СПОСОБЫ ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ Российский патент 2015 года по МПК A61M5/00 A61K38/00 A61P11/00 

Данная патентная заявка испрашивает приоритет по предварительной патентной заявке США серийный No. 61/025,157, зарегистрированной 31 января 2008 г., содержание которой включено в настоящий документ во всей полноте в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к терапии заболеваний легких, таких как бронхопульмонарная дисплазия (BPD) и вызванная хронической гипоксией легочная гипертензия, например, у новорожденных.

Бронхопульмонарная дисплазия (BPD) обычно возникает у новорожденных, особенно у недоношенных младенцев, и характеризуется острой формой поражения легких или за счет кислородной, и(или) за счет механической вентиляции, приводящей к вредному воздействию или задержке развития альвеол или сосудов легких (Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163: 1723-1729). В моделях на животных вдыхаемый NO улучшает и газообмен, и структурное развитие легких, но использование этой терапии у новорожденных при риске BPD является спорным (Ballard et al. (2006) N Engl J Med 355: 343-353).

Новорожденные с хроническим заболеванием легких и пороком сердца синего типа часто страдают от гипоксии. Из-за влияния и на существующие и развивающиеся легочные артерии хроническая гипоксия вызывает прогрессирующие изменения и функции, и структуры легочного кровообращения. Shimoda L, et al., Physiol Res (2000) 49: 549-560; Subhedar, N.V., Acta Paediatr suppl (2004) 444: 29-32. В конечном итоге хроническая гипоксия приводит к тяжелой легочной гипертензии, завершающейся недостаточностью сердечной мышцы с правой стороны и смертью.

Соответственно, в этой области давно ощущается и остается необходимой потребность в Способах лечения заболеваний легких, таких как BPD и вызванная хронической гипоксией легочная гипертензия, и дополнительно такая как у новорожденных.

По настоящему изобретению предлагаются Способы и составы для лечения заболеваний легких, таких как бронхопульмонарная дисплазия (BPD) и вызванная хронической гипоксией легочная гипертензия.

В некоторых вариантах осуществления эффективное количество прекурсора окиси азота назначают пациенту, страдающему BPD и(или) сопутствующими осложнениями и(или) при риске возникновения BPD и(или) осложнений, связанных с BPD. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота содержит по меньшей мере одно из цитруллина, прекурсора, который генерирует цитруллин в естественных условиях, его фармацевтически приемлемую соль и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота, такой как цитруллин, назначают перорально. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота, такой как цитруллин, назначают внутривенно.

В некоторых вариантах осуществления эффективное количество прекурсора окиси азота назначают пациенту, страдающему вызванной хронической гипоксией легочной гипертензией и(или) сопуствующими осложнениями и(или) при риске заболевания вызванной хронической гипоксией легочной гипертензией и(или) осложнений, связанных с вызванной хронической гипоксией легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота содержит по меньшей мере одно из цитруллина, прекурсора, который генерирует цитруллин в естественных условиях, его фармацевтически приемлемую соль и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота, такой как цитруллин, назначают перорально. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота, такой как цитруллин, назначают внутривенно.

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечить лечение заболевания легких у пациента.

В соответствии с установленной выше целью настоящего изобретения другие цели будут очевидны по последующему описанию совместно с сопроводительными чертежами и примерами, приведенными далее.

На Фиг. 1 схематично показан цикл образования мочевины. На Фиг. 2 показана блок-схема процедур исследований в соответствии с примерами.

На Фиг. 3 приведена столбчатая диаграмма, показывающая среднее измерений давления легочной артерии у поросят контроля (n=6), при хронической гипоксии (n=11) и при хронической гипоксии при лечении L-цитруллином (n-6). Все значения приведены в виде среднее ± стандартная погрешность среднего, отличные от контроля; ⁺отличные от хронической гипоксии; p<0,05, по одно-факторному дисперсионному анализу с последующим сравнительным тестом.

На Фиг. 4 приведена столбчатая диаграмма, показывающая рассчитанное сопротивление легочных сосудов у поросят контроля (n=6), при хронической гипоксии (n=11) и при хронической гипоксии при лечении L-цитруллином (n=6). Все значения приведены в виде среднее ± стандартная погрешность среднего, отличные от контроля; ⁺ отличные от хронической гипоксии; p<0,05, по одно-факторному дисперсионному анализу с последующим сравнительным тестом.

На Фиг. 5 приведена столбчатая диаграмма, показывающая выдыхаемую окись азота у поросят контроля (n=6), при хронической гипоксии (n=11) и при хронической гипоксии при лечении L-цитруллином (n=5). Все значения приведены в виде среднее ± стандартная погрешность среднего. * отличные от контроля; ⁺ отличные от хронической гипоксии; p<0,05, по однофакторному дисперсионному анализу с последующим сравнительным тестом.

На Фиг. 6 приведена столбчатая диаграмма, показывающая накопление нитрита/нитрата в перфузате легких у поросят контроля (n=17), при хронической гипоксии (n=9) и при хронической гипоксии при лечении L-цитруллином (n=5). Все значения приведены в виде среднее ± стандартная погрешность среднего. * отличные от контроля; ⁺ отличные от хронической гипоксии; p<0,05, по однофакторному дисперсионному анализу с последующим сравнительным тестом.

На Фиг. 7А показано изображение иммуноблота для белка эндотелиальной NO синтазы при повторном зондировании на актин ткани легких у поросят контроля (n=3), при хронической гипоксии (n=3) и при хронической гипоксии при лечении L-цитруллином (n=3).

На Фиг. 7Б приведена столбчатая диаграмма, показывающая денситеметрию эндотелиальной NO синтазы, нормализованную по отношению к актину для ткани легких у поросят контроля (n=3), при хронической гипоксии (n=3) и при хронической гипоксии при лечении L-цитруллином (n=3).

Родившиеся преждевременно дети продолжают оставаться основной проблемой в акушерстве и неонаталогии, составляя основную часть перинатальной смертности и долгосрочной неврологической заболеваемости среди новорожденных. BPD является одним из многих осложенений, которые могут быть связаны с преждевременными родами. BPD может быть связана с длительной гиспитализацией недоношенного ребенка, многократной госпитализацией в первые несколько лет жизни и задержкой в развитии. К счастью, BPD в настоящее время нечасто встречается у новорожденных с весом более 1200 г при прождении или возрастом плода, первышающим 30 недель (Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163: 1723-1729). Частота случаев BPD, определенная как потребность в кислороде в возрасте 36 недель после последней менструации, составляет примерно 30% для новорожденных с весом при рождении <1000 г (Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163:1723-1729). Некоторые из этих новорожденных страдают тяжелыми заболеваниями легких, требующими вентиляции и(или) подачи дополнительного кислорода в течение нескольких месяцев или даже лет.

Многие факторы дают вклад к BPD, и, вероятно, действуют дополнительно или синергично, способствуя заболеванию. Традиционные взгляды состоят в том, что BPD обусловлена главным образом заболеванием, вызванным оксидантами и вентиляцией (Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163: 1723-1729). Механическая вентиляция и кислород могут препятствовать развитию альвеол и сосудов у недоношенных младенцев и вносить вклад в развитие BPD (Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163: 1723-1729). Уменьшенное число альвеол может привести к значительному снижению площади поверхности тела, которое связано с уменьшением дисморфической легочной системы микрососудов. Эти анатомические изменения связаны с постоянным возрастанием уровней лейкоцитов и цитокинов в образцах дыхательных путей (Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163: 1723-1729).

Воспаление также может играть свою роль в развитии BPD. Многие противовоспалительные и хемотаксические факторы присутствуют в воздушном пространстве недоношенных детей при вентиляции легких, и обнаружена более высокая концентрация этих факторов в воздушном пространстве у новорожденных, у которых впоследствии развивается BPD (Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163: 1723-1729). Другие факторы, кторые считаются важными для развития BPD, включают: бомбезориноподобные пептиды, гипероксию, гипоксию, плохое питание, лечение глюкокортикоидами и сверхпродукцию цитокинов, фактора-α, TGF-α, IL-6, или IL-11 некроза опухоли (Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163:1723-1729).

Диагностика BPD в основном включает мониторинг дыхания новорожденных в течение первых недель жизни на наличие признаков задержки развития легких и продолжающейся и(или) возросшей зависимости от искусственно усиленного дыхания. Диагностические тесты, которые могут быть выполнены для содействия диагностике BPD, могут включать: тесты на содержание кислорода в крови, рентгеновские исследования грудной клетки и эхокардио-граммы. BPD традиционно диагностируется, когда плод требует дополнительной подачи кислорода в возрасте 36 недель постменструального периода. Современные способы определения, используемые для диагностики и определения BPD, включают специфические критерии для "незначительной", "умеренной" и "тяжелой" BPD (Ryan, R. М. (2006) J Perinatology 26:207-209).

Лечение BPD может включать многогранный подход к лечению симптомов заболевания и обеспечение возможности развития легких новорожденного. Имеющиеся в настоящее время Способы лечения могут включать: назначение сурфактантов для улучшения вентиляции легких, механическую вентиляцию для компенсации недостаточности дыхания, дополнительную подачу кислорода для обеспечения достаточного кислорода в крови, лекарственную терапию бронходилататорами для улучшения воздушного потока в легких, кортикостероиды для снижения отека и воспаления дыхательных путей, контроль жидкости во избежание отека легких, лечение открытого артериального протока, и правильное питание.

Показано, что введение окиси азота посредством ингаляций улучшает развитие легких в моделях новорожденных животных (Ballard et al. (2006) N Engl J Med 355:343-353). Однако введение NO посредством ингаляция является спорным для человека. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения введение цитруллина или другого прекурсора NO пациенту, страдающему BPD, чтобы, тем самым, увеличить синтез NO в живом организме, может представлять собой альтернативу ингаляции NO в качестве лечения BPD.

Из-за ее воздействия и на существующие, и на развивающиеся легочные артерии, хроническая гипоксия вызывает прогрессирующие изменения и функции, и структуры малого круга кровообращения. Shimoda L, et al., Physiol Res (2000);49:549-560; Subhedar, N.V., Acta Paediatr suppl (2004); 444: 29-32. В конечном итоге хроническая гипоксия приводит к тяжелой легочной гипертензии, завершаясь правосторонней сердечной недостаточностью и смертью. В настоящее время терапия легочной гипертензии у новорожденных, страдающих хроническими кардиопульмонарными нарушениями, связанными с постоянной или эпизодической гипоксией, в значительной степени ограничена улучшением лежащего в основе кардиопульмонарного заболевания и попытками достичь соответствующей оксигенации. Abman, S. Н.; Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed (2002) 87: F15-F18; Allen, J. и ATS subcommittee AoP, Am J Respir Crit Care Med (2003) 168: 356-396; Mupanemunda, R.H., Early Human Development (1997) 47: 247-262; Subhedar, N.V., Acta Paediatr suppl (2004) 444:29-32. Таким образом, по некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения предлагается новый терапевтический подход, включающий введение цитруллина страдающим легочной гипертензией, вызванной хронической гипоксией.

Цитруллин является ключевым интермедиатом в цикле образования мочевины и выработке окиси азота (NO). В цикле образования мочевины цитруллин является прекурсором для новообразования аргинина. Аргинин может быть дезамидирован посредством аргиназы для выработки мочевины, которая впоследствии может быть выделена, чтобы освободить организм от отработанного азота, в частности, аммиака. В альтернативном варианте аргинин может обеспечивать выработку NO посредством синтазы окиси азота. В этом случае функция незатронутого цикла образования мочевины важна не только для выделения аммиака, но и для поддержания соответствующих уровней в ткани аргинина, прекурсора NO.

Окись азота синтезируется посредством синтазы окиси азота с использованием аргинина в качестве субстрата. Фактором, ограничивающим интенсивность синтеза NO является наличие клеточного аргинина, и предпочтительным источником аргинина для синтеза NO является аргинин новообразованный из цитруллина. Путь синтеза в живом организме для аргинина начинается с орнитина. Орнитин соединяется с карбамил фосфатом для производства цитруллина, который, в свою очередь, соединяется с аспартатом, в присутствии аденозинтрифосфата, для производства агрининосукцината. На заключительном этапе фумарат расщепляется из агриносукцината для производства аргинина. Каскад реакций для аргинина посредством гидролитического действия аргиназы, для производства орнитина и мочевины. Эти реакции составляют цикл производства мочевины. См. также Фиг. 1.

В качестве альтернативы для ослабления синтеза мочевины аргинин может являться субстратом, необходимым для синтеза NO посредством синтазы окиси азота. Кроме того, экзогенный цитруллин может попасть в цикл производства мочевины и обеспечить синтез аргинина в живом организме, что может впоследствии обеспечить синтез NO. Соответственно, назначение цитруллина пациентам, включая, но не ограничиваясь теми, у кого подозревают или диагностировали BPD или вызванную хронической гипоксией легочную гипертензию может увеличить синтез аргинина и впоследствии увеличить производство NO, чтобы тем самым, предотвратить и(или) вылечить BPD или вызванную хронической гипоксией легочную гипертензию. Также могут быть обеспечены прекурсоры цитруллина, которые генерируют цитруллин в живом организме. В качестве альтернативы цитруллину могут быть предусмотрены другие прекурсоры NO. Например, в качестве прекурсора NO может быть предусмотрен аргинин, или прекурсор, который генерирует аргинин в живом организме.

I. СПОСОБЫ ТЕРАПИИ

По настоящему изобретению предлагаются способы и композиции для увеличения синтеза NO. В некоторых вариантах осуществления для увеличения синтеза NO пациенту назначают эффективное количество цитруллина или другого прекурсора NO. В некоторых вариантах осуществления прекурсор NO выбран из группы, включающей, но не ограничивающейся этим, цитруллин, прекурсор, который генерирует цитруллин в живом организме, аргинин, прекурсор, который генерирует аргинин в живом организме или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления цитруллин или другой прекурсор NO назначают перорально. В некоторых вариантах осуществления цитруллин или другой прекурсор NO назначают внутривенно.

По настоящему изобретению также предлагаются способы и композиции для лечения BPD и(или) сопутствующих осложнений у пациента. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество цитруллина или другого прекурсора NO назначают пациенту, страдающему BPD и(или) сопутствующими осложнениями и(или) при риске появления осложнений, связанных с BPD. В некоторых вариантах осуществления прекурсор NO выбран из группы, включающей, но не ограничивающейся этим, цитруллин, прекурсор, который генерирует цитруллин в живом организме, аргинин, прекурсор, который генерирует аргинин в живом организме или комбинации. В некоторых вариантах осуществления цитруллин или другой прекурсор NO назначают перорально. В некоторых вариантах осуществления цитруллин или другой прекурсор NO назначают внутривенно. В некоторых вариантах осуществления пациентом, которому необходимо лечение, является пациент, страдающий от острого состояния, связанного с BPD. Выше приведены репрезентативные примеры таких состояний.

По настоящему изобретению также предлагаются способы и композиции для лечения у пациента вызванной хронической гипоксией легочной гипертензии и(или) сопутствующих осложнений. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество цитруллина или другого прекурсора NO назначают пациенту, страдающему вызванной хронической гипоксией легочной гипертензией и(или) сопутствующим осложнениями и(или) при риске появления осложнений, связанных с вызванной хронической гипоксией легочной гипертензией. В некоторых вариантах осуществления прекурсор N выбран из группы, включающей, но не ограничивающейся этим, цитруллин, прекурсор, который генерирует цитруллин в живом организме, аргинин, прекурсор, который генерирует аргинин в живом организме или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления цитруллин или другой прекурсор NO назначают перорально. В некоторых вариантах осуществления цитруллин или другой прекурсор NO назначают внутривенно. В некоторых вариантах осуществления пациент, которому необходимо лечение, является пациентом, страдающим от острого состояния, связанного с вызванной хронической гипоксией легочной гипертензией. Выше приведены репрезентативные примеры таких состояний.

В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота содержит по меньшей мере одно из цитруллина, прекурсора, который генерирует цитруллин в живом организме, его фармацевтически приемлемую соль и их комбинации. См. Фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота выбран из группы, включающей, но не ограничивающейся этим, цитруллин, аргинин или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота, такой как цитруллин, назначают перорально. В некоторых вариантах осуществления прекурсор окиси азота, такой как цитруллин, назначают внутривенно.

В некоторых вариантах осуществления пациент страдает от гипоцитруллинемии. В некоторых вариантах осуществления гипоцитруллинемия характеризуется уровнями цитруллина в плазме ≤37 мкмоль/л, в некоторых вариантах осуществления ≤25 мкмоль/л, в некоторых вариантах осуществления ≤20 мкмоль/л, в некоторых вариантах осуществления ≤10 мкмоль/л, в некоторых вариантах осуществления ≤5 мкмоль/л.

В некоторых вариантах осуществления пациента, страдающий описанным в настоящем документе заболеванием, испытывает относительную гипо-цитруллинемию. Термин "относительная гипоцитруллинемия" относится к состоянию, при котором у пациента, страдающего некоторым заболеванием, снижен уровень цитруллина в плазме по сравнению с человеком, который не страдает этим заболеванием.

Используемое в настоящем документе выражение "лечение" относится к интервенционным процедурам, предназначенным для улучшения состояния пациента {например, после возникновения заболевания или после травмы), чтобы смягчить осложнения, относящиеся к состоянию пациента, а также к интервенционным процедурам, которые предназначены для предотвращения возникновения состояния у пациента. Иными словами, термины "лечение" и его грамматические варианты предполагают широкую интерпретацию для охвата значений, которые относятся к снижению степени тяжести и(или) вылечиванию состояния, а также к значениям, которые относятся профилактике. В отношении последнего, "лечение" может относиться к "предотвращению" до любой степени, например, но не ограничиваясь этим, у пациента при риске возникновения заболевания, или иного усиления возможности пациента сопротивляться процессу заболевания.

Пациентом, получавшим лечение по настоящему изобретению во многих его вариантах осуществления, предпочтительно является человек, хотя очевидно, что принципы настоящего изобретения указывают, что настоящее изобретение эффективно в отношении всех позвоночных видов, включая теплокровные виды, такие как млекопитающие и птицы, которые, как подразумевается, охвачены термином "пациент". В этом контексте понятно, что млекопитающее включает в себя любые виды млекопитающих, для которых лечение предпочтительно, например такие, но не ограничиваясь этим, как виды млекопитающих, используемые в сельском хозяйстве, и домашние животные.

Таким образом, предлагается лечение таких млекопитающих, как человек, а также тех млекопитающих, которые важны из-за угрозы их исчезновения (таких как сибирский тигр), важны экономически (животные, выращиваемые на фермах для потребления людьми) и(или) важны для человека социально (животные, которых содержат в качестве домашних любимцев или в зоопарках), например, плотоядные животные помимо человека (такие как коты и собаки), свиньи (поросята, домашние свиньи и дикие кабаны), жвачные животные (такие как крупный рогатый скот, волы, овцы, жирафы, олени, козы, бизоны и верблюды), а также лошади. Также предусмотрено лечение птиц, включая лечение таких видов птиц, над которыми нависла угроза исчезновения, содержащихся в зоопарках, а также дичь, и, более конкретно, домашняя птица, т.е., разводимая птица, такая как индейка, циплята, утки, гуси, цесарки и т.п., поскольку они также важны для человека экономически. Таким образом, предлагается лечение домашнего скота, включая, но не ограничиваясь этим, домашних свиней (свиноматки и боровы), жвачных животных, лошадей, домашней птицы и т.п.

II. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ

Нуждающемуся пациенту назначают эффективную дозу композиции по настоящему изобретению. "Эффективное количество" - это количество состава, достаточное, чтобы вызвать заметный ответ {например, биологически или клинически обоснованный ответ у пациента, для которого проводят лечение). Фактические уровни дозировки активных ингредиентов в составах по настоящему изобретению могут варьироваться, чтобы вводить количество активного соединения(й), которое эффективно для достижения нужного терапевтического отклика для конкретного пациента. Выбранный уровень дозы зависит от активности терапевтического состава, пути введения, сочетания с другими лекарствами или лечением, степени тяжести заболевания, которое необходимо лечить, и состояния и перенесенных ранее заболеваний у пациента, которому проводят лечение. Посредством примера, но не ограничения, дозировку составов можно начинать с уровней ниже требуемых, чтобы достичь нужного терапевтического эффекта и постепенно увеличивать дозировку, пока не будет достигнут нужный эффект.Эффективность состава может меняться, и, следовательно, может меняться "эффективное количество".

По описанию настоящего изобретения, представленного в настоящем документе, специалист в этой области может подобрать дозировку для конкретного пациента с учетом конкретной рецептуры, способа введения, используемого с этим составом, и конкретного заболевания, которое необходимо лечить. Дополнительные расчеты дозы могут учитывать рост и массу тела пациента, его пол, степень тяжести и стадию симптомов, а также присутствие дополнительных пагубных физических состояний.

Посредством дополнительных примеров количество активного компонента, который можно сочетать с веществом носителя для получения единичной дозированной формы, различно для разных пациентов, для которых проводится лечение, и конкретного режима назначения. Например, состав, предназначенный для введения человеку, может содержать от 0,5 мг до 5 г активного вещества в смеси с подходящим и удобным количеством вещества носителя, которое может меняться от примерно 5 до примерно 95 процентов от всего состава. Например, для взрослого пациента дозы на человека при назначении в основном составляют от 1 мг до 500 мг несколько раз в сутки. Таким образом, стандартные лекарственные формы в основном содержат от примерно 1 мг до примерно 500 мг активного компонента, обычно 25 мг, 50 мг, 100 мг, 200 мг, 300 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 800 мг или 1000 мг.

Прекурсор окиси азота назначают в некоторых вариантах осуществления в дозе в диапазоне от примерно 0,01 мг до примерно 1000 мг, в некоторых вариантах осуществления в дозе в диапазоне от примерно 0,5 мг до примерно 500 мг, и в некоторых вариантах осуществления в дозе в диапазоне от примерно 1,0 мг до примерно 250 мг. Прекурсор окиси азота также может быть назначен в некоторых вариантах осуществления в дозе в диапазоне от примерно 100 мг до примерно 30000 мг, и в некоторых вариантах осуществления в дозе в диапазоне от примерно 250 мг до примерно 1000 мг. Репрезентативная доза составляет 3,8 г/м²/сутки аргинина или цитруллина (молярный эквивалент, молекулярная масса L-цитруллина 175,2, L-аргинина 174,2).

Репрезентативные внутривенные растворы цитруллина могут содержать 100 мг/мл (10%) раствора. Репрезентативные внутривенные дозировки цитруллина могут содержать 200 мг/кг, 400 мг/кг, 600 мг/кг и 800 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления для примера, но без ограничения, дозировки 600 или 800 мг/кг, доза может быть снижена до количества в диапазоне от 50 мг/кг и 100 мг/кг для ослабления наблюдаемых нежелательных эффектов на артериальное системное давление. В некоторых вариантах осуществления дозы могут быть назначены однократно или многократно в течение заданного периода времени, например, в сутки.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит количество цитруллина, эффективное для подъема уровня цитруллина в плазме для лечения состояния, описанного в настоящем документе, у пациента. В некоторых вариантах осуществления этот уровень определяется сравнением уровней цитруллина в плазме у пациента, которому проводят лечение, с наблюдаемым уровнем у пациента, который не страдает данным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления количество цитруллина эффективного для подъема уровня цитруллина в плазме у пациента по меньшей мере до 5 мкмоль/л, в некоторых случаях по меньшей мере до 10 мкмоль/л, в некоторых случаях по меньшей мере до 20 мкмоль/л, в некоторых случаях по меньшей мере до 25 мкмоль/л, и в некоторых случаях примерно до 37 мкмоль/л.

В некоторых вариантах осуществления по настоящему изобретению предлагаются фармацевтические композиции, содержащие прекурсор окиси азота и фармацевтически приемлемый носитель, такой как фармацевтически приемлемый носитель для человека. В некоторых вариантах осуществления по настоящему изобретению предлагаются фармацевтические композиции, содержащие цитруллин или аргинин в дозировке, как описано выше.

Композиции по настоящему изобретению обычно назначают перорально или парентерально в стандартных лекарственных сосотавах, содержащих стандартные неточксичные фармацевтически приемлемые носители, адьюванты и наполнители, если это необходимо. Термин "парентерально", используемый в настоящем документе, включает в себя способы внутривенной, внутримышечной, внутриартериальной инъекции или инфузии.

Препараты для инъекций, например, стерильная водная или масляная суспензия для инъекций, составляют в соответствии с известным уровнем техники, используя подходящие диспергирующие или смачивающие вещества и суспендирующие вещества. Стерильный препарат для инъекций также может быть стерильным раствором для инъекций или суспензией в нетоксичном приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле.

Приемлемыми наполнителями и растворителями, которые могут быть использованы, являются вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлористого натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно использовать любое облегчающее нелетучее масло с использованием синтетических моно- или диглицеридов. Кроме того, жирные масла, такие как олеиновая кислота, используются при приготовлении препаратов для инъекций. Примеры носителей включают нейтральные солевые растворы с буфером в виде фосфата, лактата, трис и т.п.

В репрезентативном варианте осуществления дозы могут быть назначены пациенту несколько раз в течение соответствующего периода лечения, включая, но не ограничиваясь этим, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более дозировок.

Однако понятно, что конкретный уровень дозы для отдельного пациента зависит от большого числа факторов, включая возраст, массу тела, общее осстояние здоровья, пол, диету, время назначения, способ назначения, скорость выведения, сочетание с лекарствами и степень тяжести конкретного заболевания, лечение которого проводится.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры включены для иллюстрации репрезентативных режимов осуществления настоящего изобретения. В свете настоящего описания и общего уровня техники специалистам понятно, что следующие примеры предназначены только для демонстрации, и что многочисленные изменения, модификации и варианты могут быть использованы без отступления от сущности и объема настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ 1-4

В следующих примерах оценено, предотвращает ли пероральный прикорм L-цитруллином развитие легочной гипертензии и сопутствующего снижения производства NO у новорожденных поросят, в течение 10 дней подвергавшихся хронической гипоксии.

СПОСОБЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ПРИМЕРАХ 1-4 ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ЖИВОТНЫХ

Всего исследовали 17 поросят при гипоксии и 17 поросят контроля. См. Фиг. 2. Животных контроля изучали в день их поступления с фермы в возрасте 12 дней. Поросят с гипоксией (в возрасте 2 дней) помещали в изобарическую гипоксическую камеру на срок от 10 до 11 суток. Изобарическая гипоксия обеспечивалась с помощью сжатого воздуха и азота для создания концентрации вдыхаемого кислорода 8-11% (PO₂ 60-72 торр), и CO₂ поддерживали на уровне 3-6 торр путем абсорбции с натронной известью. У животных мониторировали массу тела и физическое состояние два раза в сутки. Их кормили без подготовки заменителем молока свиноматки из поильного устройства в клетке.

ДОБАВЛЕНИЕ L-ЦИТРУЛЛИНА

Шесть из семнадцати поросят с гипоксией получали добавку L-цитруллина перорально, начиная с первых суток воздействия гипоксии. См. Фиг. 2. Добавку L-цитруллина обеспечивали в дозе 0,13 гм/кг массы тела дважды в сутки с помощью шприца для подачи дозы перорально. Если персонал предполагал, что поросенок не проглотил большую часть дозы, ее ввод повторяли. L-цитруллин смешивали, используя препарат (Sigma Pharmaceuticals, Сент-Луис, Миссури, США, 98% чистоты) в концентрации 0,13 г на миллилитр дистиллированной воды,, и когда он полностью растворялся, пропускали этот раствор через 0,20 микронный фильтр.

ГЕМОДИНАМИКА В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

Гемодинамику в естественных условиях измеряли у 6 поросят контроля и у всех поросят с гипоксией. См. Фиг. 2. Для этих измерений животных взвешивали, а затем проводили предварительную анестезию кетамином (15 мг/кг) и ацепромазином (2 мг/кг) внутримышечно. Затем помещали трахеостому, венозный и артериальный катетеры и тепловой датчик, как описано выше, используя внутривенные пентобарбитал для седации. Fike, С.D. et al., J Appl Physiol (2000) 88: 1797-1803. Измеряли давление в легочной артерии, конечнодиастолическое давление ЛЖ и минутный объем. Минутный объем измеряли по термодилюци-онному Способу (модель 9520 термодилюционного компьютера минутного объема, Edwards Laboratory, Ирвин, Калифорния, США), используя температурный датчик в дуге аорты и катетер ЛЖ в качестве порта для инъекции. Минутный объем измеряли в конце выдоха, как среднее трех инъекций по 3 мл изотонического раствора (0°C). Выдыхаемый NO измеряли, как описано выше. При измерениях в естественных условиях выполняли вентиляцию животных комнатным воздухом, используя вентилятор поршневого типа при дыхательном объеме 15-20 куб. см/кг, давлении в конце выдоха 2 мм рт.ст., и частоте дыхания 15-20 дыханий в минуту.

ИЗМЕРЕНИЕ ВЫДЫХАЕМОЙ ОКИСИ АЗОТА

Для измерения выдыхаемого NO у животных с анестезией выдыхаемый газ отбирали два или три раза в течение периодов 3 минуты и пропускали через хемилюминесцентный анализатор (модель 270 В NOA; Sievers, Булдер, Колорадо, США), чтобы измерить концентрацию NO, как описано выше. Fike, С.D., et al., American Journal of Physiology (Lung, Cellular и Molecular Physiology 18) (1998) 274: L517-L526. Выдыхаемый NO (нмоль/мин) рассчитывали с использованием минутной вентиляции и измеренной концентрации выдыхаемого NO.

ПЕРФУЗИЯ ОТКЛЮЧЕННЫХ ЛЕГКИХ

Легкие отключают и выполняют перфузию в естественных условиях с использованием бикарбонатного раствора Кребса-Рингера (KRB), содержащий 5% декстрана, молекулярный вес 70000, при температуре 37°С при вентиляции смесью газов с нормальным содержанием кислорода (21% O₂ и 5% CO₂), как описано выше. Fike, С.D. et al, J Appl Physiol (2000) 88: 1797-1803. Перфузию легких выполняли в течение 30-60 минут, пока не было достигнуто стабильное давление легочной артерии. Образцы перфузата (1 мл) затем удаляли из канюли левого предсердия каждые 10 мин в течение 60 минутного периода. Образцы перфузата центрифугировали, и супернатант хранили при температуре -80°C для будущего анализа концентраций нитрита/нитрата (NOx^-), как описано далее. В конце перфузии измеряли объем перфузата, оставшийся в контуре и емкости. В некоторых случаях ткань легких отбирали сразу же после перфузии, замораживали, а затем хранили при температуре -80 градусов для последующего измерения содержания эндотелиальной NO синтазы, как описано далее.

ИЗМЕРЕНИЕ НИТРИТОВ/НИТРАТОВ АЗОТА

Для определения концентрации NOx^- в перфузате (нмоль/мл) в момент каждого сбора образцов использовали хемилюминесцентный анализ. Fike, С.D. et al, JAppl Physiol (2000) 88:1797-1803; Turley, J. E. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2003) 284:L489-L500. Перфузат (20 мкл) впрыскивали в камеру реакции хемилюминесцентного анализатора NO (модель 170 В NO А, Sievers). Камера реакции содержала хлорид ванадия (III) в 1 моле НС1, нагретого до температуры 90°C, чтобы восстановить нитрит и нитрат до газа NO. Газ NO переносили в анализатор, используя постоянный поток газа N₂ через ловушку пузырьков газа, содержащую 1 моль NaOH для удаления паров HCl. Получали стандартную кривую, добавляя известное количество NaNO₃ к дистиллированной воде и выполняя исследование, как описано длы образцов перфузии.

Концентрацию NOx^- в перфузате (нмоль/мл) рассчитывали для каждого момента сбора образцов путем умножения концентрации NOx^- в перфузате в момент отбора образца на объем системы (контур перфузата+емкость) в момент отбора образцов плюс количество NOx^-, удаленного со всеми предыдущими образцами. Скорость производства NOx^- определяли по наклону линии линейной регрессии, аппроксимированной к количеству NOx^- в перфузате в зависимости от времени для первых 60 минут периода сбора образцов.

ИЗМЕРЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ ПЛАЗМЫ

Во время гемодинамических измерений и(или) исследования перфузии легких у контроля и у животных с хронической гипоскией при лечении L-цитруллином и без лечения брали кровь перед началом исследования, и плазму замораживали при температуре -80 градусов для последующего определения уровней аминокислот. Для животных с гипоксией при лечении L-цитруллинлм время получения образца крови составило приблизительно 12 часов после последней дозы L-цитруллина, так что это был минимальный уровень. У некоторых животных при лечении L-цитруллином (n=3) после отбора крови для минимального уровня дозу L-цитруллина давали через назогастральную трубку. После этой дозы образцы крови брали каждые 30 минут в течение 90 минут (продолжительность исследований в естественных условиях). Все образцы отделяли, собирали плазму и замораживали при температуре -80 градусов для анализа аминокислот.

Концентрацию цитруллина и аргинина в плазме определяли путем анализа аминокислот на экстрактах без белков. Аминокислоты отделяли путем катио-нообменной хроматографии, используя анализатор аминокислот Hitachi L8800 (Hitachi USA, Сан-Жозе, Калифорния, США). Калибровку анализатора выполняли до тестирования образцов поросят.

ВЕСТЕРН-БЛОТТИНГ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ NO СИНТАЗЫ В ТКАНИ ЛЕГКИХ

Используя стандартный Способ иммуноблоттинга, как описано выше, выполняли анализ образцов цельного гомогената легких у контроля (n=3), животных с гипоксией без лечения (n=3) и животных с гипоксией при лечении L-цитруллином (n=3) для эндотелиальной NO синтазы. Использовали 10 микрограмм общего белка, разбавление первичного антитела эндотелиальной NO синтазы 1:500 (BD трансдукция) и разбавление вторичного антимышиного антитела, коньюгированных с пероксидазой из хрена, 1:5000. Fike, С.D., et al., American Journal of Physiology (Lung, Cellular и Molecular Physiology 18) (1998) 274:L517-L526.

РАСЧЕТЫ И СТАТИСТИКА

Легочное сосудистое сопротивление рассчитывали по гемодинамическим измерениям в естественных условиях: (Давление в легочной артерии - конечно-диастолическое давление ЛЖ) (Минутный объем/масса тела).

Данные представлены в виде среднее+стандартная погрешность. Для сравнения данных контрля, животных с гипоксией без лечения и при лечении L-цитруллином использовали однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным сравнительным тестом защищенной наименьшей достоверной разности по Фишеру (PLSD). Значение p менее 0,05 считали достоверным. Meier, U., Pharm Stat (2006) 5: 253-263.

ПРИМЕР 1

ГЕМОДИНАМИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

У животных с хронической гипоксией и при лечении L-цитруллином, и без лечения был более низкий минутный объем и масса и более высокие результаты измерений LVEDP в день исследований в возрасте 12-13 суток, чем у поросят контроля сравнимого возраста (табл. 1). Измерения внутриаортального давления и показателей газов крови были аналогичны у разных групп (paO₂ составл 74±5 торр у поросят контроля, 74±8 торр у поросят с гипоксией без лечения и 78±7 торр у поросят с гипоксией при лечении L-цитруллином; paCO₂ составил 39±2 у поросят контроля, 41±4 у поросят с гипоксией без лечения и 30±1,0 у поросят с гипоксией при лечении L-цитруллином). Примечательно, как показано на Фиг. 3, что животные при гепоксии с лечением L-цитруллином имели значительно более низкое давление в легочной артерии, чем животные при гипоксии без лечения (значение p 0,01). Давление в легочной артерии не отличалось для контроля при нормальном содержании кослорода и для животных с гипоксией при лечении L-цитруллином (p=0,08).

Кроме того, как показано на Фиг. 4, расчетное легочное сосудистое сопротивление у животных с гипоксией при лечении L-цитруллином (0,071±0,003) значительно ниже, чем у животных с гипоксией без лечения (значение p 0,001). Более того, легочное сосудистое сопротивление аналогично у животных с гипоксией при лечении L-цитруллином и контрля при нормальном содержании кислорода (p 0,07).

ПРИМЕР 2

ВЫХОД ВЫДЫХАЕМОГО NO И NOX^- ПЕРФУЗАТА

Как показано на Фиг. 5, выход выдыхаемого NO у контроля и животных с гипоксией при лечении L-цитруллином выше, чем выход выдыхаемого NO у животных с гипоксией без лечения (p 0,001 и 0,032, соответственно). Однако выход выдыхаемого NO не отличался между животными контроля и животными с гипоксией при лечении L-цитруллином (p=0,124).

Как показано на Фиг.6, легкие и у контроля (p=0,02) и у животных с гипоксией при лечении L-цитруллином p=0,04) имели значительно более высокие скорости накопления NOx^-, чем легкие у животных с гипоксией без лечения. Более того, не было различия скорости накопления NOx^- между легкими у животных с гипоксией при лечении L-цитруллином и контролем при нормальном содержании кислорода.

ПРИМЕР 3 АМИНОКИСЛОТЫ ПЛАЗМЫ

Как показано в табл. 2, хотя не достигается статистическая достоверность (р=0,05), уровни L-цитруллина в плазме у поросят с гипоксией без лечения были ниже, чем минимальные уровни L-цитруллина у поросят с гипоксией при лечении. Более того, при отборе через девяносто минут после дозы уровни L-цитруллина у животных с гипоксией при лечении были почти в два раза выше, чем у животных с хронической гипоксией без лечения (p=0,001). Однако, несмотря на время отбора образца, уровни аргинина плазмы были не выше у животных с хронической гипоксией при лечении L-цитруллином по сравнению с животными с гипоксией без лечения.

ПРИМЕР 4

ВЕСТЕРН-БЛОТТИНГ ДЛЯ БЕЛКА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ NO СИНТАЗЫ ЛЕГКИХ

Как показано на Фиг. 7А и 7Б, количество белка эндотелиальной NO синтазы, присутствующей в ткани легких животных контроля, значительно выше, чем в легких животных с гипоксией без лечения. Более того, количество белка эндотелиальной NO синтазы, присутствующего в ткани легких поросят с гипоксией при лечении L-цитруллином, не отличалось значительно от этого количества в животных с гипоксией без лечения и было значительно ниже, чем уровни белка эндотелиальной NO синтазы у животных контроля.

ОБСУЖДЕНИЕ ПРИМЕРОВ

В примерах 1-4 обнаружено, что добавление L-цитруллина ослабляет развитие легочной гипертензии у новорожденных поросят, подвергавшихся в течение 10 дней хронической гипоксии. Другие результаты этого исследвоания указывают, что и производство выдыхаемого NO, и скорости легочного сосудистого накопления NOx^- выше у поросят с гипоксией при лечении L-цитруллином, чем у поросят с гипоксией без лечения. Таким образом, эти результаты показывают, что добавление L-цитруллина значительно повышает производство легочного NO. Количество белка эндотелиальной NO синтазы не возрастало у животных с гипоксией при лечении.

Хотя нежелательно связывать себя какой-либо конкретной теорией действия, предполагается, что механизм, посредством которого L-цитруллин способствует повышению производства NO, обеспечивается увеличением количества L-аргинина, доступного в качестве носителя для эндотелиальной NO синтазы. Уровни аргинина плазмы у животных при лечении L-цитруллином в приведенных примерах незначительно повышены по сравнению с животными с гипоксией без лечения. Это расхождение между внутриклеточным аргинином и производством NO, называемое "парадоксом аргинина", по-видимому, присутствует вследствие повышения производства NO несмотря на неизмененные уровни аргинина плазмы, наблюдаемые при добавлении L-цитруллина в приведенных примерах. L-цитруллин является интермедиатом цикла производства мочевины, метаболизированный до аргинина путем метаболического цикла двух ферментов, агриносукцинат синтазы (AS) и агриносукцинат лиазы (AL). Обнаружено, что эти два фермента, AS и AL, совмещены с эндотелиальной NO синтазой в клетках легочного эндотелия. Boger, R. Н., Curr Opin Clin Nutr и Met Care (2008) 11: 55-61. Считается, что вместе эти ферменты создают отдельный субклеточный запас аргинина, используемый исключительно для синтеза NO. Уровни аргинина ткани и плазмы не позволяют точно измерить этот субклеточный запас.

L-цитруллин может также обладать функцией улучшенного производства NO и эндотелиальной NO синтазы за счет дополнительных механизмов.

Кроме того, хотя нежелательно связывать себя какой-либо конкретной теорией действия, другим потенциальным действием L-цитруллина в приведенных примерах является предотвращение отцепления эндотелиальной NO синтазы путем поддержания соответствующих уровней несущего его аргинина.

Кроме того, хотя нежелательно связывать себя какой-либо конкретной теорией действия, L-цитруллин также может действовать на биологическую доступность за счет компенсации повышенного окисления NO. При воздействии хронической гипоксии производство перекиси может увеличиваться за счет ферментативных источников помимо эндотелиальной NO синтазы, таких как НАДФН оксидаза. Liu, et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2006) 290: L2-L10. Это чрезмерное производство перекиси может быть непосредственно связано с NO, снижая его локальное производство. В этом случае возможно, что обеспечение L-цитруллина предусматривает достаточное производство NO для компенсации восстановление, в котором перекись является промежуточным звеном.

В итоге, приведенные примеры показывают, что L-цитруллин смягчает вызванную хронической гипоксией легочную гипертензию у новорожденных поросят. Также очевидно, что эффективность цитруллина обусловлена повышенным производством NO. Таким образом, L-цитруллин является полезной терапией новорожденных при риске развития легочной гипертензии из-за хронической или периодической неустраняемой гипоксии.

ССЫЛКИ

Перечисленные ниже ссылки, а также все ссылки, упомянутые в описании, включены в настоящий документ посредством ссылки до степени, в которой они дополняют, поясняют, предоставляют предпосылки или описывают методологию, способы и(или) композиции упомянутые в настоящем документе.

Jobe et al. (2001) Am J Respir Crit Care Med 163: 1723-1729.

Ballard et al. (2006) N Eng lJ Med 355: 343-353.

Ryan, R.M. (2006) J Perinatology 26: 207-209.

Зарегистрированная заявка на патент США номер US-2004-0235953-A1, зарегистрирована 25 ноября 2004 г.

Публикация международный заявки РСТ No. WO 2005/082042, зарегистрирована 9 сентября 2005 г. Патент США No. 6343382. Патент США No. 6743823.

Понятно, что различные детали настоящего изобретения могут быть изменены без отступления от объема настоящего изобретения. Более того, упомянутое выше описание приведено только для целей иллюстрации и не подразумевает какого-либо ограничения.

Группа изобретений относится к медицине, в частности к лечению бронхопульмонарной дисплазии. Способ включает введение пациенту эффективного количества цитруллина. Предложена также фармацевтическая композиция, приемлемая для внутривенного введения, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и количество цитруллина, эффективное для повышения уровня цитруллина в плазме крови. Причем этот уровень определяют путем сравнения уровня цитруллина в плазме у пациента, находящего на лечении, с уровнем пациента, не страдающего бронхопульмонарной дисплазией. Данная композиция предложена также для получения препарата для инъекций. Изобретения обеспечивают эффективное лечение бронхопульмонарной дисплазии за счет многокомпонентного воздействия цитруллина на патогенез заболевания. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Способ лечения бронхопульмонарной дисплазии, включающий внутривенное введение пациенту эффективного количества цитруллина.

2. Способ по п. 1, в котором пациентом является ребенок.

3. Способ по п. 2, в котором ребенок является недоношенным ребенком.

4. Способ по п. 1, в котором цитруллин вводят в дозе от примерно 100 мг до примерно 30000 мг.

5. Способ по п. 4, в котором цитруллин вводят в дозе от примерно 250 мг до примерно 1000 мг.

6. Способ по п. 1, в котором пациент страдает от гипоцитруллинемии, характеризующейся уровнем цитруллина в плазме крови <37 мкмол/л.

7. Фармацевтическая композиция, приемлемая для внутривенного введения и предназначенная для лечения бронхопульмонарной дисплазии, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и количество цитруллина, эффективное для повышения уровня цитруллина в плазме крови, причем уровень определяют путем сравнения уровня цитруллина в плазме у пациента, находящего на лечении, с уровнем пациента, не страдающего бронхопульмонарной дисплазией.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, в которой количество цитруллина является эффективным для повышения уровня цитруллина в плазме у пациента до как минимум 5 мкмол/л, в некоторых случаях как минимум до 10 мкмол/л, в некоторых случаях как минимум до 20 мкмол/л, в некоторых случаях как минимум до 25 мкмол/л и в некоторых случаях как минимум до 37 мкмол/л.

9. Применение фармацевтической композиции по п. 7 для получения препарата для инъекций, эффективного для лечения бронхопульмонарной дисплазии.

10. Способ по п. 1, в котором лечение пациента с бронхопульмонарной дисплазией включает введение фармацевтической композиции по п. 7.

11. Способ по п. 10, в котором фармацевтическая композиция включает такое количество цитруллина, которое эффективно для повышения уровня цитруллина в плазме у пациента до как минимум 5 мкмол/л, в некоторых случаях как минимум до 10 мкмол/л, в некоторых случаях как минимум до 20 мкмол/л, в некоторых случаях как минимум до 25 мкмол/л и в некоторых случаях как минимум до 37 мкмол/л.