СРЕДСТВО ДЛЯ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/4196 A61P43/00 A61K9/00 

Изобретение относится к фармации и медицине, а именно к лекарственным средствам, положительно влияющим на состояние нитроксидергической системы.

Известно, что нарушение функционирования нитроксидергической системы, которое приводит к дефициту оксида азота (NO), резко повышает риск возникновения и развития заболеваний дыхательной, сердечно-сосудистой, гепато-билиарной систем, желудочно-кишечного тракта, а также развития эндокринных нарушений [1]. В патогенезе и клинике таких заболеваний, как атеросклероз, сахарный диабет, артериальная гипертензия и их осложнений, одним из важных аспектов считается нарушение структуры и функции сосудистого эндотелия [1, 3]. Эндотелиальная дисфункция (ЭД) развивается при дефиците оксида азота, нарушении экспрессии или транскрипции эндотелиальной NO-синтазы (eNOS), снижении доступности запасов L-аргинина для eNOS, то есть при нарушении функционирования нитроксидергической системы.

Коррекция нарушений метаболизма оксида азота, т.е. коррекция нитроксидергической системы и восстановление выработки NO, приводит к снижению риска возникновения вышеперечисленных заболеваний, в основе которых лежит эндотелиальная дисфункция.

В конце XX столетия было установлено, что оксид азота (NO) является одним из универсальных и необходимых регуляторов клеточного метаболизма. Выяснилось, что эта молекула является короткоживущим и легко подвергающимся химическим трансформациям свободным радикалом, которая непрерывно ферментативно продуцируется в организме млекопитающих, оказывая воздействие на различные физиологические и патофизиологические процессы. Изучение роли NO позволило установить, что оксид азота - мессенджер, выступающий в роли универсального модулятора разнообразных функций организма, включая регуляцию дыхания, поддержания сердечно-сосудистого гомеостаза, иммунного статуса организма, активности макрофагов, экспрессии генов, пластичности нервной ткани, памяти, высвобождения нейротрансмиттеров. Оксид азота выполняет роль нейромодулятора в центральной нервной системе и в нервно-мышечных синапсах.

Открытие разнообразных физиологических ролей оксида азота в организме привело к созданию, изучению и применению лекарственных препаратов, способных корректировать нитроксидергическую систему.

Однако на сегодняшний день известных лекарственных средств, предназначенных для коррекции нарушений нитроксидергической системы, не так много, и к ним следует отнести лишь препараты, которые как активное действующее вещество содержат L-аргинин (глутаргин, вазотон, тивортин) [2, 3, 5]. Кроме того, их терапевтическое действие недостаточно эффективно, поэтому актуальной задачей является расширение арсенала препаратов для коррекции нарушений нитроксидергической системы, которые проявляли бы высокую эффективность и были безвредны для пациентов.

Известно биологически активное соединение бромид 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (МТ), обладающее кардиопротективным, противоишемическим, антигипертензивным, антиоксидантным, протеинсинтетическим и энерготропным действием (патент Российской Федерации №2404974, C07D 249/08 (2006.01), A61P 9/04 (2006.01), A61P 9/10 (2006.01), A61P 9/12 (2006.01), опубл. 27.11.2010; патент Украины №92692, МПК (2009) A61K 31/41, опубл. в бюл. «Промислова власнiсть», 2010, №22).

Однако нигде в доступной нам литературе не описывается свойство указанного вещества корректировать нарушения нитроксидергической системы.

В основу изобретения поставлена задача получения средства, корректирующего нарушения нитроксидергической системы, которое имеет более высокую эффективность по сравнению с уже известными средствами аналогичного действия и не оказывает побочного эффекта.

Поставленная задача решается тем, что в качестве активной основы лекарственных средств для коррекции нарушений нитроксидергической системы используют бромид 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия.

Суть изобретения поясняется нижеприведенными примерами результатов доклинических исследований.

Пример 1. Для проведения исследований моделировали эндотелиальную дисфункцию (ЭД) (с выраженным дефицитом NO, т.е. нарушением функционирования нитроксидергической системы) путем ежедневного введения N-нитpo-L-аргинин метилового эфира (L-NAME) белым беспородным крысам-самцам массой 180-190 г один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг в течение 8 дней. Проводили оценку эффективности коррекции нарушений нитроксидергической системы при использовании бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (МТ). В эксперименте сравнивали действие бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (МТ) и референс-препарата L-аргинина (EUROBIOPHARM GmgH, Hamburg). Исследуемые препараты вводили внутрибрюшинно через 30 минут после введения L-NAME: L-аргинин в дозе 200 мг/кг/сутки, бромид 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия - в дозе 5 мг/кг/сутки. Крыс выводили из эксперимента на 8 день от его начала под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг), и у них для исследований забирали сердце, которое затем гомогенизировали в жидком азоте и методом дифференцированного центрифугирования выделяли цитозольную фракцию, в которой содержится только эндотелиальная NO-синтаза (eNOS).

В цитозольной фракции гомогената сердца определялись биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции - стабильные метаболиты NO и активность общей NO-синтазы [4]. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) определяли в цитозольной фракции гомогената сердца методом иммуноблотинга [4].

Полученные результаты представлены в таблице №1.

Таблица 1 Влияние бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (МТ) и референс-препарата L-аргинина на показатели системы NO в цитозольной фракции гомогената сердца крыс с эндотелиальной дисфункцией при введении в течение 8 суток Группа животных NOS, мкмоль НАДФ/мин/г белка Нитриты, мкмоль/ г ткани Концентрация eNOS, у.е./г белка интактные (n=10) 12,4±0,63 18,5±0,77 15,7±0,65 ЭД (контроль) (n=10) 4,22±0,45 5,81±0,53 3,2±0,17 ЭД+МТ(5 мг/кг) (n=10) 8,7±0,55*1 (+106,2%) 12,2±0,85*1 (+110%) 10,2±0,45*1 (+218,7%) ЭД+L-аргинин (200 мг/кг) (n=10) 5,00±0,47 (+18,4%) 7,12±0,32* (+22,5%) 3,5±0,27 (+9,3%) Примечание: * - изменения достоверны по отношению к животным контрольной группы (p<0,05); ¹ - изменения достоверны по отношению к группе животных, получавших L-аргипин (p<0,05)

Как видно из таблицы 1, при моделировании эндотелиальной дисфункции (ЭД) у животных наблюдается дефицит NO, о чем свидетельствует достоверное снижение его стабильного метаболита - нитрит-аниона на 68,6% на фоне угнетения активности общей NOS на 66% и снижение экспрессии eNOS на 79,6% в цитозоле миокарда по сравнению с интактными животными.

Курсовое назначение животным с эндотелиальной дисфункцией препарата МТ в дозе 5 мг/кг/сутки приводило к повышению продукции NO в цитозоле миокарда на 110%. МТ усиливал физиологический путь синтеза NO, повышая активность эндотелиальной NO-синтазы. Так, в группе животных с ЭД, получавших МТ, активность общей NO-синтазы в цитозоле возросла на 106,2%, а также отмечалось увеличение экспрессии эндотелиальной NO-синтазы на 218,7% по сравнению с нелеченными животными. L-Аргинин влиял только на образование NO, достоверно повышая уровень нитритов на 22,5%, однако он не оказывал достоверного влияния на активность и экспрессию NO-синтазы в миокарде.

Пример 2. Для оценки эффективности коррекции нарушений нитроксидергической системы при использовании бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (МТ) были использованы 30 крыс обоего пола массой 180-200 г со спонтанной артериальной гипертензией линии НИСАГ (наследственно индукцированная стрессом артериальная гипертензия на фоне дефицита NO) и 8 нормотензивных контрольных животных линии WKR (normotensive Wistar-Kyoto rats), массой 180-220 г. МТ вводили внутрибрюшинно ежедневно в дозе 5 мг/кг в течение 15 суток. L-аргинин (EUROBIOPHARM GmgH, Hamburg) вводили в дозе 200 мг/кг по той же схеме. На 15 день эксперимента животных выводили из эксперимента под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг), и у них забиралось сердце, которое затем гомогенизировали в жидком азоте и методом дифференцированного центрифугирования выделяли цитозольную фракцию, в которой содержится только эндотелиальная NO-синтаза (eNOS). В цитозольной фракции гомогената сердца определялись биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции - стабильные метаболиты NO и активность общей NO-синтазы [4]. Уровень экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) определяли в цитозольной фракции гомогената сердца методом иммуноблотинга [4]. Результаты исследований представлены в таблице №2.

Таблица 2 Влияние МТ иреференс-препарата L-аргинина на показатели системы NO в цитозольной фракции гомогената сердца крыс со спонтанной артериальной гипертензией при введении в течение 15 суток Группа животных NOS, мкмоль НАДФ/мин/г белка Нитриты, мкмоль/ г ткани Концентрация eNOS, у.е./г белка Нормотензивные (интакт) (n=8) 11,75±0,75 17,23±0,84 15,2±0,73 SHR (контроль) (n=10) 5,15±0,64 7,76±0,67 4,1±0,21 SHR+MT (5 мг/кг) (n=10) 9,71±0,65*1 (+88,5%) 15,15±0,77*1 (+95,2%) 12,3±0,65*1 (+200%) SHR+L-аргинин (200 мг/кг) (п=10) 6,20±0,55 (+20,4%) 9,87±0,44* (+27,2%) 4,77±0,53 (+16,3%) Примечание: * - изменения достоверны по отношению к животным контрольной группы (p<0,05); ¹ - изменения достоверны по отношению к группе животных, получавших L-аргинин (p<0.05)

Как видно из таблицы 2, у крыс линии НИСАГ наблюдается уменьшение образования NO, о чем свидетельствовало достоверное снижение его стабильного метаболита - нитрит-аниона на 55,0% на фоне угнетения активности общей NOS на 56,2% и снижение экспрессии eNOS на 73,0% в цитозоле миокарда по сравнению с нормотензивными крысами.

Курсовое назначение НИСАГ крысам препарата МТ в дозе 5 мг/кг/сутки приводило к повышению продукции NO в цитозоле миокарда на 95%. МТ усиливал физиологический путь синтеза NO, повышая активность эндотелиальной NO-синтазы. Так, в группе НИСАГ крыс, получавших МТ, активность общей NO-синтазы в цитозоле повысилась на 88% на фоне повышения экспрессии эндотелиальной NO-синтазы на 200% по сравнению с нелеченными животными. L-Аргинин не оказывал достоверного влияния на активность и экспрессию NO-синтазы в миокарде, а влиял только на образование NO, достоверно повышая уровень нитритов на 27,2%.

В результате проведенных исследований установлено, что МТ в дозе 5 мг/кг достоверно превосходит референс-препарат L-аргинин в дозе 200 мг/кг по таким показателям нитроксидергической системы, как активность общей NOS, экспрессия eNOS, продукция оксида азота. Терапевтическая эффективность МТ значительно превышала эффективность референс-препарата L-аргинина.

Таким образом, у известного средства - бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (МТ) - нами выявлено новое свойство - проявлять коррегирующий эффект по отношению к нитроксидергической системе. По активности МТ достоверно превышает препарат сравнения - L-аргинин. По токсичности препарат МТ относится к IV классу (малотоксичен). Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволит в дальнейшем создавать высокоэффективные безвредные лекарственные средства, содержащие как активное действующее вещество бромид 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия (МТ), для коррекции нарушений нитроксидергической системы.

Литература

1. Новый взгляд на коррекцию эндотелиальной дисфункции / Корокин М.В., Покровский М.В., Кочкаров В.И. и др. // Russian journal of immunology. - 2006. - Vol.9, supp.3. - P.59-63.

2. Корокин M.B., Артюшкова Е.Б. Принципы фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции // Кубанский научный медицинский вестник. - 2007. - №1-2. - С.146-150.

3. Диагностика и лечение артериальной гипертензии. Российские рекомендации (третий пересмотр). - М., 2008.

4. Доклиническое изучение специфической активности потенциальных препаратов: метод, рекомендации ГФЦ МЗ Украины / И.С. Чекман, Ю.И. Губский, И.Ф. Беленичев. - К., 2010. - 81 с.

5. Компендиум. Лекарственные препараты. - К.: Морион, 2010. - С. Л-418, Л-1505.

Предложено применение бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия в качестве активной основы лекарственных средств для коррекции нарушений функционирования нитроксидергической системы. Показано повышение активности эндотелиальной NO-синтазы и повышение продукции NO под действием заявленного средства, которое имеет более высокую эффективность по сравнению с уже известными средствами аналогичного действия и не оказывает побочного эффекта. 2 табл., 1 пр.

Применение бромида 1-(β-фенилэтил)-4-амино-1,2,4-триазолия в качестве активной основы лекарственных средств для коррекции нарушений функционирования нитроксидергической системы.