СПОСОБ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КАННАБИНОИДНОГО РЕЦЕПТОРА Российский патент 2015 года по МПК A61K39/395 A61P3/04 A61P25/30 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для повышения эффективности воздействия на функциональную активность каннабиноидного рецептора.

Из уровня техники известны каннабиноидные рецепторы человека (Ken Mackie. Cannabinoid receptors as therapeutic targets. The Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2006. 46: 101-122), которые присутствуют как в ЦНС, так и в периферической нервной системе, и вместе с эндоканнабиноидами представляют собой единую эндоканнабиноидную систему.

Из уровня техники известно лекарственное средство «Римонабант» (Акомплиа), по механизму действия являющееся антагонистом каннабиноидных рецепторов (СВ 1), которое оказывает центральное действие на мозг, уменьшая аппетит (Despres JP, Golay A, Sjostrom L; Rimonabant in Obesity-Lipids Study Group. Effects of rimonabant on metabolic risk factors in overweight patients with dyslipidemia. The New England Journal of Medicine. 2005 Nov.17; 353(20): 2121-34). Однако данный препарат, который воздействует на функциональную активность каннабиноидного рецептора, обладает множественными побочными эффектами.

Изобретение направлено на создание эффективного способа воздействия на функциональную активность каннабиноидного рецептора, обеспечивающего коррекцию нарушений эндоканнабиноидной системы.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе воздействия на функциональную активность каннабиноидного рецептора, согласно изобретению, в организм вводят активированную - потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека, полученную в процессе последовательного многократного разведения матричного раствора антител к каннабиноидному рецептору человека в водном или водно-спиртовом растворителе и промежуточного внешнего механического воздействия.

При этом используют активированную - потенцированную форму антител к цельной молекуле или полипептидному фрагменту каннабиноидного рецептора I типа человека.

Предпочтительно, используют водный или водно-спиртовой раствор активированной - потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, полученный путем многократного последовательного разведения - равномерного уменьшения концентрации матричного раствора аффинно очищенных антител к каннабиноидному рецептору I типа человека с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл и промежуточного внешнего воздействия.

При этом используют смесь различных, преимущественно сотенных, гомеопатических разведений, полученных путем многократного последовательного равномерного уменьшения концентрации матричного раствора аффинно очищенных антител к каннабиноидному рецептору I типа человека и промежуточного внешнего воздействия.

Предпочтительно используют активированную - потенцированную форму антител к цельной молекуле каннабиноидного рецептора I типа человека или полипептидному фрагменту с последовательностью, выбираемой, например, из следующей группы:

QRGTQKSIII;

EKLQSVCSDIFPHIDETYL;

IQRGTQKSIIIHTSEDGKVQVTRPDQARM;

KAHSHAVRMIQRGTQKSIIIHTSEDGKVQVTRPDQARMDIRLAKT;

MSVSTDTSAEAL;

TEFYNKSLSSFKENEENIQCGENFMDIECFMVLNPS;

AQPLDNSMGDSDCLHKHAN;

GTQKSIIIHTSEDG;

MTAGDNPQLVPADQVNITEFYNKSLSSFKENEENIQCGENFMDIEC FMVLN;

VVAFCLMWTIAIVI;

EFYNKSLSSFKENEENIQCGENFMDIECFMVLNPSQQLAIAVLSLTL;

NEENIQCGE;

GSPFQEKMTAGDNPQLVPADQVNITEFYNKSL;

AYKRIVTRPKAVVAFCLMWTIAIVIAVLPLLGWN.

При этом активированную - потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору I типа человека используют в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰ и 100²⁰⁰ раз.

Предложенное введение в организм активированной - потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору человека (т.е. формы антител к каннабиноидному рецептору человека, приготовленной по гомеопатической технологии потенцирования путем многократного последовательного разведения и промежуточного внешнего воздействия - вертикального встряхивания, которая обладает активностью в фармакологических моделях и/или клинических методах воздействия на функциональную активность каннабиноидного рецептора) обеспечивает эффективную коррекцию нарушений эндоканнабиноидной системы без каких-либо побочных явлений, что подтверждено экспериментально на адекватных моделях.

Кроме того, заявленное изобретение расширяет арсенал технических средств, предназначенных для коррекции нарушений эндоканнабиноидной системы без побочных эффектов, в том числе и в составе комплексной терапии.

Заявленный способ реализуется следующим образом.

Для приготовления гомеопатически активированной - потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору человека используют моноклональные или, преимущественно, поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля, М., «Медицина», 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение в индивидуальном виде проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемым в соответствии с изобретением веществом - антигеном: каннабиноидным рецептором I типа человека. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител, которую и используют для получения активированной - потенцированной формы. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Для иммунизации кроликов можно использовать в качестве иммуногена (антигена) адъювант и цельную молекулу каннабиноидного рецептора I типа человека следующей последовательности:

MKSILDGLAD TTFRTITTDL LYVGSNDIQY EDIKGDMASK

LGYFPQKFPL TSFRGSPFQE KMTAGDNPQL VPADQVNITE

FYNKSLSSFK ENEENIQCGE NFMDIECFMV LNPSQQLAIA

VLSLTLGTFT VLENLLVLCV ILHSRSLRCR PSYHFIGSLA

VADLLGSVIF VYSFIDFHVF HRKDSRNVFL FKLGGVTASF

TASVGSLFLT AIDRYISIHR PLAYKRIVTR PKAVVAFCLM

WTIAIVIAVL PLLGWNCEKL QSVCSDIFPH IDETYLMFWI

GVTSVLLLFI VYAYMYILWK AHSHAVRMIQ RGTQKSIIIH

TSEDGKVQVT RPDQARMDIR LAKTLVLILV VLIICWGPLL

AIMVYDVFGK MNKLIKTVFA FCSMLCLLNS TVNPIIYALR

SKDLRHAFRS MFPSCEGTAQ PLDNSMGDSD CLHKHANNAA

SVHRAAESCl KSTVKIAKVT MSVSTDTSAE AL

Возможно для получения поликлональных антител к каннабиноидному рецептору I типа человека использование в качестве иммуногена полипептидного фрагмента каннабиноидного рецептора I типа человека с последовательностью, выбираемой, например, из следующей группы:

QRGTQKSIII;

EKLQSVCSDIFPHIDETYL;

IQRGTQKSIIIHTSEDGKVQVTRPDQARM;

KAHSHAVRMIQRGTQKSIIIHTSEDGKVQVTRPDQARMDIRLAKT;

MSVSTDTSAEAL;

TEFYNKSLSSFKENEENIQCGENFMDIECFMVLNPS;

AQPLDNSMGDSDCLHKHAN;

GTQKSIIIHTSEDG;

MTAGDNPQLVPADQVNITEFYNKSLSSFKENEENIQCGENFMDIEC

FMVLN;

VVAFCLMWTIAIVI;

EFYNKSLSSFKENEENIQCGENFMDIECFMVLNPSQQLAIAVLSLTL;

NEENIQCGE;

GSPFQEKMTAGDNPQLVPADQVNITEFYNKSL;

AYKRIVTRPKAVVAFCLMWTIAIVIAVLPLLGWN

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°C) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Добавляют к антисыворотке 20% (весовая концентрация) NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранят до использования в замороженном состоянии при температуре -20°C. Для выделения из антисыворотки антител к каннабиноидному рецептору I типа человека производят абсорбцию на твердой фазе в следующей последовательности:

1) 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl, добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°C;

2) выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3) после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4) фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Затем производят очистку антител методом аффинной хроматографии путем прикрепления полученных антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, который находится на нерастворимом матриксе с последующим элюированием концентрированными растворами соли.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.

Активированную - потенцированную форму действующего вещества - антител к каннабиноидному рецептору I типа человека в сверхмалой дозе готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части упомянутого матричного раствора в 9 частях (для десятичного разведения), или в 99 частях (для сотенного разведения С), или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального водного или водно-спиртового растворителя с многократным вертикальным встряхиванием-потенцированием (или "динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В.Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29).

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С 12 одну часть упомянутого матричного раствора антител к каннабиноидному рецептору I типа человека с концентрацией 3,0 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают-потенцируют полученное 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-е сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно в разных емкостях 12 раз 1-й части исходного матричного раствора антител к каннабиноидному рецептору I типа человека с концентрацией 3,0 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, полученный сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведений С30 и С200.

При использовании смеси различных гомеопатических, преимущественно сотенных, разведений активированной - потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека в сверхмалой дозе действующего вещества каждый компонент состава (например, С12, С30, С200) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно, до получения С11, С29, С199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). При этом получают активированную - потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору I типа человека в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100, 100²⁰⁰ раз, что эквивалентно смеси сотенных гомеопатических разведений С12, C30, С200.

Возможно использование активированной - потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека в сверхмалой дозе действующего вещества в виде смеси других различных гомеопатических разведений, например десятичных и/или сотенных (D 20, С30, С100 или С12, C30, С50 и т.д.), эффективность которых определяют экспериментально.

При потенцировании вместо встряхивания в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять внешнее воздействие ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Заявленный способ может быть реализован с использованием активированной - потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека в сверхмалой дозе в твердой лекарственной форме, которую приготовляют таблетированием из таблеточной массы, которая, например, содержит 8÷30 масс. частей гранул лактозы с размером частиц 150÷300 мкм, орошенных в псевдоожиженном-кипящем слое водным или водно-спиртовым раствором активированной - потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, и фармацевтически приемлемые добавки, включающие 75÷95 масс. частей чистой лактозы, 8÷15 масс. частей микрокристаллической целлюлозы и 0,8÷1,2 масс. частей стеарата магния. Масса таблетки может составлять 150÷500 мг. Предпочтительно использовать таблетки массой 250÷300 мг, которые включают 3,0÷6,0 мг/табл активированной - потенцированной формы водно-спиртовых разведений субстанции - действующего вещества поликлональных кроличьих антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением по вышеуказанной гомеопатической технологии исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведений С12, C30, С200 (сверхмалые дозы - СМД анти-КР).

Для проведения экспериментальных исследований были использованы поликлональные антитела, приготовленные по заказу специализированной фармацевтической фирмой.

Пример 1.

Заявленная в соответствии с изобретением активированная - потенцированная форма антител к каннабиноидному рецептору I типа человека в сверхмалой дозе (по направленности действия - рецептор каннабиноидный I типа - является центральным) в связи использованием особой технологии потенцирования оказывает щадящее воздействие на рецептор, приводящее к его сенситизации и вследствие этого - повышению чувствительности к эндогенным каннабиноидам.

Данный эффект подтверждается следующим экспериментом: проведено изучение влияния препарата на основе активированной - потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведений С12, C30, С200 (сверхмалые дозы - СМД анти-КР), на функциональное состояние каннабиноидного рецептора I типа (in vitro) в 2 этапа: в режиме агониста и в режиме антагониста.

Режим агониста

Перед внесением в лунки микропланшета (96-луночный планшет, объем лунки 250 µl) клетки суспендировали в буфере HBSS (Invitrogen), содержащем 20 мМ HEPES (рН 7.4). Клетки преинкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре вместе с добавлением 20 мкл препарата СМД анти-КР. После преинкубации в лунки добавляли активатор аденилатциклазы NKH477. Клетки инкубировали в течение 10 минут 37°C и лизировали. В лунки вносили флуоресцентный акцептор (цАМФ, меченный D2) и флуоресцентный донор (антитела к цАМФ, меченные криптатом европия).

В качестве базального контроля вместо препарата СМД анти-КР суспензию клеток преинкубировали в присутствии HBSS буфера (20 мкл). В качестве стимулированного контроля вместо СМД анти-КР суспензию клеток преинкубировали в присутствии референсного агониста СР 55940 (20 мкл).

Функциональную активность (по концентрации цАМФ) оценивали методом гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF). Интенсивность флуоресценции в базальном контроле принимается за фоновую, и ее значение вычитается из интенсивностей флуоресценции в опыте (СМД анти-КР) и контроле (СР 55940):

Измеренный специфический ответ клетки на введение СМД анти-КР вычисляется по формуле: интенсивность флуоресценции в опыте (СМД анти-КР) - интенсивность флуоресценции в базальном контроле.

Измеренный специфический ответ клетки на введение референсного агониста (СР 55940) вычисляется по формуле: интенсивность флуоресценции в контроле (СР 55940) - интенсивность флуоресценции в базальном контроле.

Результаты выражаются в процентах от специфического ответа клетки на введение референсного агониста в стимулированном контроле:

% ответа референсного агониста = ((измеренный специфический ответ/специфический ответ в контроле на введение референсного агониста)×100%).

Режим антагониста

Перед внесением в лунки микропланшета (96-луночный планшет, объем лунки 250 µl) клетки суспендировали в буфере HBSS (Invitrogen), содержащем 20 мМ HEPES (рН 7.4). Клетки проинкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре вместе с добавлением 20 мкл препарата СМД анти-КР. После добавления в лунки референсного агониста СР 55940 клетки инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Далее в лунки добавляли активатор аденилатциклазы NKH477. Клетки инкубировали в течение 10 минут 37°C и лизировали. В лунки вносили флуоресцентный акцептор (цАМФ, меченный D2) и флуоресцентный донор (антитела к цАМФ, меченные криптатом европия).

В качестве базального контроля вместо СМД анти-КР суспензию клеток проинкубировали в присутствии референсного антагониста AM 281 (20 мкл). В лунки с базальным контролем не добавляли референсный агонист СР 55940. В качестве стимулированного контроля суспензию клеток преинкубировали в присутствии HBSS буфера, содержащего 20 мМ HEPES (рН 7.4), и референсного агониста СР 55940 (20 мкл).

Функциональную активность (по концентрации цАМФ) оценивали методом гомогенной флуоресценции с временным разрешением (HTRF). Интенсивность флуоресценции в базальном контроле принимается за фоновую и ее значение вычитается из интенсивностей флуоресценции в опыте (СМД анти-КР) и контроле (СР 55940).

Измеренный специфический ответ клетки на введение СМД анти-КР вычисляется по формуле: интенсивность флуоресценции в опыте (СМД анти-КР) - интенсивность флуоресценции в базальном контроле.

Измеренный специфический ответ клетки на введение референсного агониста (СР 55940) вычисляется по формуле:

интенсивность флуоресценции в контроле (СР 55940) - интенсивность флуоресценции в базальном контроле.

Результаты выражаются в процентах ингибирования специфического ответа клетки на введение референсного агониста (СР 55940) в контроле:

% ингибирования ответа референсного агониста =100%- ((измеренный специфический ответ/специфический ответ в контроле на введение референсного агониста)×100%)

В результате исследований показано (см. таблицу 1), что СМД анти-КР изменяет функциональную активность каннабиноидного рецептора I типа, оцененную по концентрации внутриклеточной цАМФ.

Образец (сверхмалые дозы антител к каннабиноидному рецептору I типа (смесь гомеопатических разведений С12+C30+С200)) проявляет свойства агониста к каннабиноидному рецептору I типа, выраженность модифицирующего эффекта которого составляет 21% от эффекта стандартного агониста СР55940 (эффект стандартного агониста принимается за 100%).

Таблица 1 Рецептор Препарат Содержание СМД анти-КР в лунке (% по объему) (общий объем всех соединений в лунке равен 200 мкл) Режим агониста Режим антагониста Пояснения к результатам % ответа агониста Стандартный агонист % ингибирования ответа агониста Стандартный антагонист СВ1-Рецептор каннабиноидный I типа СМД антител к каннабиноидному рецептору I типа (С12+C30+С200) 10% 21 CP 55940 0 AM 281 СМД антител обладают эффектом агониста, выраженность которого составляет 21% от эффекта стандартного агониста (принимается за 100%)

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и фармакологии, и касается воздействия на функциональную активность каннабиноидного рецептора. Для этого в организм вводят активированную - потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека. При этом используют активированную - потенцированную форму антител к цельной молекуле или полипептидному фрагменту каннабиноидного рецептора I типа человека. Способ обеспечивает эффективную коррекцию нарушений эндоканнабиноидной системы при отсутствии побочных эффектов. 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Способ воздействия на функциональную активность каннабиноидного рецептора, характеризующийся тем, что в организм вводят активированную - потенцированную форму антител к каннабиноидному рецептору человека, полученную в процессе последовательного многократного разведения матричного раствора антител к каннабиноидному рецептору человека в водном или водно-спиртовом растворителе и промежуточного внешнего механического воздействия.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что используют активированную - потенцированную форму антител к цельной молекуле или полипептидному фрагменту каннабиноидного рецептора I типа человека.

3. Способ по п.1 или 2, характеризующийся тем, что используют водный или водно-спиртовой раствор активированной - потенцированной формы антител к каннабиноидному рецептору I типа человека, полученный путем многократного последовательного разведения - равномерного уменьшения концентрации матричного раствора аффинно очищенных антител к каннабиноидному рецептору I типа человека с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл и промежуточного внешнего воздействия.

4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что используют смесь различных, преимущественно сотенных, гомеопатических разведений, полученных путем многократного последовательного равномерного уменьшения концентрации матричного раствора аффинно очищенных антител к каннабиноидному рецептору I типа человека и промежуточного внешнего воздействия.