СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОРОДОПСИНА Российский патент 2015 года по МПК C12P1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается получения белка, бактериородопсина, путем микробиологического синтеза.

Область возможного применения бактериородопсина поразительна по своему разнообразию. Она включает двухстороннюю голографическую память, ультрабыстрое оперативное запоминающее устройство, пространственную модуляцию света, нелинейные оптические фильтры, распознавательные системы, высококонтрастные дисплеи, оптические переключатели и пикосекундные детекторы. Бактериородопсин находит применение в производстве материалов, которые предохраняют ценные бумаги от подделок, а также в качестве антиоксиданта в медицине, фармацевтике, косметологии и сельском хозяйстве в качестве стимулятора роста растений [1-10].

Известен препарат для стимуляции роста и развития на основе бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025, содержащий бактериородопсин в количестве от 10^-9 до 10^-6 М. [1].

Известен препарат для стимуляции роста и развития растений на основе штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025, содержащий бактериородопсин, полученный путем выращивания штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 в течение 6 сут, после чего биомассу отделяют центрифугированием при 7000 g и инкубируют в дистиллированной воде, осадок отбрасывают, а полученный супернатант центрифугируют при 50000 g, супернатант отбрасывают, а к полученному осадку приливают дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендируют несколько раз до тех пор, пока в суспендируемом осадке не восстановится отношение оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀\D₅₇₀) менее 2,5, далее супернатант стандартизуют до концентрации бактериородопсина от 10^-9М до 10^-6М [2]. Данный способ является ближайшим аналогом заявленного изобретения.

Задача заявляемого изобретения - способ, позволяющий получить высокий выход бактериородопсина.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение выхода бактериородопсина.

Технический результат достигается за счет использования штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 и любого силикагеля. Изобретение иллюстрируется следующим примером.

ПРИМЕР. Способ получения бактериородопсина.

Штамм ВКПМ В-11850, а также используемый в качестве контроля штамм ВКПМ В-9025 (прототип) выращивали в ферментере объемом 1200 л (DeDietrich, Germany) в объеме среды культивирования 500 л. Для выращивания использовали среду следующего состава (мас. %): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, КСl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, СаСl₂ - 0,02, вода - остальное, рН среды -7,2-7,4. В ферментере поддерживали температурный режим 36,8-37,2°С. Аэрация во время ферментации - 30 л/мин. Исследуемые штаммы выращивали при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, «Osram», PRC) 7 суток.

По окончании ферментации проводили отделение и разрушение биомассы на модуле-сепараторе Clara 20 (Альфа Лаваль Поток, Россия). Процесс на модуле-сепараторе проводили при скорости подачи ферментационной жидкости 240 литров/час и вращении барабана 9512 об/мин.

Осадок отделяли центрифугированием при 10000 g 15 мин и отбрасывали, а полученный супернатант центрифугировали при 50000 g 55 мин, супернатант отбрасывали, а к полученному осадку приливали дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендировали 3-4 раза, после чего наносили на хроматографическую колонку с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля [10]. После элюции отбирали образцы с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀\D₅₇₀) менее 2,5. В отобранных образцах определяли количество бактериородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:

С=D·M_r·V_p-pa·V_кюв/E_бр·V_пробы

Где:

D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм;

М_r - молекулярная масса бактериородопсина (26700);

V_p-pa - общий объем раствора бактериородопсина;

V_кюв - объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете;

Е_бр - коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М^-1 см^-1);

V_пробы - объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 Исследуемые штаммы Количество бактериородопсина (мг/мл) ВКПМ В-9025 30 ВКПМ В-11850 45

Из приведенных в таблице 1 результатов видно, что заявляемый способ получения бактериородопсина с использования штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850 дает более высокий уровень бактериородопсина по сравнению со способом, основанным на применении штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025.

Источники информации

1. Патент РФ N 2307506.

2. Патент РФ N2416634.

3. Skladnev D., Tyurin S., Gricevich J. "Plant-growth-promoting effects of biomass lysate of selected agronomically important strain Halobacterium salinarum." Abst. XI International Congress PHYTOPHARM-2007 "Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin" Leiden, The Netherlands, 2007 - P. 18.

4. Тюрин C.A., Складнев Д.А., Ходонов А.А. "Ретиналь бактериородопсина как иммобилизованный фитогормон" Тезисы стендовых сообщений. III Российский симпозиум «Белки и пептиды». - Пущино. - 2007. - С. 94.

5. Tyurin S.A., Khodonov А.А., Skladnev D.A.«Unfolded bacteriorhodopsin become a phytohormone» Abstracts 3rd International Meeting "Molecular Simulation Studies in Material and Biological Sciences", September 10-12, JINR, Dubna, Russia, 2008 - P.36,37.

6. С.А.Тюрин, Ю.Г. Грицевич, Д.А. Складнев, А.А. Ходонов "Бактериородопсин как стимулятор роста и развития растений", Агрохимия - 2009. - №.6. - С. 32-39.

7. Коротков А.В., Прусакова Л.Д., Фесенко А.Н., Грицевич Ю.Г., Тюрин С.А. "Способ выращивания гречихи", Объединенный научный журнал - 2010. - №3. - С.66-69.

8. Alexander KOROTKOV, Alexey FESENKO, Sergey TYURIN, Yuliy GRITSEVICH, Lidiya PRUSAKOVA «Effect of Bacteriorhodopsin on the growth and development of buckwheat» Advances in buckwheat research. Proceedings of the 11th International Symposium on Buckwheat. Orel, Russia, 2010, P. 670-674.

9. А.В. Коротков, Л.Д. Прусакова, С.Л. Белопухов, А.Н. Фесенко, С.А. Тюрин, Ю.Г. Грицевич "Влияние люрастима и бактериородопсина на урожай и качество зерна гречихи", Известия ТСХА, 2011 год, выпуск 1, С. 118-123.

10. Остерман Л.А. «Хроматография белков и нуклеиновых кислот». Издательство «Наука», Москва, 1985 год, С. 58-62.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Описан способ получения бактериородопсина. Способ включает в себя выращивание микробной массы в ферментере объемом 1200 л в течение 7 суток. Отделение и разрушение биомассы на модуле-сепараторе. Отделение осадка центрифугированием при 10000 g 15 мин. Полученный супернатант центрифугировали при 50000 g 55 мин, а супернатант отбрасывали. К полученному осадку приливали дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендировали в воде 3-4 раза. После чего наносили на хроматографическую колонку с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля. После элюции отбирали образцы с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5. Изобретение позволяет получать высокий выход бактериородопсина, в том числе за счет использования штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850. 1 табл., 1 пр.

Способ получения бактериородопсина, включающий выращивание в ферментере объемом 1200 л в течение 7 суток штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11850, отделение и разрушение биомассы на модуле-сепараторе, отделение осадка центрифугированием при 10000 g 15 мин, центрифугирование полученного супернатанта при 50000 g 55 мин, обработку полученного осадка дистиллированной водой в том же объеме 3-4 раза и хроматографирование на колонке с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля, элюцию и отбор образцов с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5.