СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КОКЦИДИОЗОВ У ПТИЦ И ЖИВОТНЫХ Российский патент 2015 года по МПК A61K31/04 A61P33/02 

Изобретение относится к фармации, а именно к антипаразитарным фармацевтическим композициям, и может быть использовано в качестве антиэймериозного препарата в ветеринарии и медицине.

Кокцидиозы - остро, подостро и хронически протекающие болезни животных и человека, вызываемые различными видами простейших, относящихся к подцарству Protozoa, типу Apicomlexa, классу Sporozoa, отряду Coccidiida, семейству Eimeriidae.

Эймериозы вызываются простейшими, паразитирующими преимущественно в эпителиальных клетках кишечника. Некоторые виды паразитируют в желчных протоках печени у кроликов (Е. stiedae) и слизистой оболочке почечной лоханки гусей (Е. truncate). В организме больных эймериозом животных и птиц происходит интоксикация продуктами обмена простейших и гнилостной микрофлоры, что ведет к нарушению функций нервной системы, вызывая угнетение животных, вплоть до коматозного состояния, тремора мышц и паралича конечностей. Животные теряют в весе; мясо переболевших животных имеет низкую питательную ценность и быстро портится при хранении. У птиц снижается яйценоскость. Хозяйства несут большие расходы на приобретение препаратов для лечения, профилактики и проведение дезинвазии помещений. При сильной степени инвазии эймериозы могут вызывать массовую гибель животных (Акбаев М.Ш., Воселеевич Ф.И., Акбаев P.M. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М.: Колос. - 2008. - 756 с.) [1].

Для лечения эймериозов животных и птиц предложены ряд лекарственных препаратов, обладающих антиэймериозной активностью: химкокцид, трихопол, салиномицин, байкокс, нитрофурановые (фуракриллин, фуразолан, фуразолидон) и сульфаниламидные препараты (сульфадимезин, сульфадиметоксин, сульфапередозин, норсульфазол, фталазол), а также левомецетин, мономиецин и многие другие (Акбаев М.Ш., Водянов А.А., Косминков Н.Е. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М.: Колос, - 2000. 559 с); [2]; (Плешаков С.А., Ларионов СВ., Розовенко М.В. Эффективность фуракриллина и фуразонала при эймериозе кроликов //Ж. «Ветеринария». - №8. - Саратов, 1997. с. 28-30); [3]; (Плешаков С.А. Научные основы применения комплексных препаратов на базе нитрофуранов при эймериозе кроликов // Автореф. дисс. канд. вет. наук. - 1999. - 18 с.) [4]. Однако до сих пор не найдено специфически действующих на эймерий лекарственных препаратов, а те, которые широко применяются, обладают одним или несколькими негативными свойствами: дороговизна, токсичность, кумуляция в съедобных тканях животных, иммунодепрессивное действие, опасность развития резистентных штаммов возбудителя.

Несмотря на широкое использование лекарственных препаратов в качестве средств лечения и профилактики эймериозов, получить 100% показатели экстенс- и интенс-эффективности не удается. Поэтому эти препараты применяются неоднократно. Например, для лечения эймериоза кроликов применяют фуразолидон по 250 мг/кг в течение 10 дней, а после 5-дневного перерыва - сульфадиметоксин - в первый день 2 г, в последующие 9 дней - по 1 г на животное (Пономаренко В.Я. К вопросу о химиопрофилактике кокцидиоза кроликов // Мат-лы научной конференции паразитологов УАССР. - 4.2. - Киев. - 1975. - СПб.) [5].

Предложен способ лечения фуракрилином или фуразоналом в комплексе с витаминами и солями гидроксиэтилидендифосфорной кислоты, что позволяет уменьшить разовые дозы препаратов (действующего начала) до 30 мг/кг и 15 мг/кг массы тела соответственно (Патент РФ 2154470, опубл. 20.08.2000) [6].

Известен способ лечения коров, больных эймериозом, включающий скармливание с кормом кокцидина и дополнительное введение однократно 10% раствора эраконда - фитопрепарата, стимулирующего обменные процессы и повышающего резистентность организма в дозе 4,5-5,5 мг/кг массы тела (Патент РФ 2234932, опубл. 27.08.2004) [7].

Известен способ лечения эймериоза у животных и птиц, включающий двукратное с интервалом 5 дней скармливание ксимедона или ксимедонгидрохлорида в дозе 30 мг/кг массы тела мелким животным и дополнительно введение фуразолидона в дозе 20 мг/кг массы тела пятидневным курсом с интервалом 3 дня (Патент РФ 2322235, опубликован 20.04.2008, Бюл. №11) [8].

Недавно нами также был предложен новый способ лечения кокцидиозов, в частности эймериозов на основе соли четвертичного фосфония и замещенного динитробензофуроксана (Патент РФ 2473334, опубликован 27.01.2013, Бюл. №3), включающий 2-х кратный прием с интервалом в 24 часа фармацевтической композиции «Депрот-14» в дозе 4 мг/кг (в пересчете на действующее вещество - соль фосфония) при ЛД₅₀ 2500 мг/кг.

Заявленное техническое решение, однако, позволило создать более эффективный антиэймериозный препарат «Депрот-эрин» с более низкой одноразовой лечебной дозой 2,5 мг/кг и более высоким значением ЛД₅₀ 10300 мг/кг и удешевить предполагаемое производство препарата, также за счет замены требующего организации синтеза динитробензофуроксанового производного уже выпускающимся в России многими фармпредприятиями лекарственного препарата «Эринита».

Таким образом, принцип использования антиэймериозных препаратов основан на многократном их применении, что неиндифферентно для любого организма. Многие из них обладают токсическим, раздражающим и иммунодепрессивным действием. Кроме того, длительное применение одного кокцидиостатика приводит к появлению устойчивых рас эймерий, которые вызывают явления дисбактериоза, способствуют угнетению ферментативной активности желудочно-кишечного тракта и могут быть причиной других функциональных изменений в организме животных.

Кроме того, при применении сульфаниламидов могут возникнуть аллергические реакции и другие побочные явления: дерматиты, лейкопения, невриты. Вследствие плохой растворимости сульфаниламиды и особенно продукты их ацетилирования, образующиеся в организме путем замещения водорода аминогруппы остатком уксусной кислоты, могут выпадать в почках в виде кристаллов и закупоривать мочевые пути (Машковский М.Д. Лекарственные средства. Ч. 2. М., Медицина, 1993, с. 688.) [9].

Следовательно, изыскание новых препаратов и схем их применения для профилактики и лечения эймериозов животных, птиц и человека, воздействующих на различные звенья патологического процесса, является актуальной задачей как фармации, так и ветеринарии.

Задачей заявленного технического решения является создание эффективного нетоксичного антиэймериозного препарата нового поколения на основе соли четвертичного фосфония (которая проникает через мембрану паразита, встраиваясь в нее, как синтетический аналог - фрагмент природной мембраны паразита), обладающего характерным комплексом свойств:

- сверхнизкими лечебными дозами 2.5 мг/кг в пересчете на действующее вещество А - соль фосфония;

- высоким значением ЛД₅₀ 10300 мг/кг;

- высокой эффективностью в отношении эймерий, обеспечивающей расширение арсенала известных малоэффективных, токсичных и дорогостоящих средств указанного назначения.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание новой по механизму действия нетоксичной (ЛД₅₀ 10300 мг/кг) фармацевтической композиции «Депрот-эрин», эффективной для лечения эймериозов при 1-кратном приеме в дозе 30 мг/кг (в пересчете на действующее вещество - соль фосфония А - 2.5 мг/кг). Препарат принимается 1 раз в день в утреннее кормление.

Заявленный технический результат достигается применением композиции «Депрот-эрин», содержащей н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний бромид (А) и известный лекарственный препарат «Эринит» (В) в качестве активных компонентов, при весовом соотношении 1:2 и глюкозу как вспомогательное вещество:

Как нами показано, четвертичные соли фосфония обладают высокими антибактериальными свойствами вследствие взаимодействия с липидными компонентами клеточных мембран [Галкина И.В., Мельникова Н.Б., Тудрий Е.В., Галкин В.И., Жильцова О.Е., Жукова О.В., Егорова С.Н. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран / Фармация, 2009 - №4. - С. 35-38.]. Как было указано выше, нами ранее была показана высокая антиэймериозная активность фармацевтической композиции на основе соли четвертичного фосфония (A) с нитропроизводными бензофуроксанов, где последние использовались в качестве генераторов NO [Пат. РФ 2473334, опубл. 27.01.2013, Бюл. №3]. Теперь в качестве генератора NO нами предлагается дешевый и широко применяемый в медицинской практике известный препарат «Эринит» (В). [Марцевич С.Ю., Метелица В.И. Эффективность «Эринита» при стенокардии // Сов. мед. - 1987. - №2. - С. 67-70]. Из исследованного уровня техники не выявлены сведения о наличии антиэймериозной активности у «Эринита» и у солей четвертичного фосфония, как по отдельности, так и в совокупности, что является доказательством соответствия заявленного технического решения критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям. При этом широко известны антибактериальные, противогрибковые и антимикробные свойства приведенных выше солей фосфония [Галкина И.В, Тудрий Е.В., Бахтиярова Ю.В., Егорова С.Н., Галкин В.И. Синтез, строение и исследование биологической активности солей фосфония / В сб.: Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ. - Казань, 2008. - С. 23; pat. JP 2002308713, publ. 23.10.2002; pat. JP 2005060332, publ. 10.03.2005; pat. JP 2000316701, publ. 21.11.2003]. Активные компоненты заявляемой композиции на основе соли четвертичного фосфония и «Эринита» используются в заявленном техническом решении по новому для них назначению - в качестве антиэймериозного препарата, что не является очевидным для специалиста в анализируемой области техники; таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. заявленная композиция может быть получена посредством использования известных компонентов с применением стандартного оборудования и известных приемов.

Сущность заявленного технического решения заключается в создании антиэймериозной композиции, содержащей н-тетрадецилтри-n-бутилфосфоний бромид и препарат «Эринит» при их весовом соотношении 1:2 и глюкозу как вспомогательное вещество.

Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом.

1. Получают первый действующий компонент (A) заявляемой композиции - н-тетрадецилтри-н-бутилфосфонийбромид формулы.

способом, описанным в [Галкина И.В., Мельникова Н.Б., Тудрий Е.В., Галкин В.И., Жильцова О.Е., Жукова О.В., Егорова С.Н. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран / Фармация, 2009 - №4. - С. 35-38.]:

2. Второй компонент - «Эринит» (В) является отечественным легкодоступным и дешевым продажным препаратом (производители: Фармапол-Волга ООО, Россия, ТАТХИМФАРМПРЕПАРАТЫ. Казанское производственное химикофармацевтическое объединение, Россия и др.). По фармакологическому действию «Эринит» близок к нитроглицерину и другим органическим нитратам. Не растворяется в воде. Оказывает сосудорасширяющее действие, влияя на центральную регуляцию кровообращения и непосредственно расслабляя гладкую мускулатуру сосудов. Отличается от нитроглицерина медленным развитием эффекта, большей длительностью действия и значительно меньшим влиянием на артериальное давление. Не изменяет или слегка уменьшает работу сердца, расслабляет гладкую мускулатуру внутренних органов. Хорошо всасывается в желудочно-кишечном тракте. Через 4-8 часов после введения внутрь в дозе 40 мг минимальная концентрация «Эринита» в крови составляет 0,2-0,25 мкг/мл. В крови около 85% связывается с белками. «Эринит» разрушается преимущественно до моно- и динитратов и в меньшей мере - до пентаэритритола. Около 90% введенной дозы выводится в течение 48 час главным образом почками. Небольшое количество препарата выводится с желчью [Машковский М.Д. Лекарственные средства (пособие для врачей). 16-е издание. Изд.: М. Новая волна, 2010. - С. 398.].

Все вышеописанные параметры «Эринита» способствуют эффективному всасыванию только в желудочно-кишечном тракте основного действующего вещества А предлагаемой нами фармацевтической композиции - соли фосфония и через 2 дня полностью через почки удаляется из организма и не обнаруживается в мясной продукции пролеченных животных.

Вспомогательные вещества: крахмал, декстроза, тальк, стеариновая кислота и сахар входят в состав препарата «Эринит».

Глюкозу кристаллическую медицинскую использовали по ГОСТ 975-88 в качестве питательного вещества для простейших и наполнителя (производитель Днепропетровский крахмально-паточный комбинат).

Заявленное техническое решение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение антиэймериозной композиции «Депрот-эрин» и лекарственных форм на ее основе.

В фарфоровой ступке смешивают и растирают 99,82 г глюкозы, 0,7 г н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний бромида (А) и 35 г «Эринита» (В) до получения бесцветного однородного порошка, увлажняют 14 мл 32% сиропа из глюкозы (фармацевтическая композиция «Депрот-эрин»). Гранулируют через сито с диаметром отверстий 1,5 мм. Сушат на воздухе. Порошок является лекарственной формой для лечения птиц. Для дозирования у животных порошком наполняли облатки (дозированные закрывающиеся контейнеры из крахмала). Пероральная дозированная лекарственная форма весом 0.5 г содержала 0,0025 г соли фосфония (А), 0.005 г «Эринита» (В) и 0,36 г глюкозы.

Пример 2. Изучение антиэймериозной активности препарата «Депрот-эрин» в отношении смешанного эймериоза птиц и животных, вызванного эймерией: Е. meleagrimitis, Е. gallopavonis, Е. adenoeides, Е. dispersa, Е. meleagridis, Е. innocua, Е. subrotunda, E. tenella, E. maxima, E. acervulina, E. necatrix, E. stiedae, E. perforans, E. magna, E. media и др.

Для определения лечебной эффективности соединения «Депрот-эрин» при эймериозе птиц и животных проводили в трех опытах.

В первом опыте антиэймериозная активность препарата исследована в условиях вивария кафедры паразитологии и радиобиологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины» в апреле-мае 2013 года на 36 индюшатах в возрасте 20 суток. Индюшат заражали смешанной культурой спорулированных ооцист эймерий (Е. meleagrimitis, Е. gallopavonis, Е. adenoeides, Е. dispersa, Е. meleagridis, Е. innocua, Е. subrotunda и др.) в дозе 3 тысячи ооцист на кг птицы, после чего их разделили на 3 группы по 10 голов в каждой. При этом обращали внимание на пол и живую массу птиц.

Во время эксперимента индюшата содержались в клетках вивария кафедры паразитологии и радиобиологии и питались комбикормом. Через 7 суток после заражения первая группа индюшат получила препарат «Депрот-эрин» однократно в дозе 2,5 мг/кг по действующему веществу (А) или 30 мг/кг синтезированной фармацевтической композиции. Вторая группа получала сульфадимезин один раз в день в дозе 20 мг/кг 3-дневным курсом с перерывом 2 дня - всего 6 дней. 3-я группа цыплят не получала лекарственных препаратов и являлась контрольной. Помет от всех групп индюшат исследовали по методу Котельникова и Вареничева до лечения и на 3, 7 и 14 сутки после окончания лечения. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 1.

Данные табл. 1 показывают, что у индюшат, экспериментально зараженных эймериозом, до лечения интенсивность инвазии колебалась от 42±1,3 до 70±2,1 ооцист кокцидий в поле зрения микроскопа (об. × 8, ок. × 10). Через 3 суток после проведенной терапии в первой группе (препарат "Депрот-эрин") интенсивность инвазии составила 35±0,2, а интенсэффективность и экстенсэффективность 50 и 80 процентов соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии равнялась в первой группе 18±0,1, интенсэффективность и экстенсэффективность лечения 74,3% и 80% соответственно.

Во 2-й группе (препарат сравнения сульфадимезин) интенсивность инвазии на 3 сутки проведенной терапии составила 53±2,2. Интенсэффективность и экстенсэффективность лечения составили 14,5% и 50% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила 38±1,1, интенсэффективность лечения - 38,8%, экстенсэффективность - 60%.

Во время опыта в первой группе индюшат ни одного падежа не было зафиксировано. Во 2-й группе пало двое индюшат, в контрольной - четыре. Таким образом, для освобождения индюшат второй группы от кокцидий потребовалось больше времени, чем в первой. При этом показатели интенсэффективности и экстенсэффективности были ниже, чем в первой группе. В контрольной - 3-й группе интенсивность эймериозной инвазии в период опыта возросла с 42±1,3 до 120±2,2 в конце опыта.

Во втором опыте использовали 45 цыплят 40-дневного возраста. Цыплят заражали смешанной культурой спорулированных ооцист эймерий (Е. tenella, Е. maxima, Е. acervulina, Е. necatrix и др.) в дозе 15000 ооцист на голову, после чего их разделили на 3 группы по 15 голов в каждой. Через 7 суток после заражения 1-й группе цыплят скармливали препарат "Депрот-эрин" однократно, в дозе 2,5 мг/кг по действующему веществу (ДВ) или 30 мг/кг синтезированной фармацевтической композиции. Для сравнения цыплятам второй группы в утреннее кормление добавляли кокцидиовит в дозе 80 мг на кг корма (8 мг/кг веса цыпленка) в течение 5 дней. 3-я группа цыплят не получала лекарственных препаратов и являлась контрольной. Помет от каждого цыпленка во всех группах исследовали по методу Котельникова и Вареничева до лечения и на 3, 7 и 14 сутки после окончания лечения. Результаты исследований отображены в табл. 2.

Из табл. 2 следует, что у цыплят, экспериментально зараженных эймериозом, до лечения интенсивность инвазии колебалась от 52±1,6 до 87±1,3 ооцист кокцидий в поле зрения микроскопа (об. × 8, ок. × 10). Через трое суток после проведения соответствующей терапии препаратом «Депрот-эрин» в первой группе интенсивность инвазии составила 36±0,2, а интенсэффективность и экстенсэффективность 58,6% и 90% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила в первой группе 14±2,1, интенсэффективность и экстенсэффективность лечения 83,9 и 90% соответственно.

Во второй группе (препарат сравнения кокцидиовит) интенсивность инвазии на третьи сутки после терапии составила 41±1,3. Интенсэффективность и экстенсэффективность лечения составили 21,2 и 60 процентов соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила 26±1,1, интенсэффективность лечения - 50, экстенсэффективность - 70 процентов. В контрольной третьей группе цыплят интенсивность инвазии к 14 суткам возросла и равнялась 182±2,4.

В третьем опыте использовали 21 кролика средним весом 2,5 кг, свободных от эймерий и гельминтов. Кроликов заражали смешанной культурой спорулизованных ооцист эймерий (Е. stiedae, Е. perforans, Е. magna, Е. media и др.). Для этого не спорулированные ооцисты эймерий культивировали в чашках Петри в термостате при температуре 26-27°C, периодически орошая дехлорированной водой. Суспензию ооцист отмывали 2 раза водопроводной водой центрифугированием и подсчитывали количество ооцист в 1 мл. Каждому животному перорально вводили ооцисты эймерий в расчете 25000 на 1 кг массы.

После заражения кролики были разделены на 3 группы. Через 10 дней после заражения животным первой группы вместе с кормом давали препарат "Депрот-эрин" в дозе 2,5 мг/кг по действующему веществу (ДВ) однократно, второй группе скармливали сульфадимезин однократно в дозе 20 мг/кг в течение 3-х дней с перерывом 2 дня (всего 6 дней). Третья группа кроликов служила в качестве контроля.

Животные в течение опыта находились в одинаковых условиях содержания, предотвращающих спонтанное заражение. Кормление животных осуществлялось в соответствии с зоотехническими и ветеринарно-санитарными нормами. Ежедневно проводили клинический осмотр поголовья и обращали внимание на поведение кроликов. Пробы фекалий для исследования брали до заражения и после окончания терапии через 3, 7 и 14 дней. Для копрологических исследований проб фекалий использовали метод Кательникова и Вареничева.

Данные о противоэймериозной эффективности препаратов представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что до лечения все кролики были заражены кокцидиозом, интенсивность инвазии (ИИ) колебалась от 97±2,2 до 142±1,1 ооцист эймерий в поле зрения микроскопа (об. × 8, ок. × 10). Через 3 суток после окончания лечения в первой группе (препарат "Депрот-эрин") интенсивность инвазии составила 67±0,1, а интенсэффективность и экстенсэффективность 49,3% и 80% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила в первой группе 33±02, интенсэффективность и экстенсэффективность лечения 75% и 80% соответственно.

Во второй группе (препарат сульфадимезин) интенсивность инвазии на 3 сутки после окончания терапии составила 86±2,4. Интенсэффективность и экстенсэффективность лечения составили 39,5% и 60% соответственно. Через 7 суток интенсивность инвазии составила 41±1,3, интенсэффективность лечения - 71,2, экстенсэффективность - 60%. У кроликов контрольной группы интенсивность эймериозной инвазии в ходе опыта не снижалась и составила через трое суток 122±1,6, через семь суток 136±1,0, через 14 суток 163±1,7.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что после лечения экспериментально зараженных эймериозом кроликов интенсэффективность соединения "Депрот-эрин" была выше, чем при лечении сульфадимезином.

Пример 3. Определение острой токсичности «Депрот-Эрин».

Работа по изучению острой токсичности проводилась в виварии кафедры паразитологии и радиобиологии КГАВМ им. Н.Э. Баумана в феврале 2013 года. В опыте использовались 80 белых крыс, самцов и самок, массой 220-250 г. Препарат в виде водной суспензии вводили в желудок однократно с помощью зонда. Лабораторные животные (учитывался пол, возраст, масса тела) были разделены на 8 групп: 7 опытных и одну контрольную (по 10 голов в каждой). Крысам опытных групп вводили препарат в возрастающих дозах. Крысам контрольной группы в желудок вводили дистиллированную воду. За состоянием здоровья лабораторных животных наблюдали в течение 15 дней, учитывая общее состояние животных, подвижность, прием корма. Случаи гибели регистрировали, павших животных вскрывали.

Установлено, что при внутрижелудочном введении крысам LД₅₀ составила 10300 мг/кг массы тела. Согласно ГОСТ 12.1.007-76 «Депрот-эрин» относится к веществам четвертого класса опасности - не обладающее токсичностью.

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что «Депрот-эрин» обладает выраженной антиэймериозной активностью при низких лечебных дозах и при этом не обладает токсичностью и иными побочными действиями на организме животных и птиц.

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения кокцидиозов у птиц и животных. Антиэймериозная фармацевтическая композиция содержит н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний бромид и лекарственный препарат «Эринит» в качестве активных компонентов при их весовом соотношении 1:2 и глюкозу как вспомогательное вещество. Композиция не токсична и обладает высокой терапевтической эффективностью при низких лечебных дозах. 3 табл., 3 пр.

Антиэймериозная фармацевтическая композиция, содержащая н-тетрадецилтри-н-бутилфосфоний бромид и лекарственный препарат «Эринит» в качестве активных компонентов при их весовом соотношении 1:2 и глюкозу как вспомогательное вещество.