использованием апирогенных сорбентов и буферных растворов.

В качестве катионообменного сорбента используют SP-sepharosa, KM-sepharosa, SO₃ fractogel.

В качестве анионообменного сорбента используют DEAE-sephacel, ДЕАЕ sepharosa.

Выход электрофоретически гомогенного рчГ-КСФ с чистотой более 98% составляет 60-80 мг из 1 л культуры клеток штамма E.coli SGK25/ pA3GF (Методы контроля медицинских иммунбиологичеких препаратов, вводимых людям. Методические указания, МУК 4.1/4.2/588-96, М., 1998). Специфическая (гемостимулирующая) активность полученного препарата рчГ-КСФ, определенная in vivo на мышах, у которых путем введения цитостатика воспроизводилась гипоплазия кроветворения, составляет 1000-1400%. Специфическая активность, определенная in vitro по стимуляции мышиных клеток М-NFS-60 составляет более 10+8МЕ/мг белка. Содержание белков штамма - продуцента составляет 30 нг/мг рчГ-КСФ. Содержание ДНК составляет менее 10 пг/мг рчГ-КСФ (Общие требования к медицинским иммунобиологическим препаратам, проученным методами генной инженерии. РД 42-68-9-89, М., 1989).

Предлагаемая схема позволяет получать в промышленном масштабе стабильные препараты рчГ-КСФ с большим количественным выходом, высокими показателями чистоты, гомогенности и активности, которая превышает активность КСФ, полученного по прототипу, что позволяет использовать их, в том числе в качестве субстанции для создания лекарственных средств нового поколения.

Новым по сравнению со способом-прототипом является:

- введение промышленной схемы отмывки НФК с получением обобщенного пула отмытых тел включения; реализация лабораторного подхода отмывки тел включения в промышленном масштабе невозможна;

- увеличение количества тел включения, вовлекаемых в биотехнологический процесс до 290-350 г, что соответствует промышленному уровню производства белка;

- изменение объема и условий ренатурации применительно к крупномасштабному процессу:

- увеличение объема раствора целевого белка на стадии ренатурации до 350-450 л

- разбавление восстановленного раствора тел включения буферным раствором pH 7-9 в десять раз, содержащим ЭДТА, путем внесения раствора белка в общий объем с фиксированной скоростью при перемешивании.

- увеличение времени ренатурации до 70-90 часов при температуре 10-15°C.

- увеличение времени инкубации раствора белка при снижении значения pH свободной фракции после проведения анионообменной хроматографии до 24 часов при 10-15°C.

- концентрирование целевого белка в 40-50 раз с помощью катионообменников с целью уменьшения рабочего объема растворов.

- проведение катионообменной хроматографии в режиме рецикла фракций для повышения степени извлечения целевого белка, степени чистоты и гомогенности рчГ-КСФ по ВЭЖХ.

- сокращение времени осуществления технологических стадий путем включения в состав промышленных хроматографических систем фильтров, позволяющих отделять осадки в процессе нанесения растворов белков на сорбенты.

- использование мембранных технологий для стабилизации свойств целевого белка на конечной стадии получения лекарственной субстанции.

Введенные изменения позволяют масштабировать процесс получения рГ-КСФ до промышленного уровня с сохранением характеристик по выходу продукта заявленных в лабораторном способе прототипе. При этом общий выход целевого белка с гомогенностью более 97% по ВЭЖХ составляет 15-20 г.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурой графического изображения (см. фиг.1), где представлены:

1. Стадия ренатурации 72 часа.

2. Стадия концентрирования

3. 1-й цикл хроматографической

4. 2-й цикл хроматографической очистки

5. 3-й цикл хроматографической очистки Примеры конкретного выполнения способа приведены ниже.

ПРИМЕР 1

(приближение к промышленному способу)

1.1. Получение и отмывка тел включения из 150 грамм клеток штамма-продуцента E.coli SGK25/pA3GF.

Часть биомассы (150 г), полученной в ферментере с рабочим объемом 250 литров, суспендируют в лизирующем буфере объемом 1000 мл до получения однородной массы и разрушают при помощи френч-пресса при 1100 бар, охлаждая лизат клеток. Полученную суспензию сепарируют на сепараторе. Осадок отмывают с помощью ультрафильтрационных мембран с порогом отсечения 10 кДа в буфере отмывки, содержащем Твин-20, Тритон X-100 и мочевину.

Вес полученных тел включения составляет 20 г, содержание целевого белка 72%.

1.2. Солюбилизация тел включения. Восстановление белка.

Полученные тела включения суспендируют в буферном растворе pH 7-9 объемом 2500 мл, содержащим мочевину, добавляют 2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 20 мМ и перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием.

1.3. Ренатурация белка.

Раствор восстановленного белка разбавляют в 10 раз охлажденным до 8°C буфером для ренатурации, содержащим 10 мМ натрия фосфата и 10 мМ ЭДТА pH 8.0. Ренатурацию проводят 72 часа при 8°C, образовавшийся в ходе ренатурации осадок отделяют фильтрованием. Эффективность ренатурации оценивают методом ВЭЖХ. Гомогенность ренатурированного рчГ-КСФ по ВЭЖХ составляет 73%.

1.4 Удаление примесных бактериальных белков.

Полученный раствор белков наносят на колонку ХК 45/50 (Pharmacia Швеция), содержащую 100 мл ДЕАЕ сефарозы, уравновешенной буфером Трис HCl, pH которого составляет 8.0±0,05, со скоростью 50 мл/мин при температуре 8 C°. Несвязавшиеся фракции, содержащие рчГ-КСФ, собирают как целевые. В растворе частично очищенного белка снижают рН до значения 4,0±0,05. Раствор инкубируют в течение 20 часов при 8°C, осадок отделяют фильтрованием.

1.5. Концентрирование рчГ-КСФ.

Полученный раствор белка последовательно наносят на колонки ХК 45/50 (Pharmacia Швеция) с анионообменным (ДЕАЕ сефарозой (100 мл)) и катионообменным (SO₃ фрактогелем (85 мл)) сорбентами, уравновешенными ацетатным буфером с pH 4.5±0,05, со скоростью 10 мл/мин. Целевой белок элюируют с SO₃ фрактогеля в изократическом режиме уравновешивающим буфером, содержащим 0.9 M хлористого натрия. Элюат собирают в общий объем 1750 мл. Гомогенность целевого белка по ВЭЖХ составляет 83%.

1.6. Хроматографическая очистка на катионообменниках в режиме рецикла фракций.

Раствор частично очищенного белка наносят на колонку с катионообменником SO₃-фрактогелем (85 мл) со скоростью 5 мл/мин, уравновешенную ацетатным буфером с pH 4.5±0,05. Сорбент промывают уравновешивающим буфером, содержащим 0.2 M хлористого натрия и белок элюируют в градиенте хлористого натрия от 0.2 до 1.0 M в 20 объемах колонки. Фракции с гомогенностью целевого белка по ВЖЭХ 92% объединяют.

Объединенные фракции, содержащие целевой белок в тех же условиях снова наносят на колонку с катионообменником SO₃ фрактогелем. Сорбент промывают уравновешивающим буфером и белок элюируют аналогичным способом. Фракции с гомогенностью целевого белка по ВЖЭХ более 95% объединяют в качестве целевого продукта.

1.7. Стабилизация очищенного рчГ-КСФ.

Объединенные фракции диализуют против 10 объемов буфера для диализа 5 мМ натрия ацетата pH 4.0. Выход целевого белка 1003 мг. Раствор белка подвергают стерилизующей фильтрации и хранят при 8°C.

ПРИМЕР 2

2.1. Получение клеток штамма-продуцента E.coli SGK25/pA3GF проводят по п.1.1., описанному в Примере 1. Культуральная жидкость из ферментера с рабочим объемом 300 л подверглась концентрированию с помощью мембран до объема 20-30 л. Суспензию клеток дважды обрабатывали при помощи френч-пресса при 1200 бар. Содержание целевого белка в НФК составляет по данным гель-эелектрофореза в ПААГе 40-60%.

2.2. Солюбилизацию тел включения и восстановление белка проводят по п.1.2. Объем раствора восстановленного белка составляет 40 л.

2.3. Ренатурацию белка проводят по 1.3. Объем раствора ренатурирующего белка 400 л. Гомогенность ренатурированного рчГ-КСФ составляет 70% по данным ВЭЖХ.

2.4. Удаление примесных бактериальных белков проводят по 1.4. Полученный раствор белков наносят на колонку диаметром 300 мм, содержащую 6000 мл ДЕАЕ сефарозы со скоростью 600-1000 мл/мин при температуре 20°C. Закисленный раствор белка инкубируют в течение 24 часов при 12°C.

2.5. Концентрирование рчГ-КСФ проводят по 1.5. Полученный раствор белка последовательно наносят на колонки диаметром 300 мм с ДЕАЕ сефарозой (6000 мл) и SO₃ фрактогелем (6000 мл), со скоростью 200-300 мл/мин. Объем элюата 34000 мл. Гомогенность целевого белка по ВЭЖХ составляет 82%.

2.6. Хроматографическую очистку на катионообменниках в режиме рецикла фракций проводят по 1.6. Раствор белка наносят на колонку диаметром 170 мм с катионообменником СМсефароза (5000 мл) со скоростью 200-250 мл/мин, уравновешенную ацетатным буфером. Сорбент промывают уравновешивающим буфером. Белок элюируют в изократическом режиме раствором 0.13 M хлористого натрия. Фракции с гомогенностью целевого белка по ВЖЭХ 92% объединяют.

Объединенные целевые фракции белка в тех же условиях снова наносят на колонку с катионообменником. Фракции с гомогенностью целевого белка по ВЖЭХ более 95% объединяют в качестве целевого продукта.

2.7. Стабилизация очищенного рчГ-КСФ в качестве субстанции проводят по 1.7. Объединенные целевые фракции подвергают диафильтрации с использованием ультрафильтрационных мембран с порогом отсечения 10 кДа. Белковый раствор диафильтруют до выравнивания его проводимости с проводимостью буфера для хранения белка. Выход целевого белка составляет 17840 мг. Раствор белка подвергают стерилизующей фильтрации и хранят при 8°C.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать за один цикл стабильный препарат рчГ-КСФ с гомогенностью более 97% по ВЭЖХ в количестве 15-20 грамм, что в 60-100 раз больше по сравнению со способом-прототипом. При этом относительный выход белка составляет 60-80 мг/ на литр культуральной жидкости его активность составляет 1000-1400%, что превышает значения активности прототипа, а продолжительность процесса получения практически соответствуют лабораторной методике получения Г-КСФ в способе-прототипе.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ получения, выделения и очистки рчГ-КСФ. Осуществляют получение клеток рекомбинантного штамма-продуцента, а затем концентрирование культуральной жидкости. Разрушают бактериальные клетки при выделении тел включения двукратной обработкой высоким давлением. Удаляют примесные белки. Растворяют тела включения и осуществляют восстановление белка. Проводят ренатурацию белка длительностью 70-90 часов с разбавлением раствора белка до 400 л. Полученный раствор наносят на анионообменную ХК диаметром 300 мм с линейной скоростью нанесения 600-1000 мл/мин. Затем проводят концентрирование рчГ-КСФ последовательно на хроматографических колонках с анионообменным и катионообменным сорбентами. Затем осуществляют очистку рчГ-КСФ на катионообменнике в режиме рецикла фракций и стабилизацию диализом. Способ позволяет получать за один цикл стабильный препарат рчГ-КСФ в количестве 15-20 г с гомогенностью более 97% по ВЭЖХ и с гемостимулирующей активностью 1000-1400%. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ получения, выделения и очистки рчГ-КСФ, включающий в себя
а) получение клеток рекомбинантного штамма,
б) разрушение бактериальных клеток при выделении тел включения,
в) предварительное удаление примесных белков,
г) растворение тел включения,
д) восстановление,
е) ренатурацию,
ж) анионообменную и катионообменную хроматографические очистки
з) и стабилизацию рчГ-КСФ
отличающийся тем, что осуществляют концентрирование культуральной жидкости после стадии а), двукратную обработку высоким давлением при разрушении клеток штамма-продуцента на стадии б) с получением обобщенного пула отмытых тел включения, солюбилизацию тел включения, а также ренатурацию путем разбавления раствора белка до 400 л и длительностью 70-90 ч, анионообменную хроматографическую очистку в ХК диаметром 300 мм с линейной скоростью нанесения 600-1000 мл/мин с последующим концентрированием на хроматографических колонках с анионообменным и катионообменным сорбентами и хроматографической очисткой на катионообменнике в режиме рецикла фракций на стадии ж) и стабилизацию рчГ-КСФ на стадии з) диализом.

2. Способ по п.1, в котором в качестве штамма-продуцента используется штамм E.coli SGK25/pA3GF, депонированный в ВКПМ под номером В-8685.

3. Способ по п.1, отличающийся получением целевого белка на стадии концентрирования раствора рчГ-КСФ путем элюирования в изократическом режиме в присутствии 0,9 М-0,13 М хлористого натрия.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве катионообменного сорбента при хроматографической очистке белка в режиме рецикла фракций используют Фрактогель SO₃.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве катионообменного сорбента при хроматографической очистке белка в режиме рецикла фракций используют СМ сефарозу.