СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ СО СНИЖЕННОЙ ПРОДУКЦИЕЙ BDNF Российский патент 2015 года по МПК A61K35/00 A61P25/08 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики заболеваний, в частности неврологических заболеваний, ассоциированных со сниженной продукцией BDNF (нейротрофического фактора мозга), характеризующейся сниженной концентрацией BDNF в плазме и/или сыворотке крови, путем введения пациенту экзогенного интерлейкина-2.

Предшествующий уровень техники

Неврологические заболевания характеризуются широкой распространенностью. В большинстве случаев они существенно снижают качество жизни и даже могут представлять собой угрозу жизни. В связи с этим поиск новых терапевтических подходов для лечения неврологических заболеваний является одной из приоритетных задач медицины.

Одним из широко распространенных неврологических заболеваний является эпилепсия. Эпилепсия представляет собой нарушение функций головного мозга, характеризующееся периодическими, внезапно возникающими у человека судорожными приступами, или эпилептическими припадками. Идиопатическая эпилепсия не сопровождается органическим поражением головного мозга. Она может проявляться в виде больших или тоникоклонических припадков, во время которых человек теряет сознание и у него наступают судороги. Другим проявлением идиопатической эпилепсии являются абсансы, проявляющиеся кратковременной (несколько секунд) потерей сознания. Очаговая эпилепсия является симптомом органического поражения головного мозга. При очаговой эпилепсии характер припадков зависит от локализации поражения мозга, в связи с чем выделяют ее различные формы, такие как джексоновская эпилепсия, психомоторная эпилепсия и др.

Эпилепсия наблюдается не только у людей, но и у других млекопитающих, включая домашних животных, таких как кошки и собаки.

Основными способами медикаментозного лечения эпилепсии является назначение препаратов, относящихся к группе антиконвульсантов, которые влияют на пути сигналинга, связанных с глутаминовой кислотой, ГАМК (гамма-аминомасляной кислотой), NMDA(N-метил-D-аспартат)-рецепторами нейронов, а также натриевыми и кальциевыми каналами. Также в лечении эпилепсии используются различные психоактивные и ноотропные препараты и рацетамы. Назначение большинства указанных препаратов может быть связано с побочными эффектами, ухудшающими качество жизни пациента, и в некоторых случаях вынуждающими его прекратить терапию. Так, практически все известные антиэпилептические препараты обладают тормозящим действием в отношении центральной нервной системы (ЦНС), при их применении часто развиваются следующие побочные эффекты: сонливость, астения, головокружение, атаксия, снижение памяти, ослабление когнитивных функций. В ряде случаев возможно возникновение более тяжелых побочных реакций, угрожающих жизни пациента, таких как агранулоцитоз, синдромы Стивенса-Джонсона и Лайэлла, синдром гиперчувствительности, апластическая анемия, токсический гепатит и панкреатит, сывороточная болезнь. В целом, частота побочных эффектов и осложнений известных способов антиэпилептической терапии достигает 25% (О.А. Пылаева и др. Побочные эффекты и осложнения антиэпилептической терапии. Фармацевтика для практикующих врачей, №9/10, 2004).

Другой серьезной проблемой, связанной с лечением эпилепсии, являются так называемые «фармакорезистентные формы эпилепсии», при которых частота и тяжесть припадков не поддаются коррекции известными способами лечения, или степень такой коррекции является неудовлетворительной с точки зрения качества жизни пациента (см. Patrick Kwan et al., Definition of drug resistant epilepsy. Epilepsia. 2009). Резистентность к терапии может иметься у больного изначально, то есть больной не отвечает на данный вид терапии, или ответ является неудовлетворительным, с самого начала терапии. Также резистентность может быть приобретенной, то есть больной, ранее удовлетворительно отвечавший на тот или иной вид терапии, перестает на него отвечать, или степень ответа снижается.

Таким образом, существует потребность в новых способах лечения эпилепсии, в том числе включающих воздействие на иные биологические мишени по сравнению с антиконвульсантными, психоактивными и ноотропными препаратами и рацетамами. Эта потребность обоснована как расширением арсенала доступных для пациентов способов лечения эпилепсии, так и необходимостью поиска терапевтических подходов, которые могли бы оказаться полезными при лечении пациентов с резистентными формами эпилепсии, или применение которых могло бы снизить частоту возникновения резистентности, за счет возможности варьировать биологические мишени. Также существует потребность в поиске способов лечения эпилепсии, которым не свойственны побочные эффекты, ассоциированные с известными антиэпилептическими препаратами, что позволило бы, в частности, подбирать альтернативные способы лечения для пациентов, страдающих от побочных эффектов известных способов. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение данной потребности.

Согласно изобретению предложено новое терапевтическое применение интерлейкина-2, основанное на выявленной авторами изобретения способности интерлейкина-2 приводить к увеличению продукции BDNF. BNDF (нейротрофический фактор мозга или нейротропный фактор мозга; англ. brain-derived neurotrophic factor) представляет собой нейротрофический фактор, который стимулирует развитие нервных клеток центральной и периферической нервной системы, помогает поддержать выживание существующих нейронов и стимулирует рост и дифференцировку новых нейронов и синапсов (Huang E.J., Reichardt L.F., "Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function". Annu. Rev. Neurosci. 24: 677-736, 2001).

Дизрегуляция BDNF выявлена при многих неврологических и психических заболеваниях. В частности, сообщалось о сниженных уровнях BDNF в сыворотке и плазме крови у взрослых больных при депрессии, биполярных расстройствах, болезни Хантингтона, поздних стадиях болезни Альцгеймера, аутизме, рассеянном склерозе (Autry А.Е., Monteggia L.M., Brain-derived neurotrophic factor and neuropsychiatric disorders., Pharmacol Rev. Apr; 64(2):238-58, 2012) и у взрослых, больных эпилепсией (LaFrance W.C. Jr, et al., Decreased serum BDNF levels in patients with epileptic and psychogenic nonepileptic seizures, Neurology, 75(14):1285-91, 2010).

В эксперименте на животных было показано, что определенное повышение уровней BDNF и фактора роста фибробластов-2 (FGF-2) в гиппокампе уменьшает проявления астроглиоза (разрастания «мшистых волокон») и спонтанные судорожные припадки через 4 недели после индукции эпилептического статуса пилокарпином (Paradiso В. et al., Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus, Epilepsia, 52(3): 572-8, 2011; Kuramoto S. et al., BDNF-secreting capsule exerts neuroprotective effects on epilepsy model of rats, Brain Res; 1368:281-9, 2011). Эксперименты, раскрытые в данных публикациях, можно рассматривать в качестве прототипа настоящего изобретения в части лечения эпилепсии. Однако ни одна известная авторам изобретения публикация не раскрывает успешного применения агентов, повышающих уровень BDNF, для лечения эпилепсии или других неврологических заболеваний у людей.

Инетрлейкин-2 (IL-2) представляет собой цитокин, медиатор воспаления и иммунитета. Он продуцируется Т-клетками в ответ на антигенную и митогенную стимуляцию. Интерлейкин-2 необходим для пролиферации Т-клеток и участвует в других процессах, регулирующих иммунный ответ. Известно, что интерлейкин-2, производимый клетками головного мозга, поддерживает рост эмбриональных септальных и гиппокампальных нейронов и влияет на высвобождение ацетилхолина из септо-гиппокампальных холинергических нейронов (Beck R.D. et al., IL-2 deficiency results in altered septal and hippocampal cytoarchitecture: relation to development and neurotrophins. J Neuroimmunol.; 160:146-153, 2005; Malek T.R. et al., IL-2 family of cytokines in T regulatory cell development and homeostasis. J Clin Immunol.; 28:635-639, 2008; Petitto J.M., Huang Z., Molecular cloning of the coding sequence of an interleukin-2 receptor alpha subunit cDNA in murine brain. J Neuroimmunol. 59: 135-141, 1995). Показано, что дефицит IL-2 приводит к повышению продукции нескольких провоспалительных цитокинов в гиппокампе (Cardona А.Е. et al., Chemokines in and out of the central nervous system: much more than chemotaxis and inflammation. J Leukoc Biol., 84:587-594, 2008), нарушает архитектуру гиппокампа и связан с нарушением поведения у взрослых мышей (Huang Z. et al., lnterleukin-2 deficiency-induced T cell autoimmunity in the mouse brain. Neurosci Lett.; 463:44-48, 2009). В случае нарушении продукции интерлейкина-2 только клетками головного мозга (без дефицита этого цитокина в иммунной системе) происходит удвоение количества Т-клеток, поступающих во все области мозга.

В предшествующем уровне техники интерлейкин-2 не охарактеризован как агент, обладающий антиконвульсантной или проконвульсантной активностью, и его ранее не применяли для лечения эпилепсии или других неврологических заболеваний. Также авторам изобретения не известна ни одна публикация, в которой был бы раскрыт эффект интерлейкина-2 в отношении повышения продукции BDNF.

Раскрытие изобретения

В рамках настоящего изобретения интерлейкин-2 рассматривается как активный агент, предназначенный для применения при лечении или профилактике заболеваний, связанных со сниженной продукцией BDNF, характеризующейся сниженной концентрацией BDNF в сыворотке и/или плазме крови. Таким образом, настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики заболеваний, в частности неврологических заболеваний, связанных со сниженной концентрацией BDNF в сыворотке и/или плазме крови, включающему введение пациенту интерлейкина-2, и к применению интрелейкина-2 для лечения или профилактики таких заболеваний.

Заболевания, которые можно лечить согласно изобретению, включают, не ограничиваясь указанным, эпилепсию, в том числе идиопатическую эпилепсию и различные формы очаговой эпилепсии, такие как, например, джексоновская и психомотроная эпилепсия, как у взрослых, так и у детей, депрессию, биполярные расстройства, аутизм, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, психозы, включая первый психотический эпизод, психогенные неэпилептические приступы, и другие заболевания и состояния, в том числе, неврологические, где симптомы, нежелательные для пациента, в той или иной степени ассоциированы со сниженной концентрацией BDNF в сыворотке и/или плазме крови.

Концентрация BDNF, определяемая у лиц, страдающих и не страдающих обозначенными в предшествующем абзаце заболеваниями, в плазме и сыворотке крови может сильно различаться в зависимости от метода определения, а именно, используемых реагентов и сроков от получения крови у пациента до заморозки плазмы/сыворотки. Авторы публикации Lommatzsch М. et al. The impact of age, weight and gender on BDNF levels in human platelets and plasma, Neurobiol Aging., 26(1):115-23, 2005, сообщают о медианной концентрации BDNF в сыворотке крови, составляющей 22600 пг/мл, и медианной концентрации в плазме крови, составляющей 92500 пг/мл, у здоровых людей, при этом выявлена корреляция с возрастом и полом. В данном документе раскрыты способы определения концентрации BDNF, использовавшиеся для получения этих значений. В публикации de Azua S.R. et al., Plasma brain-derived neurotrophic factor levels, learning capacity and cognition in patients with first episode psychosis, BMC Psychiatry. 13: 27, 2013; авторы которой использовали другой протокол при сборе образцов крови и определении концентрации BDNF, сообщается о концентрации BDNF в плазме крови здоровых людей, составляющей 9190±4210 пг/мл. В то же время, согласно данной публикации, пациенты, пережившие первый психотический эпизод, демонстрировали при использовании того же протокола определения значимо меньшую концентрацию BDNF в сыворотке крови, а именно 6090±3700 пг/мл. Авторы публикации LaFrance W.C. Jr. et al., Decreased serum BDNF levels in patients with epileptic and psychogenic nonepileptic seizures, Neurology, 75(14):1285-91, 2010, с использованием еще одного протокола определения продемонстрировали концентрацию BDNF в сыворотке крови здоровых людей, составляющую 4289±1810 пг/мл, в то время как в сыворотке крови больных эпилепсией без сопутствующего большого депрессивного расстройства она составляла 977±565 пг/мл, а у пациентов, страдающих психогенными неэпилептическими приступами - 1033±435 пг/мл. В публикации Zucatto Ch. et al., Brain-Derived Neurotrophic Factor in Patients with Huntington′s Disease, PLoS One. 2011; 6(8): e22966. Published online 2011 August 12. doi: 10.1371/journal.pone.0022966, раскрыто, что концентрация BDNF, определяемая в образцах крови спустя разные промежутки после взятия крови у пациента, существенно различается.

Таким образом, для определения того, является ли концентрация BDNF в сыворотке и/или плазме крови конкретного пациента сниженной, специалист может в точности воспроизвести протокол определения, описанный в любой из приведенных выше публикаций, и сравнить полученное значение со значениями, приведенными в соответствующей публикации для здоровых людей. Соответственно любое значение концентрации BDNF, меньшее, чем приведенный в соответствующей публикации нижний предел для здоровых людей, следует рассматривать как сниженное и ассоциированное с риском по меньшей мере одного из обозначенных в предыдущем абзаце заболеваний. Даже если пациент, демонстрирующий сниженную концентрацию BDNF, не проявляет выраженных симптомов какого-либо из указанных заболеваний, может быть оправданным профилактическое назначение интерлейкина-2. С другой стороны, концентрация BDNF у пациента в сыворотке и/или плазме крови может попадать в указанные в соответствующей публикации пределы, соответствующие здоровому состоянию, но пациент, тем не менее, может демонстрировать симптомы какого-либо из указанных заболеваний. Это может быть связано с индивидуальными особенностями профиля активности различных регуляторных молекул в организме такого пациента, вследствие которых уровень продукции BDNF, попадающий в нормальный для общей популяции диапазон, оказывается в случае данного пациента недостаточным, то есть, в данной ситуации также имеет место сниженная продукция и активность BDNF. В таком случае также ожидается, что применение интерлейкина-2 согласно изобретению будет обеспечивать клинический эффект у такого пациента.

Целью лечения согласно настоящему изобретению может являться полное исчезновение или в любой степени выраженное облегчение хотя бы одного из беспокоящих пациента симптомов, и/или улучшение качества жизни, и/или изменение лабораторных показателей, отражающих течение заболевания и/или имеющих прогностическое значение.

В случае лечения эпилепсии, целью такового лечения может являться уменьшение интенсивности и продолжительности припадков, купирование припадков, увеличение продолжительности периода между припадками. Под припадками следует понимать первично генерализованные припадки, в том числе тонико-клонические припадки, простые абсансы и сложные абсансы, и парциальные припадки, в том числе простые парциальные припадки, сложные парциальные припадки и вторично генерализованные припадки. Эффективность лечения можно оценивать, например, с использованием шкалы HNS3 (National Hospital Seizure Severity Scale) и/или шкалы CGI (Global Clinical Impression), и/или путем оценки изменений на электроэнцефалограмме (ЭЭГ) в состоянии покоя и при функциональных нагрузках.

Согласно изобретению в качестве терапевтического агента предпочтительно используется интерлейкин-2 человека, более предпочтительно, рекомбинантный интерлейкин-2 человека. Получение и структура эндогенного интерлейкина-2 человека и различных вариантов рекомбинантного интерлейкина-2 человека и изготовление лекарственных форм, содержащих рекомбинантный интерлейкин-2 человека, раскрыта, например, в патентах RU 2105011, RU 2230781, авторском свидетельстве SU 1770359, а также в публикациях Ронколейкин® - рекомбинантный интерлейкин-2 человека, под ред. Козлова В.К., СПб., 2001, и Егоровой В.Н. и др., Интерлейкин-2: Обобщенный опыт клинического применения, СПб. Ультра Принт, 2012.

В настоящее время на рынке доступны несколько препаратов рекомбинантного интерлейкина-2 человека. Одним из них является "Пролейкин" (Proleukin, Chiron Corp., США). Активным ингредиентом "Пролейкина" является человеческий интерлейкин-2, синтезированный в клетках Escherichia coli. Рекомбинантный белок не гликозилирован и является мутеином, у него отсутствует N-концевой аланин и цистеин в 125 положении замещен серином. Препарат "Пролейкин" содержит окисленную форму рекомбинантного интерлейкина-2.

Другие известные препараты, содержащие рекомбинантный человеческий интрелейкин-2, синтезированный в E.coli, представляют собой Aldesleukin (Chiron/Cetus, США, Euro Cetus, Нидерланды) и Teceleukin (F. Hoffman-LaRoche).

Все вышеперечисленные препараты могут применяться согласно настоящему изобретению. Однако указанным препаратам, содержащим рекомбинантный интерлейкин-2, полученный в клетках E.coli, свойствен ряд побочных эффектов, наиболее частыми из которых являются утомляемость, недомогание и лихорадка с повышением температуры тела в ряде случаев вплоть до 40°C. Хотя эти побочные эффекты, в целом, не являются столь тяжелыми и в меньшей степени снижают качество жизни по сравнению с побочными эффектами антиконвульсантов и других известных антиэпилептических препаратов, они, безусловно, также являются нежелательными. Также эти препараты имеют высокую стоимость. В связи с этим, более предпочтительным препаратом для осуществления настоящего изобретения является "Ронколейкин®" (Биотех, Россия), который обладает менее выраженными побочными эффектами и меньшей стоимостью.

Активным ингредиентом препарата "Ронколейкин®" является рекомбинантный интерлейкин-2 человека, полученный из клеток рекомбинантного штамма непатогенных пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в генетический аппарат которых встроен ген интерлейкина-2 человека. Он представляет собой полипептид, состоящий из 133 аминокислот, который является структурным и функциональным аналогом эндогенного человеческого интерлейкина-2. Рекомбинантный интерлейкин-2, входящий в состав "Ронколейкина®", получают с использованием штамма S. cerevisiae ВКПМ Y-791 (SU 17703359). Также можно использовать штамм ВКПМ Y-3079 (RU 2230781). Рекомбинантный белок накапливается внутри клеток в восстановленном состоянии в виде "телец включения" и не содержит углеводного компонента. В отличие от "Пролейкина", в молекуле активного ингредиента "Ронколейкина" отсутствуют аминокислотные замены, и она не является мутеином, то есть она включает последовательность из 133 аминокислот, идентичную последовательности пептидного фрагмента эндогенного человеческого интерлейкина-2. "Ронколейкин" является более предпочтительным препаратом для использования согласно настоящему изобретению, в силу меньшей стоимости и менее выраженных побочных эффектов по сравнению с "Пролейкином" и другими препаратами, включающими рекомбинантный интерлейкин-2, полученный в клетках E.coli. Препарат "Ронколейкин" содержит восстановленную форму интерлейкина-2, которая при подкожном или внутривенном введении превращается в окисленную форму, соответственно, в межтканевой жидкости или в инфузионном растворе, что приводит к повышению удельной активности интерлейкина-2 в 10-12 раз.

Способ введения и дозировки: при лечении заболеваний согласно изобретению препарат рекомбинантного интрерлейкина-2, такой как "Пролейкин" или "Ронколейкин", могут вводить подкожно или внутривенно. Предпочтительная суточная дозировка составляет 0,1-10 мг интерлейкина-2, предпочтительно 0,1-5 мг, наиболее предпочтительно 0,5-1 мг. Указанную суточную дозировку можно вводить пациенту однократно, либо в ходе нескольких введений в течение суток. Интервал между введениями предпочтительно составляет от 1 часа до 5 суток. В случае если введение осуществляют однократно в течение суток, интервал между введениями предпочтительно составляет 1, 2 или 3 суток, в ходе курса осуществляют 1-3 введения. Для внутривенного введения препарат из ампулы переносят в 100-1000 мл, предпочтительно 200-800 мл, предпочтительно 400 мл изотонического раствора натрия хлорида для инъекций. Инфузия всего объема раствора осуществляется капельно в течение нескольких часов, например 2-10 ч, предпочтительно 4-6 ч. Раствор препарата предпочтительно должен быть прозрачным, бесцветным и не содержать посторонних включений.

Способ лечения заболеваний согласно изобретению, в частности способ лечения эпилепсии, можно осуществлять, используя интерлейкин-2 в качестве единственного терапевтического агента. Также возможно комбинировать введение интерлейкина-2 с любыми известными активными агентами и способами, предназначенными для лечения соответствующих заболеваний. В частности, если способ лечения согласно изобретению предназначен для лечения эпилепсии, его можно комбинировать с любыми другими известными способами и терапевтическими агентами, предназначенными для лечения эпилепсии, такими как антиконвульсанты, воздействующие на ГАМК-рецепторы, NDMA-рецепторы и ионные каналы нейронов, нейротропные препараты, психоактивные и психотропные препараты или рацетамы. В частности, согласно изобретению, интерлейкин-2 может использоваться совместно с препаратами вальпроевой кислоты, карбамазепином, фенобарбиталом, фенитоином, ламтотриджином, бензодиазепинами, тиагабином, вигабатрином, гапабентином, этосуксемидом, и др., которые вводят с использованием режимов и дозировок, подбираемых специалистом с учетом клинической ситуации на основании общих знаний о применении данных активных агентов.

Примеры

Протокол определения концентраций цитокинов, BDNF и slL-2R

Концентрации интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-8 (IL-8), фактора некроза опухоли-α (tumor necrosis factor α, TNFα), BDNF и растворимого рецептора интрелейкина-2 (slL-2R) анализировали с помощью флуоресцентной техники Luminex, с использованием мультиплексных магнитных бус (гранул) (панель Multiplex MAP) согласно инструкции изготовителей. В каждую лунку 96 луночного планшета добавляли по 25 мкл буфера, 25 мкл образца или стандарта, 25 мкл матричного раствора и 25 мкл смеси гранул, после чего проводили культивирование в течение ночи при постоянном встряхивании при 4°C. Все образцы и стандарты были представлены в трех экземплярах (по три лунки на каждый образец). После отмывки в каждую лунку добавляли по 25 мкл детектирующих антител и культивировали в течение одного часа при комнатной температуре. Следующую инкубацию проводили после добавления в каждую лунку 25 мкл стрептавидина-фикоэритрина, культивирование сопровождалось встряхиванием в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем плату промывали, добавляя в каждую лунку по 150 мкл жидкости. С помощью LuminexW 200™ (Luminex Corporation, Остин, Техас) определяли уровни флюоресценции в каждой лунке со стандартом, контролем качества и образцом плазмы. Данные анализировали с использованием программного обеспечения Bio-plex manager (Bio-Rad Laboratories, Inc Hercules, CA). Концентрации молекул вычисляли при интерполяции калибровочной кривой, использующей пошаговое пятикратное разбавление белковых стандартов. Калибровочные кривые строили для каждого аналита с использованием программного обеспечения Bio-plex manager, а концентрации в образцах вычисляли по калибровочной кривой.

Порог минимальной чувствительности Milliplex анализа для изученных цитокинов колебался в пределах 0.6-15 пг/мл.

Пример 1

Выявление отличий в отношении продукции Факторов, ассоциированных с воспалительными процессами, и интрелейкина-2 между пациентами с эпилепсией и здоровыми лицами

В плазме крови 34 больных эпилепсией и 13 здоровых лиц определяли концентрацию IL-2, провоспалительного цитокина IL-8, провоспалительного цитокина TNF-α и растворимого рецептора интрелейкина-2 (SIL-2R). Исследование указанных биологически активных молекул проводили с использованием мультиплексных систем Luminex и панели моноклональных антител Multiplex MAP, как описано выше. Статистическую обработку результатов проводили с применением критериев Стьюдента (t), Манна-Уитни (U).

Результаты приведены в Таблице 1

Таблица 1 Цитокины в плазме крови здоровых лиц и больных эпилепсией Цитокины в плазме крови Здоровые лица (n=13) Me (min-mах)* Больные эпилепсией (n=34) Me (min-mах) P(U) IL-2 пг/мл 0 (0-7) 0 (0-4)   SlL-2R пг/мл 825 (300-1660) 612 (178-1477) <0,05 TNFα пг/мл 0,5 (0-2,5) 14 (2-60) <0,01 IL-8 пг/мл 1,0 (0-2,4) 157 (0-372) <0,01 * ME - медиана, min-mах - разброс данных

Как можно видеть, у больных эпилепсией имеется существенное нарушение профиля цитокинов в плазме крови: а именно, повышены уровни провоспалительных цитокинов (IL-8 и TNFα). Также эти данные свидетельствуют в пользу того, что у больных эпилепсией наблюдается сниженная продукция интерлейкина-2. Так, не было выявлено достоверных различий в отношении уровня интерлейкина-2 у здоровых лиц и у больных эпилепсией, однако это связано с тем, что у большинства обследованных лиц уровень интерлейкина-2 был неопределяемым. Вместе с тем зафиксированы достоверные различия в отношении концентрации растворимого рецептора интерлейкина-2 SIL-2R. Данная молекула известна в уровне техники как маркер, отражающий фактический уровень продукции интерлейкина-2 (см., например, Rubin LA, Nelson D.L., The soluble interleukin-2 receptor: biology, function, and clinical application, Ann Intern Med.; 113(8):619-27, 1990). Таким образом, представленные в таблице данные достоверно свидетельствуют, что у больных эпилепсией суммарная продукция интерлейкина-2 в организме ниже, чем у здоровых лиц.

С учетом этих наблюдений авторы изобретения предположили, что восполнение дефицита продукции эндогенного интрелейкина-2 за счет экзогенного интерлейкина-2 может иметь клинический эффект при лечении эпилепсии.

Для проверки этого предположения авторы изобретения провели ряд испытаний с участием добровольцев, страдающих эпилепсией.

Пример 2

Связь введения экзогенного интерлейкина-2 с изменениями концентрации провоспалительных факторов и BDNF в плазме крови после курса лечения

В исследовании участвовали 30 больных эпилепсией, из которых 16 получали препарат "Ронколейкин®" (Биотех, Россия) в схеме комплексного лечения (БЭ+Р), а 14 - не получали (БЭ). Препарат "Ронколейкин" вводили однократно в течение дня в виде раствора подкожно по 1 мл в дозе 1,0 мг рекомбинантного интерлейкина-2. Всего осуществляли три введения: на 1-й, 3-й и 5-й день. Все пациенты получали традиционную терапию, заключавшуюся в приеме антиэпилептических препаратов базовой линии (АЭП), представляющих собой вальпроаты, карбамазепины, барбитураты, ламотриджин и леветирацетам. Средние дозы указанных АЭП были следующими: карбамазепин - 800 мг/сутки (по 400 мг 2 раза в сутки), вальпроаты - 1000 мг/сутки (по 500 мг 2 раза в сутки), барбитураты - 200 мг/сут (по 100 мг 2 раза в сутки), ламотриджин - 200 мг/сутки (по 100 мг 2 раза в сутки), леветирацетам - 1000 мг/сутки (по 500 мг 2 раза в сутки). Прием указанных препаратов был начат за длительное время до первого введения "Ронколейкина" в группе БЭ+Р и продолжен в данной группе без изменения дозы и частоты приема. В группе БЭ больные также принимали указанные АЭП в указанных дозировках в течение длительного времени и продолжили их прием во время эксперимента без изменения дозы и частоты приема. Исследуемые параметры оценивали в группе БЭ+Р до и после курса приема "Ронколейкина", а в группе БЭ - в моменты времени, соответствующие началу ("до лечения") и концу ("после лечения") курса приема "Ронколейкина" в группе БЭ+Р. В плазме крови пациентов до и после лечения определяли концентрацию интерлейкина-8, фактора некроза опухоли-α и BDNF. Исследование указанных биологически активных молекул проводили с использованием мультиплексных систем Luminex и панели моноклональных антител Multiplex MAP, как описано выше.

Статистическую обработку результатов проводили с применением критериев Стьюдента (t), Манна-Уитни (U).

Таблица 2a Цитокины в плазме крови больных эпилепсией до и после лечения Цитокины До лечения n=30 После лечения (БЭ) n=14, Me (min-max) После лечения (БЭ+Р) n=16, Me (min-max) P(t) 1 2 3   IL-8 (пг/мл) 28,7±15,5 23,2±5,9 6,3±1,4 P_1-3<0,01 TNF-α (пг/мл) 5,7±0,8 10,2±2,2 6,4±1,4 P_1-2<0,01

Таблица 2б BDNF в плазме крови больных эпилепсией до и после лечения, пг/мл До лечения n=30 После лечения (БЭ) n=14 После лечения (БЭ+3) n=16 4448±780 3369±990 7023±547** ** различия достоверны при P(U)<0,01 по сравнению с обеими группами

Как можно видеть, после проведения курса терапии у больных снизился уровень провоспалительного цитокина IL-8, повышение которого характерно для больных эпилепсией. При этом снижение было статистически более выраженным в группе, получавшей интерлейкин-2 вместе с традиционной терапией, по сравнению с группой, получавшей только традиционную терапию. Также включение интерлейкина-2 в курс терапии эпилепсии позволяет компенсировать увеличение уровня провоспалительного и проконвульсантного фактора TNF-α, которое наблюдается на фоне применения традиционной терапии.

Наиболее значительными оказались изменения в продукции BDNF, концентрация которого в плазме крови после лечения в группе, не получавшей «Ронколейкин», имела тенденцию к снижению, а в группе, получавшей «Ронколейкин», достоверно повысилась. Эти результаты позволяют заключить, что введение интерлейкина-2 может быть эффективным при лечении заболеваний, связанных с недостаточной продукцией BDNF, характеризующейся сниженной концентрацией BDNF в плазме крови и/или в сыворотке крови.

В ходе дальнейших исследований авторы изобретения установили, что применение интерлейкина-2 при лечении больных эпилепсией позволяет добиться клинически значимых результатов. Результаты соответствующих исследований изложены ниже в Примере 3.

Пример 3

Клинический эффект введения экзогенного интерлейкина-2 у больных с фармакорезистентной эпилепсией (ФРЭ)

Авторы изобретения провели курс лечения препаратом «Ронколейкином» у 30 больных эпилепсией экспериментальной группы (БЭ+Р) на фоне регулярного приема антиэпилептических препаратов базовой линии (карбамазепины, вальпроаты, барбитураты, ламотриджин и леветирацетам). Препарат «Ронколейкин» вводили однократно в течение дня в виде раствора подкожно по 1 мл в дозе 1,0 мг рекомбинантного интерлейкина-2. Всего осуществляли три введения: на 1-й, 3-й и 5-й день.

Все пациенты получали традиционную терапию, заключавшуюся в приеме антиэпилептических препаратов базовой линии (АЭП), представляющих собой вальпроаты и карбамазепины, барбитураты, ламотриджин и леветирацетам. Средние дозы указанных АЭП были следующими: карбамазепин - 800 мг/сутки (по 400 мг 2 раза в сутки), вальпроаты - 1000 мг/сутки (по 500 мг 2 раза в сутки), барбитураты - 200 мг/сутки (по 100 мг × 2 раза в сутки), ламотриджин - 200 мг/сут (по 100 мг × 2 раза в сутки), леветирацетам -1000 мг/сутки (по 500 мг 2 раза в сутки). Прием указанных препаратов был начат за длительное время до первого введения "Ронколейкина" в группе БЭ+Р и продолжен в данной группе без изменения дозы и частоты приема. В контрольной группе БЭ (13 человек) больные также принимали указанные АЭП в указанных дозировках в течение длительного времени и продолжили их прием во время эксперимента без изменения дозы и частоты приема.

Все больные в обеих группах (БЭ+Р и БЭ) демонстрировали недостаточный контроль припадков при приеме указанных выше АЭП как при монотерапии, так и при приеме комбинации двух и более указанных препаратов. Таким образом, обе группы были представлены больными, имеющими фармакорезистентную эпилепсию.

Клиническая эффективность терапии оценивалась в группе БЭ+Р до и после курса приема "Ронколейкина", а в группе БЭ - в моменты времени, соответствующие началу ("до лечения") и концу ("после лечения") курса приема "Ронколейкина" в группе БЭ+Р. Оценку проводили по следующим показателям:

- динамика частоты эпилептических припадков,

- динамика клинических параметров, оцениваемых в баллах по шкалам NHS-3 и CGI:

- динамика ЭЭГ в покое и при функциональных нагрузках.

Статистическую обработку результатов проводили с применением критериев Стьюдента (t), Манна-Уитни (U).

Частота припадков

Клинически после лечения препаратом «Ронколейкин» у 90,0% (27 человек) больных ФРЭ отмечено достоверное улучшение контроля приступов: у 8 пациентов (26,7%) припадки стали редкими (от 1 раза в 4 месяца до 1 раза в год), у 19 (63,3%) - их частота уменьшилась более чем на 50% (до 1 раза в 2-3 месяца). При этом возросла средняя длительность межприступного интервала (до лечения - 24,7±2,3 дней, после лечения - 94,6±3,7 дней; р<0,01).

В группе БЭ частота припадков и межприступный интервал в днях (МПИ) остались прежними.

Результаты представлены в Таблице 3

Таблица 3 Группы сравнения МПИ (до лечения) МПИ (после лечения) БЭ (13 чел.) 23,8±3,1 24,1±2,8 БЭ+Р (30 чел.) 24,7±2,3 94,6±3,7* (*p<0,01)

Снижение частоты припадков после лечения «Ронколейкином» достоверно коррелировало с уменьшением пароксизмальной активности на ЭЭГ и улучшением показателей по шкале CGI и тяжести припадков NHS3.

Оценка тяжести припадков по шкале NHS3 и оценка клинического улучшения по шкале CGI

У больных эпилепсией, получавших "Ронколейкин" (БЭ+Р), после курса введения "Ронколейкина" отмечена положительная динамика клинических параметров, оцениваемых в баллах по шкалам NHS3 и CGI: тяжесть припадков уменьшилась с 14,25±3,61 балла до 7,94±2,98, что свидетельствует о снижении частоты тяжелых и осложненных припадков.

Суммарный балл по шкале общего клинического впечатления CGI в группе БЭ+Р сместился из диапазона умеренных и выраженных расстройств в область легких и умеренных. В группе БЭ существенной динамики не отмечено.

Результаты представлены в Таблице 4

Таблица 4 Группы сравнения NHS-3 (до лечения) NHS-3 (после лечения) CGI (до лечения) CGI (после лечения) БЭ(13 чел.) 17,15±2,07 16,27±1,54 6,20±1,04 5,46±1,18 БЭ+Р (30 чел.) 18,87±0,78 9,23±1,82* 6,91±1,22 2,07±0,95* (*р<0,01)

Динамика ЭЭГ

С целью изучения фоновой биоэлектрической активности головного мозга была использована классификация Е.А. Жирмунской (1991), которая позволила авторам изобретения определить качественный уровень ЭЭГ-нарушений. Так, проведенный анализ результатов ЭЭГ у больных экспериментальной (БЭ+Р) и контрольной (БЭ) групп до лечения выявил изменения биоэлектрической активности головного мозга, как очень грубые в 50,8% и 52,1% наблюдений, как грубые в 30,4% и 31,4%, как значительные в 39,2% и 41,4% соответственно. Таким образом, на момент включения в исследование статистически значимых достоверных различий по ЭЭГ показателям в обеих группах зарегистрировано не было. После проведения курса лечения «Ронколейкином» ЭЭГ-динамика в экспериментальной группе (БЭ+Р) была представлена следующим образом: грубые, значительные, умеренные и легкие нарушения биоэлектрической активности наблюдались достоверно реже (20,8%, 15,1%, 5,1% и 2,2%), а очень грубые не определялись вовсе. В контрольной группе (БЭ) ЭЭГ-динамика также была положительной, однако была представлена более скромными показателями: очень грубые изменения - в 47,4% наблюдений, грубые - в 39,5% наблюдений, остальную часть составили значительные изменения биоэлектрической активности.

Результаты представлены в Таблице 5.

Таблица 5 ЭЭГ-нарушения БЭ до лечения БЭ+Р до лечения БЭ после лечения БЭ+Р после лечения Очень грубые 50,8 52,1 47,4 - Грубые 30,4 31,4 39,5 20,8 Значительные 39,2 4,4 13,1 15,1 Умеренные и легкие - - - 59,0

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что рекомбинантный интерлейкин-2 эффективен при лечении фармакорезистентной эпилепсии.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к способу лечения или профилактики эпилепсии. Для этого пациенту со сниженной концентрацией BDNF в сыворотке и/или плазме крови вводят рекомбинантный интерлейкин-2 человека. Группа изобретений относится также к применению интерлейкина-2 для лечения или профилактики указанного заболевания. Использование данной группы изобретений позволяет применять рекомбинантный интерлейкин-2 в качестве единственного терапевтического агента при лечении фармакорезистентной эпилепсии, связанной с недостаточной продукцией BDNF. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 пр.

1. Способ лечения или профилактики эпилепсии, включающий введение пациенту препарата интерлейкина-2 человека.

2. Способ по п. 1, где препарат интерлейкина-2 человека включает рекомбинантный интерлейкин-2 человека.

3. Способ по п. 2, где рекомбинантный интерлейкин-2 человека получен из клеток рекомбинантного штамма Saccharomyces cerevisiae.

4. Способ по п. 2, где рекомбинантный интерлейкин-2 включает аминокислотную последовательность из 133 аминокислот, идентичную последовательности пептидного фрагмента эндогенного человеческого интерлейкина-2.

5. Применение интерлейкина-2 человека для лечения или профилактики эпилепсии.

6. Применение по п. 5, где интерлейкин-2 человека представляет собой рекомбинантный интерлейкин-2 человека.

7. Применение по п. 6, где рекомбинантный интерлейкин-2 человека получен из клеток рекомбинантного штамма Saccharomyces cerevisiae.

8. Применение по п. 6, где рекомбинантный интерлейкин-2 включает аминокислотную последовательность из 133 аминокислот, идентичную последовательности пептидного фрагмента эндогенного человеческого интерлейкина-2.