Применение проточной фильтрующей центрифуги для извлечения лактоферрина из молочного сырья Российский патент 2022 года по МПК A23J1/20 C07K1/34 C07K1/36 C07K1/14 C07K14/79 A61K35/20 B01D17/38 

Область техники.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой, молочной и фармацевтической промышленностях.

Извлечение лактоферрина из молочного сырья, отличающийся тем, что сорбент помещают в фильтрующую центрифугу, с последующим проточным центрифугированием, что приводит к сорбции белка на сорбенте.

Предшествующий уровень техники.

Извлечение белков из их растворов является обычной процедурой, применяемой в производстве, при этом сам процесс извлечения белков может быть осуществлен или в объеме, путем перемешивания сорбента с извлекаемым белком, так называемый Batch-вариант, но этот метод трудоемкий, требующий много времени и ручного труда и плохо поддается автоматизации. Наиболее часто используемым является способ извлечения через хроматографическую колонку (как например RU №2322505).

Описан (RU №2608499) способ получения препарата белка из образца смеси, содержащей белок. Способ включает в себя стадии проведения аффинной хроматографии с псевдодвижущимся слоем. Недостатком способа является трудоемкость процесса, высокая стоимость используемого сорбента. Отличается используемым принципом хроматографии.

Известно изобретение (RU №2325171), в котором гликопротеин выделяют из сыворотки крови человека. Используют двухстадийную аффинную хроматографию, с последующим диализом и лиофилизацией белка интереса. Недостатком метода является трудоемкость процесса. Отличается использованием другого типа хроматографии.

Наиболее показательным и часто используемым гетерогенным раствором природной смеси белков является молочное сырье. Именно поэтому выделение белков из молока, сыворотки, молозива и др. представляет особый интерес.

Так, например, известен способ (RU №2295251, 2432773) выделения белковых веществ из молочного сырья, который включает введение в молочную смесь реагента на основе хитозана и отделение осадка белковых веществ. В качестве реагента используют продукт взаимодействия хитозана с карбоксиметилцеллюлозой. Отличается использованием аффинной хроматографии.

Описан способ (RU №2659240) получения функционального продукта питания для реабилитации онкологических больных включает получение биологически активных пептидов из белков молока, а также консорциума пробиотических бактерий, выделенных из желудочно-кишечного тракта человека, с последующим смешиванием компонентов функционального продукта питания. При этом процесс получения биологически активных пептидов из белков молока осуществляют согласно схеме, включающей: внесение фосфатов, растворение казеина, доведение рН до 7,5, пастеризация, охлаждение до температуры 37±2°С, внесение энзиматической системы, включающей трипсин, химотрипсин и термолизин. Далее осуществляют последовательные стадии выделения и очистки биологически активных пептидов путем ультрафильтрации, препаративного электрофореза и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Затем для достижения необходимой консистенции биологически активных пептидов их сгущают на вакуум-выпарной установке. Недостатком способа является трудоемкость выполнения большого количества процедур. Отличается тем, что на выходе получают смесь пептидов белков молока, а не отдельные чистые белки.

Известен способ (RU №2204262) получения биологически активного белкового концентрата, где молочное сырье сначала концентрируют в 10-12 раз посредством обратного осмоса через мембрану с размером пор 1000-5000 Д при давлении 0,4-0,7 МПа и температуре 4-10°С, затем производят очистку белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением калий-фосфатного буфера с рН 6,7-7,0, посредством диафильтрации, полученный белковый концентрат стерилизуют, подвергая его микрофильтрации через мембрану. Отличается тем, что на выходе получают смесь белков молока, а не отдельные чистые белки и не используют центрифугирование.

Известен способ (RU №2400106) получения биологически активных веществ, которые могут использоваться в качестве биологически активных добавок (БАД). Способ включает в себя очистку молочного сырья, сепарирование, осаждение казеина, двухступенчатую ультрафильтрацию, хроматографическое разделение белков, диализ, микрофильтрацию, смешивание выделенных монофракций в соотношении, аналогичном их содержанию в свежевыдоенном коровьем молоке, лиофильную сушку. При этом на первой ступени ультрафильтрации осуществляют выделение из сыворотки иммуноглобулиновой фракции через мембраны 100 кДа. Повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа подвергают пермеат. Полученный при этом концентрат белков подвергают ионообменной хроматографии, иллюируя градиентом NaCl от 0,35 до 1 М с получением лактоферриновой и лактопероксидазной фракций. Отличается использованием традиционной хроматографической системы и получением смеси белков из молочного сырья.

Известен способ (RU №2407397) выделения белков из молока. В молоко вводят коагулянт - оксихлорид алюминия (ОХА) и флокулянт - высокоанионный полиакриламид (ПАА), модифицированный путем воздействия микроволнового излучения. Отличается отсутствием хроматографии в процессе выделения белков.

Известен способ (RU №2522491) выделения и очистки 3'-сиалиллактозы, 6'-сиалиллактозы, анионных олигосахаридов и/или белков из сыворотки. Способ включает

контактирование сыворотки с, по меньшей мере, одной группой ионообменных смол, которая включает первую катионообменную смолу, первую анионообменную смолу, вторую катионообменную смолу и вторую анионообменную смолу, для деминерализации сыворотки; контактирование данной деминерализованной сыворотки с двумя дополнительными или последними ионообменными смолами, включающими сильнокислотную катионообменную смолу с последующей слабоосновной анионообменной смолой. Отличается использованием двух типов смол (катионообменной и анаионообменной) и отсутствием центрифугирования.

Известен способ (RU №2348167) выделения белков из молочной сыворотки, включающий коагуляцию белков одним из известных способов и разделение образовавшейся суспензии в сепараторе с центробежной непрерывной выгрузкой осадка. При этом разделение суспензии «хлопья белков - сыворотка» осуществляется в две стадии: сначала гидроциклонированием, затем сепарированием. Отличается отсутствием хроматографии и выделением белков в смеси.

Известен способ (RU №2712886) обработки сладкой молочной сыворотки, включающий: удаление катионов из сыворотки, обработку указанного материала в реакторе с псевдоожиженным слоем, выделение белкового материала. Отличается отсутствием хроматографии и выделением белков в смеси.

Известен способ (RU №2275967) для извлечения остаточного белка из молочной сыворотки с целенаправленным регулированием аминокислотного состава пенного продукта. Используется электрофлотатор, который содержит камеру флотации с вертикальными стенками, наклонное перекрытие, систему для диспергирования газа и сборник пены. Дополнительно содержит вторую камеру флотации, в качестве системы для диспергирования газа используются электродные блоки, состоящие из графитового анода, покрывающего днище каждой камеры флотации, и катода из нержавеющей сетки. Отличается отсутствием хроматографии и выделением белков в смеси.

Известен способ (RU №2727504) двухстадийного мембранного получения гипоаллергенного продукта на основе лактоферрина. В качестве сырья используют молозиво, которое разводят водой до плотности молока, после чего полученную смесь при температуре до 30°С подвергают обезжириванию на сепараторе, в дальнейшем осаждают казеиновую фракцию с помощью сычужного фермента, после чего полученную сыворотку направляют на бактофугирование с последующей мембранной фильтрацией, в результате лактоферрин и иммуноглобулины останутся в ретентате между двумя мембранами, проводят сушку ретентата либо розлив. Отличается отсутствием хроматографии и выделением белка в смеси с иммуноглобулином.

Известен способ (RU №2736645) получения белковой композиции из молозива, который включает обезжиривание молозива, осаждение казеиновой фракции удалением из нее микрофлоры посредством первой микрофильтрации и получением пермеата П1, который подвергают второй микрофильтрации с получением пермеата П2, обогащенного лактоферрином, и ретентата Р2, обогащенного иммуноглобулинами. Ретентат Р2 далее подвергают диафильтрации с использованием мембраны, обеспечивающей разделение ретентата Р2 на пермеат П3, содержащий лактозу и минеральные соли, и ретентат Р3, содержащий иммуноглобулины, при этом все этапы способа проводят при температуре, ниже температуры денатурации лактоферрина и иммуноглобулинов; ретентат Р3 подвергают ультрафиолетовой обработке, при этом ретентат в процессе обработки перемешивают; полученные ретентат Р3 и пермеат П2 смешивают с получением белковой композиции. Отличается использованием традиционной фильтрации и получением белковой смеси.

Известен способ получения лактоферрина (RU №2717340), где проводят очистку белка из сухого лактоферрин-содержащего препарата фильтрованием от нерастворенной взвеси, внесением на колонку с катионообменным сорбентом, удалением липополисахарида, связанного с лактоферрином, элюированием лактоферрина, обессоливанием, микрофильтрацией и лиофильным высушивание. Способ позволяет получить лактоферрин чистотой 99%, не содержащий ЛПС. Отличается тем, что белок выделяют из препарата, а не из исходного молока или молочной сыворотки и используют традиционную ионообменную хроматографию.

Известен способ (RU №2579661) производства лактоферрина, фракции, содержащей лактоферрин. В качестве сырья используют молоко. Экстрагируют указанное сырье на катионнообменной смоле. Далее проводят элюирование фракции, содержащей лактоферрин. Фракция содержит лактоферрин с чистотой более чем 95% и, по существу, не содержит липополисахариды, эндотоксины и ангиогенин. Отличается тем, что использованы традиционные методы хроматографии.

Известен усовершенствованный способ (RU №2683228) очистки лактоферрина молока, при котором фильтруют молоко через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа для разделения его на фракцию ультраконцентрата, содержащую лактоферрин, и фракцию фильтрата, содержащую факторы роста и/или РНКазы с молекулярной массой менее чем 30 кДа. Во время фильтрации через фильтр с НОММ от 30 кДа до 50 кДа молоко подвергают обработке солью. Отличается тем, что использованы традиционные методы хроматографии.

Известен способ (RU №2390253) получения лактоферрина из молочного сырья, который включает в себя двухстадийную хроматографию лактоферрина из молочного сырья на колонке с сорбентом карбоксиметилцеллюлозой, ультрафильтрацию, обессоливание и лиофилизацию раствора лактоферрина. Способ отличается тем, что использованы традиционные методы хроматографии.

Известна технология (RU №2554742) опытного выделения лактоферрина человека, свободного от липополисахаридов, включающий ионообменную хроматографию молока на сильном катионообменнике, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого, обессоливание, удаление связанных с лактоферрином липополисахоридов, лиофильное высушивание. Способ отличается тем, что использованы традиционные методы хроматографии.

Известен способ выделения и очистки лактоферрина (RU №2634859) из молочного сырья, включающий одностадийную хроматографию лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом, уравновешенным натрий-фосфатным буфером, элюирование лактопероксидазы натрий-фосфатным буфером, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого, обессоливание и лиофильное высушивание. Способ отличается тем, что использованы традиционные методы хроматографии.

Таким образом, технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, из уровня техники не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».

Термины и определения

• Под термином «молочное сырье» подразумевается любое сырье, выбранное из группы: цельное молоко, полуобезжиренное молоко, обезжиренное молоко, пахта, молозиво, молоко с пониженным и низким содержанием жира, не содержащее жира молоко, молочная сыворотка (молочная плазма), в том числе после удаления казеина, концентрат молочных белков. Температура молочного сырья не должна превышать 60 градусов по Цельсию.

• Под термином «сорбент» подразумевается ионообменный сорбент на основе гидрофильного макропористого полимера.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Электрофорез целевого белка: 1 - стандарты (слева указаны положения стандартных белков с известной молекулярной массой в кДа), 1-5 - образцы лактоферрина, полученные традиционной хроматографией; 6 - коммерческий образец лактоферрина (Tatura, Australia); 7-10 - образцы лактоферрина, полученные на фильтрующей центрифуге.

Основание для осуществления изобретения.

Известные способы выделения белков из гетерогенных жидкостей сложны и чаще включает одну-две стадии анионообменной или аффинной хроматографии, при этом выход очищенного белка получается низким.

Прототипом данного изобретения может служить обычный хроматографический метод, применяемый в промышленной биотехнологии для извлечения белков из растворов с использованием хроматографических колонок, заполненных соответствующими сорбентами, через которые пропускают растворы белков для сорбции целевых белков. При этом соотношение длины к диаметру колонок обеспечивают их оптимальную работу при подобранной скорости прохождения через них растворов белков, которая принудительно задается работой насосов. Фильтрующая центрифуга может быть аналогом хроматографического процесса с геометрическими параметрами колонки, соответствующими значительной площади и небольшим слоем сорбента.

Описание изобретения

Предлагается использовать для целей сорбции белков из растворов фильтрующие центрифуги, что дает преимущество в скоростях извлечения даже минорных белков из растворов в связи с их большой фильтрующей поверхностью. Процесс можно масштабировать и автоматизировать, поэтому он удобен.

Так, если использовать центрифугу диаметром 1000 мм, с объемом барабана 175 л, площадь фильтрующей поверхности будет равна 7000 см 2, по расчетам, поэтому, используя 35 л соответствующего сорбента, мы получим слой сорбента 5 см, через который можно прокачивать жидкость с большой скоростью. Т.е., это аналогично прохождению через колонку с геометрическими параметрами, площадь поверхности: высота слоя сорбента, равными 7000 см 2: 5 см.

Это особенно критично при работе с разбавленными растворами минорных белков, где требуется пропускание через сорбент большого количества жидкости.

Преимуществом предлагаемого способа является то, что сорбент в процессе работы распределяется по поверхности барабана, образуя значительную площадь для сорбции белков, поэтому можно прокачать в единицу времени большие объемы растворов белков.

При этом необходимо подобрать соответствующий по свойствам сорбент, включающий сорбционные свойства, размер гранул, механическую прочность. А также соответствующую по своим характеристикам центрифугу, где рассчитывается площадь поверхности барабана, объем внесенного сорбента и скорость прохождения жидкости.

Примером таких растворов может служить молоко или молочная сыворотка, в больших количествах получаемая на молочном производстве. В этом случае важны большие скорости, поскольку после извлечения целевых белков, молочное сырье далее идет на переработку и не подлежит длительному хранению.

Однако по предлагаемому способу надо подбирать сорбент с соответствующим размером гранул, а также с функциональными группами, например, сильные катионо- или анионообменники, чтобы минорные белки успевали сорбироваться, а также подбирать скорость прохождения жидкости, что, впрочем, необходимо для любого процесса хроматографии.

Изобретение может быть использовано в биотехнологической, фармацевтической, пищевой, молочной промышленности.

Технический результат заключается в том, что предложен усовершенствованный способ извлечения белков из растворов. Он удобен в практическом использовании, экономически целесообразен и масштабируем. Технический эффект составляют сведения, касающиеся выхода лактоферрина, составляющего 82,5-83% (примеры 1, 2) и возможность прокачивания в единицу времени больших объемов растворов белков.

Заявляемые признаки, предопределяющие получение вышеуказанного технического результата, явно не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «изобретательский уровень».

Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретных исследований, которыми заявляемое изобретение проиллюстрировано, но не исчерпано.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1. Извлечение лактоферрина из молочной сыворотки.

В фильтрующую центрифугу диаметром 1000 мм помещают 35 л SP-Sepharose Big Beads, предварительно суспендированной в воде, в процессе фильтрования такой суспензии сорбент распределяется по поверхности фильтрующего материала при изменении скорости вращения 200-2000 оборотов в минуту. Затем подают молочную сыворотку, 14000 л. Далее снова промывают двумя объемами деионизованной воды. Затем промывают 0,3М раствором хлорида натрия для освобождения от лактопероксид азы и примеси минорных белков. Элюирование лактоферрина проводят либо непосредственно в центрифуге при подаче 1М раствора хлорида натрия на скорости 50-200 оборотов в минуту. Также возможно выгрузить сорбент в хроматографическую колонку и промыть последовательно 0,ЗМ и 1М раствором хлорида натрия. В результате при концентрации лактоферрина в исходном сырье 30 мг/л, выход составил 350 г, т.е. 83%.

Пример 2. Извлечение лактоферрина из молока.

В фильтрующую центрифугу диаметром 500 мм помещают 10 л SP-Sepharose Big Beads, затем подают предварительно обезжиренное молоко в количестве 10000 л для извлечения лактоферрина с последующей промывкой деионизованной водой, раствором хлорида натрия и элюцией лактоферрина, как в примере 1. При концентрации лактоферрина в исходном сырье 20 мг/л, выход составил 165 г, т.е. 82,5%.

Пример 3. Контроль хроматографического выделения целевого белка

Экспериментальная работа выполнена при использовании УНУ «Трансгенбанк». Для проверки образцов лактоферрина, полученных из молочной сыворотки при традиционной хроматографии и при использовании фильтрующей центрифуги, разделяли гель-электрофорезом в денатурирующих условиях, после чего получали изображение с помощью гель-документационной системы, что свидетельствует о сходных параметрах полученного высокоочищенного целевого белка (Фиг. 1).

Изобретение относится к молочной промышленности, а также может быть использовано в биотехнологической, фармацевтической промышленности. Предложено применение проточной фильтрующей центрифуги для извлечения лактоферрина из молочного сырья. Изобретение позволяет обеспечить выход лактоферрина, составляющий 82,5-83% и возможность прокачивания в единицу времени больших объемов растворов белков. 1 ил., 3 пр.

Применение проточной фильтрующей центрифуги для извлечения лактоферрина из молочного сырья.