КОМПЛЕКСНЫЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2015 года по МПК A61K31/496 A61K31/22 A61P31/04 

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано с лечебной или лечебно-профилактической целью при респираторных и желудочно-кишечных заболеваниях бактериальной и микоплазменной этиологии, в том числе энзоотической пневмонии, плевропневмонии, сальмонеллезе, пастереллезе, микоплазмозе, колибактериозе и других инфекциях у животных, в частности, у свиней, кур и индеек.

Свиноводство и птицеводство являются одними из особенно интенсивно развивающихся отраслей народного хозяйства. Отличительной особенностью данных отраслей являются средние или крупные сельхозпредприятия со сложной эпизоотической ситуацией. Факторы, действующие негативно в условиях комплексов, - это содержание большого поголовья животных на ограниченной площади, рост числа ослабленных животных с нарушениями обмена веществ и иммунодефицитами. Кроме того, ситуацию осложняют не всегда благоприятные экологические условия. Все это нередко приводит к появлению и быстрому распространению разнообразных заболеваний. Больное же животное - это источник дальнейшего распространения инфекции, даже если клинические признаки проявляются в стертой форме или латентно. Таким образом, в комплексе мер по борьбе с заразной патологией животных, наряду со специфической профилактикой и ветеринарно-санитарными мероприятиями, по-прежнему одно из ведущих мест должно отводиться применению эффективных антимикробных средств.

Антибактериальная терапия является важнейшей составляющей комплексного эффективного лечения животных. Однако широкое бесконтрольное использование антибактериальных средств в предыдущие десятилетия привело к росту антибиотикорезистентности полевых штаммов различных возбудителей, формирующих ассоциации. Лечение инфекционных заболеваний, вызываемых такими микроорганизмами и их ассоциациями, остается проблемой как в отношении продуктивных, так и в отношении мелких домашних животных. Так как данные заболевания наносят ощутимый экономический ущерб, борьба с ними является актуальной задачей.

В соответствии с изложенным, из-за широко распространенной резистентности инфекционных агентов ко многим применяемым антибиотикам постоянно ведется поиск новых химиотерапевтических антибактериальных препаратов, отличающихся по механизму действия.

Исследования отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют о том, что наиболее эффективными оказываются комплексные препараты на основе высокоактивных современных субстанций, сочетание которых обеспечивает эффект синергизма и широкий диапазон чувствительной к препарату микрофлоры.

В настоящее время благодаря высокой частоте использования в лечебной практике и существенной роли в терапии инфекционных процессов в первых рядах «борцов с микробами» по праву находятся фторхинолоны. Хинолоны вообще, а фторхинолоны в частности не имеют аналогов в природной среде, что обеспечивает их высокую активность относительно полирезистентных штаммов микроорганизмов. Также не описаны случаи формирования резистентности у микроорганизмов после длительного применения фторхинолонов.

Известны препараты с широким спектром действия, в состав которых входят фторхинолоны (см., например, CN 102846615 A, 02.01.2013, WO 2009136408 A1, 12.11.2009, KR 20090102053 A, 30.09.2009, EP 1880722 A1, 23.01.2008, препарат Ципрокол - адрес в Интернете: http://vetsintez.com.ua/catalog/at2, ООО Ветсинтез, 18.10.2011).

Наиболее близким аналогом заявленного препарата является Ципрокол.

Препарат производится в Украине и содержит в своем составе соединение из группы фторхинолонов - ципрофлоксацин, а также полипептидный антибиотик - колистина сульфат и вспомогательные вещества.

Недостатком препарата является неудобство его использования - препарат выпускают в ампулах, и его рекомендуется использовать в комплексе с аскорбиновой кислотой (витамином C), при этом сначала растворяют в воде аскорбиновую кислоту, затем - препарат.

Задачей изобретения является разработка отечественного антибактериального препарата с комбинированным механизмом действия, обладающего высокой эффективностью против смешанных антибиотикорезистентных инфекций у животных, малотоксичного и стабильного при хранении.

Поставленная задача решается тем, что разработан комплексный антибактериальный препарат для животных, который содержит соединение из группы фторхинолонов, вспомогательные вещества и, согласно изобретению, дополнительно содержит соединение из группы плевромутилинов в эффективном количестве.

Поставленная задача решается также тем, что препарат содержит соединения из группы фторхинолонов и из группы плевромутилинов в соотношении (в масс.ч.) 1:3.0-1:225.0

Кроме того, поставленная задача решается тем, что в качестве фторхинолонов заявленный препарат содержит ципрофлоксацин, или пефлоксацин, или офлоксацин, или энрофлоксацин, или норфлоксацин, или ломефлоксацин, или левофлоксацин, или моксифлоксацин, или спарфлоксацин, или эноксацин.

Поставленная задача может быть решена тем, что в качестве плевромутилинов заявленный препарат содержит тиамулина гидроген фумарат или тиамулин.

В качестве вспомогательных веществ для решения поставленной задачи целесообразно использовать сахара, а в качестве сахаров - сахарную пудру, или глюкозу, или фруктозу, или декстрозу, или лактозу, или лактулозу.

Технический результат, полученный в результате реализации заявленного изобретения, заключается в том, что препарат обладает выраженным антимикробным действием как на грамотрицательную, так и грамположительную микрофлору, при этом эффективно действует как на вегетативные, так и споровые формы бактерий, безвреден, позволяет эффективно лечить широкий спектр болезней бактериальной этиологии у животных в условиях отсутствия данных о возбудителе инфекции и его чувствительности к антибиотикам, не обладает аллергенными свойствами, оказывает стимулирующее влияние на показатели гуморального иммунного ответа и стабилен при хранении.

Механизм действия заявленного препарата основан на способности фторхинолонов ингибировать активность фермента гиразы, обеспечивающего репликацию ДНК в бактериальной клетке, а также нарушении мембраны бактериальной клетки и элиминации R-плазмиды, что препятствует развитию резистентности микроорганизмов к препарату, и подавлении плевромутилинами синтеза протеинов бактерий путем связывания с 70S-субъединицей рибосом микроорганизмов и нарушения процесса формирования комплекса «м-РНК-тРНК» у микробной клетки.

Фторхинолоны обладают широким спектром антибактериального и антимикоплазменного действия. Активны в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе Echerichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Proteus spp., Yersinia spp, Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Campylobacter jejuni, Brucella spp., Chlamydia trachomatis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium spp., Corynebacterium diphtheriase, Staphylococcus aureus и Streptococcus spp., а также Mycoplasma spp.

Максимальная концентрация фторхинолонов в сыворотке крови отмечается, как правило, через 1,5-2 часа, терапевтическая концентрация сохраняется в течение 24 часов после перорального применения лекарственного средства. Выводится из организма в основном в неизменном виде и частично в форме метаболитов с мочой и желчью.

По степени воздействия на организм фторхинолоны относятся к умеренно опасным веществам (3 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76).

Плевромутилины оказывают бактериостатическое действие в отношении микоплазм, включая М.hyopneumoniae, М.hyosynoviae, М.hyorhinis, М.gallisepticum, М.synoviae, М.meleagridis, спирохет (В.huodysenteriae, В.pilosicoli), грамположительных аэробов, в том числе Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium pyogenes и анаэробов (Clostridiym perfringens), грамотрицательных анаэробов, в том числе Lawsonia intracellularis, Bacteroides spp., Fusobacterium spp. и аэробов Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida; не действуют на бактерии семейства Enterobacteriaceae, включая Salmonella spp. и Echerichia coli.

При пероральном введении плевромутилины быстро всасываются в желудочно-кишечном тракте и проникают в большинство органов и тканей, достигая максимальных концентраций в организме птиц через 4 часа, в организме свиней - через 2 часа, и сохраняются на терапевтическом уровне на протяжении 18-24 часов. Выводятся из организма преимущественно с фекалиями.

Плевромутилины по степени воздействия на организм относятся к умеренно опасным веществам (3 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76): ЛД50 при пероральном введении белым мышам составляет 700 мг/кг массы животного.

Изобретение характеризуется следующими примерами выполнения, которые, в свою очередь, не ограничивают объем притязаний заявителя.

Пример 1. Получение препарата

Препарат получают путем смешивания компонентов. Состав композиции в одном из вариантов ее выполнения следующий (мг/г порошка):

ципрофлоксацин 100 тиамулина гидроген фумарат 365 сахарная пудра до 1 г

Пример 2. Исследование токсичности препарата

Экспериментальные исследования проводили на четырех видах животных: белых крысах, белых мышах, поросятах и цыплятах. Исходный вес лабораторных животных колебался в пределах: для крыс - 180-210 г; для мышей - 18-20 г. В опыт брали клинически здоровых животных, которых предварительно выдерживали на пятнадцатидневном карантине.

Исследования проводили в условиях острых, подострых и хронических экспериментов при введении препарата в желудок.

Опыт по определению острой токсичности проводили на белых крысах. За животными вели наблюдение в течение 2-х недель после введения, отмечая сроки гибели или выздоровления животных. Учитывали общее состояние животных, сохранение двигательных функций, аппетита, состояние шерстного покрова, дыхания, реакцию на внешние раздражители.

Изучение переносимости препарата проводили в условиях однократного введения препарата в терапевтической и трех-пятикратно увеличенной дозах. Однократный эксперимент проводили на поросятах и цыплятах.

Изучение субхронической токсичности проводили на крысах, поросятах и цыплятах при введении препарата в желудок.

В первой серии опыта были задействованы самцы белых крыс массой 130-140 г. Во второй серии при испытании использовали поросят и цыплят.

Препарат задавали животным в течение 20 суток в дозах 0,136 г по ДВ на 1 кг массы животного (поросята) и 0,33 г на кг массы животного (цыплята), что, соответственно, в 3 раза больше однократной рекомендуемой дозы. Третья группа животных служила контролем, препарат не получала.

Наблюдение за состоянием животных проводили в течение 20 суток.

При этом использовали показатели, характеризующие как общее, так и специфическое действие препарата.

В качестве интегральных показателей использовали следующие: определение массы тела и оценка периферической крови животных.

Состояние периферической крови оценивали с помощью общепринятых методик. Определяли: количество гемоглобина, лейкоцитов и эритроцитов. Для вычисления лейкограммы кровь фиксировали спиртом на мазках и окрашивали по Романовскому. Специфическими можно считать оценку функционального состояния печени, почек и обменных процессов в организме (белковый и азотистый обмены).

Функциональное состояние печени оценивали, в основном, с помощью биохимических исследований.

О белковообразовательной функции печени судили по содержанию белка в сыворотке крови. Этот показатель определяли по цветовой реакции с ортотолуидином.

Изучение функционального состояния почек проводили по комплексу методов: измеряли диурез, определяли удельный вес мочи и pH, содержание в моче белка, сахара, ацетоновых тел и индикана.

Определение белка в моче основывалось на взаимодействии белка с сульфосалициловой кислотой, в результате которого степень помутнения анализировали с помощью фотоколориметрического анализа.

Содержание сахара определяли экспресс-методом.

Из всех продуктов белкового обмена наибольшее значение имеют содержащиеся в крови животных мочевина и креатинин.

При изучении препарата учитывали влияние на содержание в организме K, Na, Ca, которые, как известно, обеспечивают нормальное осуществление всех функций организма.

Данные, полученные при вышеуказанных исследованиях, были проанализированы методом математической статистики с вычислением средней величины (M), ее ошибки (±m) и уровня значения величины Р.

Изучение острой токсичности препарата

Препарат вводили в желудок белых крыс в виде 50% водной суспензия. Были испытаны дозы - 4,0; 6,0; 10,0 и 12,0 г/кг м.т. (объем вводимой суспензии составлял 1,6; 2,4; 4,0; 4,8 мл на крысу массой 200 г соответственно).

В результате исследований установлено, что ЛД₅₀ средства составляет 8,5±0,84 г/кг м.т. Согласно классификации (ГОСТ 12.1.007-76) заявленный препарат - малотоксичное соединение (4 класс).

Пример 3. Оценка функционального состояния печени после однократного применения препарата

Для выявления токсического действия лекарственных веществ использовали гексеналовую пробу, основанную на определении длительности гексеналового сна, и провели опыт на белых мышах.

Длительность гексеналового сна обусловлена, в первую очередь, функцией печени и зависит от времени, необходимого для концентрации гексенала в крови ниже уровня, вызывающего наркоз. При поражении печени какими-либо токсическими веществами обезвреживание гексенала замедляется, что приводит к увеличению длительности сна.

Определение функционального состояния печени у белых мышей при оральном введении заявленного препарата проводили по методике Розина на 90 нелинейных белых мышах массой 18 - 20 г, которых разделили на 9 групп по равному количеству мышей в каждой: 3 группы - контрольные, 6 групп - опытные. Контрольным животным перорально вводили физиологический раствор в дозе 1 мл на голову. Половине подопытных животных вводили заявленный препарат перорально в дозе, равной ЛД16 (15000 мг/кг), а второй половине - в дозе ЛД50 (20000 мг/кг) массы тела. Препарат мышам вводили натощак и через 1, 3 и 6 часов вводили гексенал внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг массы тела.

Продолжительность гексеналового наркоза учитывали с момента принятия мышами бокового положения до первых попыток его изменить.

При оценке функционального состояния печени белых мышей контрольных групп было отмечено, что через 1 час после введения физраствора продолжительность гексеналового наркоза составила 32,3±4,4 мин, через 3 часа - 30,3±4,6 мин и через 6 часов - 33,7±4,5 мин. Как видно из представленных данных, с увеличением времени исследования, после введения физраствора функция печени практически не изменилась.

При введении препарата в дозе ЛД16 было установлено, что продолжительность гексеналового сна через час после введения составила 31,8±4,1 мин, а через 3 часа - 30,2±3,8 мин и через 6 часов - 32,4±4,1 мин, хотя несколько и снижается, но достоверно не отличается (P>0,05) от контрольной группы.

При увеличении дозы препарата до ЛД50 продолжительность гексеналового наркоза через час составила 32,6±4,1 мин, что достоверно не отличается (P>0,05) от контрольной группы. Однако через 3 часа после введения препарата было отмечено увеличение продолжительности гексеналового сна до 39,6±4,1 мин, а через 6 часов - уменьшение длительности гексеналового сна до 30,2±4,6 мин, что достоверно отличается (P<0,05) от контрольной группы. Видимо, большая доза заявленного препарата первоначально вызывает ингибирование активности митохондриальных ферментов, что приводит к резкому увеличению времени сна. Впоследствии из-за быстрого разрушения препарата количество ферментов остается в гепатоцитах в значительных количествах, быстро разрушает гексенал, и длительность сна снижается.

Таким образом, заявленный препарат в дозах, близких к ЛД50, вызывает непродолжительное угнетение функции печени, восстанавливающееся через 6 часов после введения препарата. Меньшие дозы препарата (ЛД16) не вызывают функциональных изменений в печени.

Пример 4. Оценка местнораздражающего и кожно-резорбтивного действий заявленного препарата

Опыт провели на морских свинках и крысах, которым за сутки до начала опыта вогнутыми ножницами выстригли шерсть на участке кожи площадью 3×4 см² в области спины.

Заявленный препарат в дозе 0,045 г/кг по ДВ на твине наносили на каждую поверхность и слегка втирали. После нанесения препарата каждое животное помещали отдельно на 4 часа во избежание потерь препарата. В дальнейшем животные содержались в обычных клетках.

В течение 30 суток после начала опыта вели визуальное наблюдение за внешним видом, состоянием и поведением животных. Отмечали время, степень проявления признаков токсикоза, а также падеж животных.

Реакцию кожи учитывали по шкале оценки кожных проб.

В результате экспериментов, проведенных по стандартным методикам, было показано, что однократная аппликация препарата на кожу морских свинок в дозе 0,045 г/кг по ДВ в течение 4 часов не вызывала изменений состояния животных. Не выявлено гибели животных во всех группах, что свидетельствует об отсутствии местно-раздражающего действия препарата при его однократном применении.

Кожно-резорбтивное действие изучали на крысах. Крыс опытной группы фиксировали в специальных домиках, а их хвосты погружали на 2/3 длины в пробирки с препаратом, приготовленным на твине в соотношении 1:10. Время экспозиции - 4 часа в течение 5 дней. Хвосты крыс контрольной группы погружали на 2/3 длины в пробирки с твином.

Как показали исследования, опытные крысы на протяжении эксперимента практически не отличались от контрольных.

Наблюдение в течение двух недель после нанесения препарата не выявило каких-либо проявлений интоксикации, кожа покрывалась равномерным гладким шерстным покровом, животные были подвижны и хорошо ели.

Следовательно, препарат не вызывает местно-раздражающего и кожно-резорбтивного действия при однократном нанесении на кожу в дозе 0,045 г/кг по ДВ и относится к 4 классу опасности.

Пример 5. Изучение субхронической токсичности препарата на лабораторных животных, поросятах и цыплятах

Крысы

Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 130-140 г. Животным в желудок ежедневно в течение 2-х месяцев через желудочный зонд вводили препарат в виде суспензии на крахмальном клейстере в дозах 1/10 и 1/100 от ЛД50, что соответствовало 200 и 20 мг/кг. Каждая подопытная и контрольная группы состояли из равного количества животных. Животным контрольной группы, при тех же условиях содержания и кормления, вводили равный объем крахмального клейстера.

Признаков токсикоза и гибели животных не наблюдали, что дает основание говорить об отсутствии у препарата в указанных дозах эффекта кумуляции по токсическому признаку.

Обследование с использованием клинико-биохимических методов животных, получавших в течение 2-х месяцев препарат в дозе 0,01 и 0,001 от ЛД50, не показало статистически значимых отличий опытных и контрольных групп. Анализы проводили на 60-й день опыта после декапитации животных.

В результате исследований установлено, что препарат не влияет на прирост массы тела животных.

Кровь для исследований брали из хвостовой вены, количество эритроцитов и лейкоцитов определяли в камере Горяева, уровень гемоглобина - фотометрическим методом.

Гематологические показатели крыс, получавших заявленный препарат, не отличались от таковых у животных контрольной группы (P≥0,05).

Биохимические показатели животных изучали также после введения препарата в дозах 1/100 и 1/1000 от ЛД₅₀. Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) определяли по Райтману и Френселю, пировиноградную кислоту (ПВК) - по Фридману и Хаугену, молочную кислоту - по методу Баркера и Саммерсона.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии разницы в показателях крови крыс разных групп (P≥0,05).

Функциональное состояние почек после продолжительного введения препарата в дозах 0,01 и 0,001 от ЛД₅₀ оценивали по показателям суточного диуреза, содержанию белка и мочевины. Мочу собирали в течение 24 часов в метаболические камеры при нормальной водной нагрузке. Определение мочевины и белка проводили общепринятыми методами.

В результате исследований установлено, что препарат не оказывает отрицательного влияния на функциональное состояние почек.

Поросята

Изучение субхронической токсичности заявленного препарата проводили на поросятах массой 28-32 кг, разделенных поровну по принципу аналогов на 3 группы. Препарат в течение 20 суток вводили животным ежедневно однократно с кормом в суточной дозе:

I группа - 0,135 г/кг массы тела (трехкратная терапевтическая доза);

II группа - 0,045 г/кг массы тела (терапевтическая доза);

III группа - контрольная группа (препарат не получали).

Наблюдение за клиническим состоянием животных вели на протяжении 30 суток от начала опыта. Через сутки и через десять суток после последнего введения препарата проводили клиническое исследование крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, выводили лейкоцитарную формулу).

В эти же сроки оценивали функциональное состояние почек по анализам мочи, в которой определяли содержание белка, углеводов, билирубина, уробилина, кетоновых тел, удельный вес, а также по определению в сыворотке крови содержания креатинина и мочевины.

О функциональном состоянии печени судили по изменению активности гепатоспецифических ферментов (холинэстеразы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы), определению содержания билирубина в крови.

Введение препарата в дозах 0,135 г и 0,045 г на кг массы тела в течение 20 дней не вызывало видимых клинических изменений в организме поросят. Животные активно двигались, хорошо и полностью поедали корм, адекватно реагировали на внешние раздражители.

В результате проведенных исследований установлено, что при введении препарата в дозах 0,135 г и 0,045 г на кг массы тела, картина крови у поросят практически не изменяется и находится в пределах физиологической нормы.

О функциональном состоянии печени судили по определению содержания гепатоспецифических ферментов и билирубина в сыворотке крови. У животных I и II групп активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы и содержание билирубина находились в пределах физиологической нормы и достоверно не отличались (P>0,05) от показателей контрольной группы.

Таким образом, 20-дневное применение заявленного препарата в дозах 0,135 г и 0,045 г на кг массы тела не влияет на функцию печени.

Моча, взятая от животных всех групп, соответствовала физиологической норме: прозрачная, желтого цвета, специфического запаха, удельный вес 1,018-1,021, pH 8,6-8,7: белок, углеводы, билирубин. Содержание креатинина и мочевины в сыворотке крови поросят опытных групп находилось в пределах физиологической нормы и достоверно не отличалось (P<0,05) от показателей контрольной группы.

Отсутствие изменений в моче, нормальный уровень креатинина и мочевины в сыворотке крови свидетельствует о том, что заявленный препарат не обладает нефротоксическим действием у поросят во всех испытанных дозах.

В результате проведенных исследований установлено, что 20- дневное введение заявленного препарата в терапевтической и трехкратной терапевтической дозе не оказывает функциональных изменений в организме поросят.

Цыплята

Изучение субхронической токсичности препарата проводили на цыплятах массой 220-230 г, находящихся в одинаковых условиях кормления и содержания. Подопытных птиц по принципу аналогов разделили на 3 равные группы. Препарат задавали каждому цыпленку из первых двух групп ежедневно в течение 20 дней через зонд в зоб в следующих дозах:

1 группа - 0,33 г/кг массы тела (трехкратная терапевтическая доза);

2 группа - 0,11 г/кг массы тела (терапевтическая доза);

3 группа - контрольная группа (препарат не получала).

Наблюдение за клиническим состоянием птицы вели на протяжении 25 суток от начала опыта. Через сутки после последнего введения заявленного препарата проводили клиническое исследование крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, лейкоцитарная формула).

В процессе опыта гибели птицы не отмечали. Клиническое состояние цыплят в период опыта не изменялось. В течение эксперимента подопытные цыплята были активны, подвижны, аппетит был сохранен. Потребление воды и корма в опытных и контрольных группах было одинаковое.

В результате проведенных исследований установлено, что при 20- дневном введении препарата в трехкратно увеличенной дозе (1 группа) и терапевтической дозе (2 группа) все клинико-биохимические показатели крови у опытных групп находятся в пределах физиологической нормы и не отличаются (P<0,05) от показателей контрольной группы.

Пример 6. Переносимость заявленного препарата поросятами и цыплятами

Под опытами находились поросята и цыплята. Животных разделили на 3 группы (две подопытные и одну контрольную). В качестве контроля были использованы данные исследований, полученные в подопытных группах до дачи препарата. Препарат задавали через рот в двух вариантах: в первом - в терапевтической дозе: для поросят - 0,045 г на кг массы тела животного, для цыплят - 0,112 г на кг массы тела, и во втором варианте - в 5 раз увеличенной.

Данные, полученные при вышеуказанных исследованиях, были проанализированы методом математической статистики с вычислением средней арифметической величины (M), ее ошибки (+m) и уровня значения величины P. В связи с тем, что данные, полученные в результате гематологических исследований, находились в тех же пределах, что и у контрольных животных, был проведен статистический обсчет их суммированно по всем дням каждой дозы.

Свиньи

В течение 10 дней за животными вели наблюдение, брали кровь и исследовали гематологические и биохимические показатели.

Отклонений в поведении и состоянии животных первой и второй групп не отмечали, за исключением угнетенного состояния у одной свиньи из группы в течение 24 часов. В гематологической картине отмечали незначительные сдвиги у свиней второй группы в лейкоформуле (эозинофилия достигала до 4,4% через сутки). Однако эти изменения не выходили за рамки физиологической нормы.

Цыплята

Препарат задавали однократно натощак при введении в зоб. Наблюдения проводили в течение 10 дней. Кровь брали до дачи препарата, через 1, 5 и 10 дней, при этом подсчитывали гемоглобин, эритроциты, лейкоциты и выводили лейкоформулу.

Однократное применение препарата в рекомендуемой дозе не вызывало клинических изменений в состоянии цыплят: животные активно двигались и реагировали на внешние раздражители, аппетит был сохранен. При увеличении рекомендуемой дозы в 5 раз у подопытных животных также не было отмечено отклонений от физиологической нормы.

Гематологические показатели крови у животных опытных групп находились в пределах физиологической нормы и не отличались от показателей контрольной группы.

Пример 7. Изучение аллергенных свойств препарата

Опыты по изучению аллергенных свойств препарата проводили на морских свинках методом гистаминового шока и на мышах по непрямой дегрануляции тучных клеток. Сущность метода гистаминового шока заключается в том, что у морских свинок подкожное введение гистамина в дозе 5 мг/кг вызывает гистаминовый шок, оканчивающийся смертью. Если изучаемый препарат обладает антигистаминным действием, то предварительное его введение должно предотвратить смерть животного от гистамина, в противном случае смерть животного наступает в более короткие сроки и от меньших доз гистамина.

В опыте использовали клинически здоровых морских свинок массой 180-220 г. Подопытным свинкам задавали препарат перорально в дозе 0,045 г на кг массы тела животного. Контрольным животным препарат не вводили. Гистамин вводили подкожно в дозе 5 мг/кг одновременно как подопытным, так и контрольным морским свинкам через 6 и 12 часов после введения препарата.

Результаты опыта указывают на то, что заявленный препарат в терапевтической дозе не обладает антигистаминной активностью, т.к. не предотвращает смерть животных от введенной дозы гистамина, а также и не ускоряет ее, что указывало бы на гистаминное аллергенное действие.

Все животные подопытной и контрольной групп пали приблизительно в одни и те же сроки. Так, при введении гистамина морским свинкам через 6 часов после введения препарата время наступления гистаминового шока равнялось 18,9±0,12 мин, через 12 часов - 18,8±0,15 мин, а у контрольных животных соответственно 18,8±0,15 и 19,0±0,12. Разница в показателях животных подопытных и контрольных групп оказалась несущественной (P>0,05).

Реакция подопытных и контрольных групп животных на введение гистамина была одинаковой. У всех морских свинок наблюдали симптомы развития шока: выраженная депрессия, сонливость, беспокойство, учащение дыхания, боковое положение, судороги, одышка и смерть.

Реакцию дегрануляции тучных клеток провели на мышах линии СВА, которым задавали препарат, разведенный в крахмальном клейстере 1:10 в дозе 0,045 г на кг массы тела животного по ДВ. Через 2 дня мышей убили, собрали сыворотку крови. Тучные клетки выделяли из перитонеальной жидкости крыс-самцов массой 180-200 г после внутрибрюшинного введения физраствора с гепарином в количестве 10 мл.

Затем на предметные стекла, покрытые 0,3% нейтральротом на абсолютном спирте, наносили по 1 капле тучных клеток, сыворотки крови от подопытных мышей и препарата в разведении 1:10. В контрольную пробу брали тучные клетки и сыворотку крови от тех же мышей (по 1 капле) и по разнице процента дегрануляции тучных клеток в опыте и в контроле судили о сенсибилизации организма. Для контроля достоверности полученных данных подсчитывали процент дегрануляции тучных клеток в перитонеальной жидкости (10%) и с комплементом (8%).

Согласно полученным данным процент дегрануляции тучных клеток составил 7,6±0,12, что свидетельствует о том, что препарат не обладает сенсибилизирующими свойствами.

Пример 8. Иммунотоксические свойства препарата

Иммунотоксические свойства препарата изучены в 4 опытах на мышах линии СВА массой 18-20 г.

О влиянии препарата на клеточный иммунитет судили по индукции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и по изменению количества ауторозеткообразующих клеток (ауто-РОК) по методу Jondal М. et al. (1972), в качестве эритроцитарного маркера в этом тесте применяли 1,5%-ную взвесь аутологичных эритроцитов.

Влияние препарата на антителообразование изучали методом локального гемолиза и в реакции гемагглютинации при иммунизации мышей эритроцитами барана (ЭБ). Титры агглютининов определяли в микроварианте прямой реакции гемагглютинации, вычисляли супрессивный индекс (СИ).

Достоверность результатов исследований оценивали по критерию Стьюдента.

Для определения антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышам перорально вводили в терапевтической дозе препарат одновременно с внутрибрюшинной иммунизацией их эритроцитами барана (ЭБ) - 2% взвесь в объеме 0,5 мл/мышь. На 4-е сутки извлекали селезенки, получали лимфоциты и проводили исследование. Вокруг каждой антителообразующей клетки возникает зона гемолиза, которая видна на агаре в виде прозрачной точки. Увеличение числа продуцентов антител в селезенке мышей, которым введен препарат, свидетельствует о стимулирующем действии препарата на антителообразование, снижение их числа по сравнению с контролем (ЭБ) - об его угнетении. Индекс стимуляции (ИС) определяли как отношение числа АОК в опыте к числу АОК в контроле (введение только ЭБ). ИС 1,5 и выше - стимулятор, ниже 0,7 - иммунодепрессант.

Судя по полученным данным, введение препарата приводит к активизации трансформации В-лимфоцитов в АОК по сравнению с контролем, что выражается в статистически достоверном увеличении количества АОК в селезенке. ИС увеличился в 3,85 раза, что говорит о стимулирующем воздействии препарата на антителогенез, т.е. заявленный препарат усиливает гуморальный иммунный ответ у животных. Увеличение содержания АОК предшественников B-лимфоцитов связано с активизацией функциональной активности T-лимфоцитов.

Установлено, что заявленный препарат оказывает стимулирующее воздействие на гуморальный иммунный ответ, что выражается повышением индекса стимуляции до 5,2.

Изучение действия иммуномодуляторов на клеточное звено иммунного ответа предполагает использование модельных систем, дающих представление о функциональной активности лимфоцитов T-ряда. К таким тестам относится реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и определение изменения количества ауторозеткообразующих клеток, которые у мышей аналогичны Т-лимфоцитам.

Одновременно с внутрижелудочным введением тестируемого препарата мышей внутрибрюшинно иммунизировали 2% взвесью ЭБ. На 5-е сутки вводили разрешающую дозу ЭБ - 10% взвесь в объеме 0,02 мл в подушечки правых лап, в коллатеральную лапу вводили 0,9% раствор NaCl. Через 24 часа определяли сдвиг ИС.

Установлено, что препарат в терапевтической дозе вызывает индукцию ГЗТ у мышей, т.е. местную воспалительную реакцию, которая обусловлена инфильтрацией клетками воспалительного очага, а не сосудистой реакцией. У мышей это полиморфноядерные лейкоциты, мононуклеары, которые через несколько дней превращаются в тканевые макрофаги. Введение препарата вызывало сдвиг ИС на 32,4%, что достоверно отличалось от показателей контрольных животных - 8,8%. Усиление РГЗТ под влиянием препарата указывает на его способность стимулировать продукцию лимфокинов-медиаторов клеточного иммунитета. Интенсивность синтеза и секреции лимфоцитами факторов клеточного иммунитета соответствует степени выраженности воспалительной реакции в месте введения разрешающей дозы антигена (ЭБ) и характеризует активность популяции хелперных клеток, ответственных за проявление реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Пример 9. Оценка антимикробной активности заявленного лекарственного препарата

В работе использовали в качестве тест-штаммов культуры S. aureus АТСС 6538Р (FDA 209Р), Ps. aeruginosa АТСС 9027, Е.coli АТСС 25922, Вас.subtilis АТСС 6633 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИГенетика» и культуру Salmonella abony №103/39, полученную из Коллекции ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздрава России.

Исследования проводили на питательных средах производства ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» №8 ГРМ, рег. уд. № ФСР 2007/00839 от 27.12.2011 г. и №1 ГРМ, рег. уд. № ФСР 2011/11415 от 27.12.2011 г.

Навески препарата (20-30 мг) растворяли в стерильной воде и готовили серийные разведения на жидкой питательной среде №8 ГРМ.

Для инокуляции использовали свежие 24-часовые культуры микроорганизмов, выращенные в среде №8, с определением инокулирующей дозы титрованием на среде №1 поверхностным методом. Инокулирующие дозы микроорганизмов составляли от 1,0×10⁵ до 2,5×10⁶ КОЕ.

В результате проведенных исследований установлено, что препарат обладает выраженным антимикробным действием как на грамотрицательную (Ps. aeruginosa, E.coli, Salmonella abony), так и грамположительную (S.aureus, Вас.subtilis) микрофлору. При этом препарат эффективно действует как на вегетативные, так и споровые формы бактерий.

Препарат стабилен в течение трех лет со дня производства при хранении при температуре от 5°C до 25°C.

Следует также отметить, что в качестве соединения ряда фторхинолонов в составе препарата были испытаны следующие соединения: пефлоксацин, офлоксацин, энрофлоксацин, норфлоксацин, ломефлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, спарфлоксацин, эноксацин. В качестве соединения плевромутилинов в составе препарата был испытан также тиамулин, а в качестве вспомогательных веществ - глюкоза, фруктоза, декстроза, лактоза, лактулоза.

Результаты исследований композиций с перечисленными выше ингредиентами при условии соотношений соединения из группы фторхинолонов и из группы плевромутилинов (в масс.ч.) в диапазоне от 1:3.0 до 1:225.0 достоверно схожи с результатами исследований препарата по примеру 1 и поэтому не отражены в настоящем описании.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы:

- ЛД₅₀ заявленного препарата составляет 8,5±0,84 г/кг м.т. - малотоксичное соединение (4 класс) - согласно классификации (ГОСТ 12.1.007-76);

- препарат не вызывает функциональных изменений в печени (по гексеналовой пробе);

- препарат не обладает аллергенными свойствами;

- при однократной даче в пятикратно увеличенной дозе (для поросят - 0,225 г на 1 кг массы животного и для цыплят - 0,55 г на 1 кг массы животного) препарат не вызывает каких-либо изменений со стороны гематологических и биохимических показателей крови организма свиней и птиц;

- двадцатидневная дача препарата (субхроническая токсичность) свиньям и птице не вызывает изменений в гематологических и биохимических показателях крови и мочи;

- препарат в терапевтической дозе 0,045 г на 1 кг массы животного оказывает стимулирующее влияние на показатели гуморального иммунного ответа, повышая ИС в АОК в 4,88 раза, и реакциях гетерофильных агглютининов в 5,22 раза и особенно Т-систему иммунитета, что выражается в повышении активности иммунокомпетентных клеток, взаимодействие которых и обуславливает развитие иммунного ответа у животных (ИС_гзт 32,4%);

- препарат обладает выраженным антимикробным действием как на грамотрицательную (Ps.aeruginosa, Е.coli, Salmonella abony), так и грамположительную (S.aureus, Вас.subtilis) микрофлору;

- препарат эффективно действует как на вегетативные, так и споровые формы бактерий;

- позволяет эффективно лечить широкий спектр болезней бактериальной этиологии у животных в условиях отсутствия данных о возбудителе инфекции и его чувствительности к антибиотикам;

- препарат стабилен при хранении.

(57) Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения и профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний бактериальной и микоплазменной этиологии животных. Комплексный антибактериальный препарат для животных, содержащий соединение из группы фторхинолонов и вспомогательные вещества, отличающийся тем, что дополнительно содержит соединение из группы плевромутилинов в эффективном количестве. Заявленное изобретение эффективно против вегетативных и споровых форм бактерий безвредно, не обладает аллергенными свойствами, оказывает стимулирующее влияние на показатели гуморального иммунного ответа и стабильно при хранении. 5 з.п. ф-лы, 9 пр.

1. Комплексный антибактериальный препарат для животных, содержащий соединение из группы фторхинолонов и вспомогательные вещества, отличающийся тем, что дополнительно содержит соединение из группы плевромутилинов в эффективном количестве.

2. Комплексный антибактериальный препарат для животных по п.1, отличающийся тем, что содержит соединения из группы фторхинолонов и из группы плевромутилинов в соотношении (в масс.ч.) 1:3.0-1:225.0.

3. Комплексный антибактериальный препарат для животных по п.1, отличающийся тем, что в качестве соединения из группы фторхинолонов содержит ципрофлоксацин, или пефлоксацин, или офлоксацин, или энрофлоксацин, или норфлоксацин, или ломефлоксацин, или левофлоксацин, или моксифлоксацин, или спарфлоксацин, или эноксацин.

4. Комплексный антибактериальный препарат для животных по п.1, отличающийся тем, что в качестве соединения из группы плевромутилинов содержит тиамулина гидроген фумарат или тиамулин.

5. Комплексный антибактериальный препарат для животных по п.1, отличающийся тем, что в качестве вспомогательных веществ содержит сахара.

6. Комплексный антибактериальный препарат для животных по п.5, отличающийся тем, что в качестве сахаров содержит сахарную пудру, или глюкозу, или фруктозу, или декстрозу, или лактозу, или лактулозу.