ШТАММ БАКТЕРИЙ Halobacterium salinarum - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОРОДОПСИНА Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается получения белка, бактериородопсина, путем микробиологического синтеза.

Область возможного применения бактериородопсина поразительна по своему разнообразию. Она включает двухстороннюю голографическую память, ультрабыстрое оперативное запоминающее устройство, пространственную модуляцию света, нелинейные оптические фильтры, распознавательные системы, высококонтрастные дисплеи, оптические переключатели и пикосекундные детекторы. Бактериородопсин находит применение в производстве материалов, которые предохраняют ценные бумаги от подделок, а также в качестве антиоксиданта в медицине, фармацевтике, косметологии и сельском хозяйстве в качестве стимулятора роста растений [1].

Самым изученным и приближенным к практическому использованию является бактериородопсин - ретинальсодержащий трансмембранный белок пурпурных мембран галофильных бактерий рода Halobacterium [2].

Известен штамм Halobacterium salinarum D96N (ВКПМ В-9026) [5-13]. Он синтезирует бактериородопсин в количестве до 47 мг/л (2,3 мкмоль/л) культуральной жидкости и выбран нами в качестве родительского штамма [3].

Известен штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 - продуцент бактериородопсина, выбранный нами в качестве прототипа, значительно превосходящий по продуктивности бактериородопсина штаммы бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 и Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 [4].

Задача заявляемого изобретения - получить штамм Halobacterium salinarum с повышенным уровнем синтеза бактериородопсина.

Задача решена путем получения штамма бактерий Halobacterium salinarum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953.

Заявляемый штамм получен путем многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum D96N ВКПМ В-9026, без предварительной обработки химическими реагентами.

Штамм ВКПМ В-11953 имеет следующие характеристики:

Культурально-морфологические признаки.

Величина клеток трехсуточной культуры 2-5×0,5-0,9 мкм, одиночные палочки, иногда объединены по 2-3 палочки.

Подвижен, максимум подвижности на 4 сутки роста. Спор не образует, газовых вакуолей не содержит.

Колонии полупрозрачные, гладкие с гладким краем, темно-красного цвета, в среду не врастают, легко снимаются петлей. Культура является экстремальным галофилом - требует присутствия в среде 25% NaCl. При содержании хлористого натрия ниже 20% клетки теряют свою окраску, а при попадании в среду с содержанием NaCl менее 15% клетки очень быстро лизируются.

Хорошо растет при 36-40°С, в солевой жидкой среде, имеющей состав (мас. %.): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, КСl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, СаСl₂ - 0,02, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4. а также солевой агаризованной среде, имеющей состав (мас. %.): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, КСl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, СаСl₂ - 0,02, агар - 1,5, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4.

Отношение к температуре: хорошо растет при 36-40°С, оптимальная температура 38°С.

Отношение к рН среды: хорошо растет при 7,2-7,4, оптимум рН 7,3.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный аэроб, прототроф, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу не подкисляет, не растет на картофеле. Желатину не разжижает. Антагонистических свойств не обнаружено.

По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16 S рРНК, штамм наиболее близок к видам Halobacterium salinarum (98%).

Как и все представители рода Halobacterium заявляемый штамм непатогенен и может быть отнесен к группе безопасности №1 (на основании заключения Коллекции АТСС). Работа с ним не требует специальных мер предосторожности.

Не является генетически модифицированным штаммом.

Хранение штамма: Хорошо хранится на агаризованной среде в бакпечатках и на косяках в условиях холодильника в течение года. Для длительного хранения штамма используется лиофилизация свежей биомассы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в колбах

Заявляемый штамм ВКПМ В-11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 300 мл при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, «Osram», Germany) до стационарной стадии роста (6 суток) на круговой качалке при 37°С и встряхивании 100 об/мин. Для выращивания использовали среду следующего состава (мас. %): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, КСl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, СаСl₂ - 0,02, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4.

Осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и взвешивали полученную биомассу.

Затем к осадку приливали дистиллированную воду в количестве, равном объему среды выращивания, и инкубировали при встряхивании в условиях комнатной температуры в течение 3 часов.

Осадок отделяли центрифугированием, супернатант использовали для определения количества бактериородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:

С=D·M_r·V_p-pa·V_кюв./Е_бр·V_пробы

где D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм;

М_r - молекулярная масса бактериородопсина (26700);

V_p-pa - общий объем раствора бактериородопсина;

V_кюв - объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете;

E_бр - коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М^-1·см^-1);

V_пробы - объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 Исследуемые штаммы Вес биомассы (г/л) Концентрация бактериородопсина
(мг/л) ВКПМ В-11953 17 55 ВКПМ В-9026 4 20 ВКПМ В-10425 10 35

Из приведенных в таблице 1 результатов видно, что заявляемый штамм ВКПМ В-11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 по количеству биомассы и по концентрации бактериородопсина в культуральной среде.

ПРИМЕР 2. Продуктивность штамма Halobacterium sulinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в плоской кювете

Заявляемый штамм ВКПМ В-11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 выращивали в плоских кюветах объемом 15 л с заполнением 10 литров при освещении люминесцентными лампами дневного света, непрерывной подачи воздуха в кюветы (скорость подачи воздуха 1,5 л/мин) для аэрации и перемешивания до стационарной стадии роста в среде выращивания как в примере 1.

Далее осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и к осадку приливали дистиллированную воду в количестве, равном объему среды выращивания, инкубировали и определяли содержание бактериородопсина как в примере 1.

Данные, представленные в таблице 2, позволяют сделать вывод, что и при выращивании в плоских кюветах заявляемый штамм ВКПМ В-11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 по концентрации бактериородопсина в культуральной среде и биомассе выращенной культуры.

Таблица 2 Исследуемые штаммы Вес биомассы (г/л) Концентрация бактериородопсина
(мг/л) ВКПМ В-11953 30 91 ВКПМ В-9026 13 33 ВКПМ В-10425 17 50

ПРИМЕР 3. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 при выращивании в ферментере

Заявляемый штамм ВКПМ В-11953, а также родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 выращивали в в ферментере Anglicon (Anglicon, USA) в объеме среды выращивания 1500 мл. В качестве среды выращивания использовали среду как в примере 1. В ферментере поддерживали постоянную температуру 37°С, перемешивание: первые 24 часа 400 об/мин, на вторые сутки 600 об/мин на 3 сутки 800 об/мин на 7 сутки 1000 об/мин. Аэрация во время ферментации - 0,75 л/л·мин. Исследуемые штаммы выращивали до стационарной стадии роста. Далее определяли вес биомассы и содержание бактериородопсина в среде выращивания ,как в примере 1. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 Исследуемые штаммы Вес биомассы (г/л) Концентрация бактериородопсина
(мг/л) ВКПМ В-11953 40 115 ВКПМ В-9026 23 53 ВКПМ В-10425 14 65

Как следует из результатов, приведенных в таблицах 1, 2 и 3, заявляемый штамм ВКПМ В-11953 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9026 и прототип ВКПМ В-10425 по количеству синтезируемого при различных условиях культивирования бактериородопсина и биомассы.

Источники информации:

1. Заявка на патент РФ №2005129525 от 23 сентября 2005 года.

2. Rosa Margesin, Franz Schinner, Extremophiles, 5, (2001), pp.73-83

3. Миронова Ε.В. «Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина», автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, 2002.

4. Патент РФ №2416634.

5. Патент USA №16616964.

6. Miller Α., Oesterhelt D., BBA, 1020 (1990), pp.57-64.

7. Otto H., Marti Т., Holz M., Mogi Т., Lindau M., Khorana H.G. and Heyn M.P., http://Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 86(1989), pp.9228-9232.

8. Thorgeirsson Т.Е., Milder S.J., Milreke L.J.W., Betlach M.C., Shand R.F., Stroud R.M. and Kliger D.S., Biochemistry, 30 (1991), pp.9133-9142.

9. Патент USA №4927180

10. Патент USA №5518858

11. Патент USA №5807625

12. Патент USA №5872648

13. Патент USA №5920058

Получен штамм бактерий Halobacterium salinarum D96N ВКПМ В-11953 - продуцент бактериородопсина, значительно превосходящий по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) как ближайший аналог, так и другие, выбранные в качестве контролей штаммы в различных условиях культивирования. 3 табл.

Штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 - продуцент бактериородопсина.