ШТАММ БАКТЕРИЙ HALOBACTERIUM SALINARUM - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОРОДОПСИНА Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается штамма-продуцента бактериородопсина для препарата "БИОС".

Известен препарат для стимуляции роста и развития растений на основе штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025, содержащий бактериородопсин, полученный путем выращивания штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 в течение 6 суток, после чего биомассу отделяют центрифугированием при 7000 g и инкубируют в дистиллированной воде, осадок отбрасывают, а полученный супернатант центрифугируют при 50000 g, супернатант отбрасывают, а к полученному осадку приливают дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендируют несколько раз до тех пор, пока в суспендируемом осадке не восстановится отношение оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5, далее супернатант стандартизуют до концентрации бактериородопсина в количестве от 10^-9 М до 10^-6 М [1].

Известен штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ B-9451 - продуцент бактериородопсина, выбранный нами в качестве прототипа, значительно превосходящий по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 [2].

Задача заявляемого изобретения - получить штамм Halobacterium salinarum с повышенным уровнем синтеза биомассы и бактериородопсина.

Задача решена путем получения штамма бактерий Halobacterium salinarum ST 2, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 и способного синтезировать бактериородопсин на 30% более, чем ВКПМ B-9451 при различных условиях культивирования. Заявляемый штамм получен путем многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 без предварительной обработки химическими реагентами.

Штамм ВКПМ В-10425 имеет следующие характеристики:

Культурально-морфологические признаки.

Величина клеток трехсуточной культуры 2-5 × 0,5-0,9 мкм, одиночные палочки. иногда объединены по 2-3 палочки.

Подвижен, максимум подвижности на 4 сутки роста. Спор не образует, газовых вакуолей не содержит.

Колонии полупрозрачные, гладкие с гладким краем, темно-красного цвета, в среду не врастают, легко снимаются петлей. Культура является экстремальным галофилом - требует присутствия в среде 25% NaCl. При содержании хлористого натрия ниже 20% клетки теряют свою окраску, а при попадании в среду с содержанием NaCl менее 15% клетки очень быстро лизируются.

Хорошо растет при 36-40°С, в солевой жидкой среде, имеющей состав, мас.%: пептон 1, дрожжевой экстракт 0,5, NaCl 25, MgSO₄ 2, KCl 0,2, цитрат натрия 0,3, глицерин 0,1, CaCl₂ 0,02, вода остальное, pH среды 7,2 - 7,4. а также солевой агаризованной среде, имеющей состав, мас.%.: пептон 1, дрожжевой экстракт 0,5, NaCl 25, MgSO₄ 2, KCl 0,2, цитрат натрия 0,3, CaCl₂ 0,02, агар 1,5, вода остальное, рН среды 7,2-7,4.

Отношение к температуре: хорошо растет при 36-40°С, оптимальная температура 38°С.

Отношение к pH среды: хорошо растет при 7,2-7,4, оптимум pH 7,3.

Физиолого-биохимические признаки

Факультативный аэроб, прототроф, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу не подкисляет, не растет на картофеле. Желатину не разжижает. Антагонистических свойств не обнаружено.

Как и все представители рода Halobacterium, заявляемый штамм непатогенен и может быть отнесен к группе безопасности № 1 (на основании заключения Коллекции АТСС). Работа с ним не требует специальных мер предосторожности.

Не является генетически модифицированным штаммом.

Хранение штамма: Хорошо хранится на агаризованной среде в бакпечатках и на косяках в условиях холодильника в течение года. Для длительного хранения штамма используется лиофилизация свежей биомассы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 при выращивании в колбах.

Заявляемый штамм ВКПМ В-10425, а также используемые в качестве контрольных штаммы ВКПМ В-9451 (прототип) и ВКПМ В-9025 (родительский штамм) выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 300 мл при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, «Osram», Germany) до стационарной стадии роста (6 суток) на круговой качалке при 37°С и встряхивании 100 об/мин. Для выращивания использовали среду следующего состава, мас.%: пептон 1, дрожжевой экстракт 0,5, NaCl 25, MgSO₄ 2, KCl 0,2, цитрат натрия 0,3, глицерин 0,1, СаС₂ 0,02, вода остальное. pH среды 7,2-7,4.

Осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и взвешивали полученную биомассу.

Затем к осадку приливали дистиллированную воду в количестве, равном объему среды выращивания, и инкубировали при встряхивании в условиях комнатной температуры в течение 3 часов.

Осадок отделяли центрифугированием, супернатант использовали для определения количества бактериородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:

C=D·M_r·V_p-ра·V_кюв/Е_бр·V_пробы,

Где

D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм;

M_r - молекулярная масса бактериородопсина (26700);

V_p-pa - общий объем раствора бактериородопсина;

V_кюв - объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете;

Е_бр - коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М^-1 см^-1);

V_пробы - объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете.

Полученные данные представлены в табл.1.

Таблица 1 Исследуемые штаммы. Вес биомассы (г/л) Концентрация бактериородопсина (мг/л) ВКПМВ-10425 20 62 ВКПМВ-9451 15 48 ВКПМВ-9025 8 20

Из приведенных в табл.1 результатов видно, что заявляемый штамм В-10425 превосходит родительский штамм ВКПМ В-9025 и прототип ВКПМ В-9451 как по количеству биомассы, так и по концентрации бактериородопсина в культуральной среде.

ПРИМЕР 2. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 при выращивании в ферментере.

Заявляемый штамм ВКПМ В-10425, контрольные штаммы ВКПМ В-9451 и ВКПМ В-9025 выращивали в ферментере BioFlo 110 (New Brunswick Scientific, USA), в объеме среды выращивания 10000 мл. В качестве среды выращивания использовали среду, как в примере 1. В ферментере поддерживали постоянную температуру 37°С, перемешивание: первые 24 часа 400 об/мин, на вторые сутки 600 об/мин, на 3 сутки 800 об/мин, на 7 сутки 1000 об/мин. Аэрация во время ферментации 0,5 л/л·мин. Исследуемые штаммы выращивали до стационарной стадии роста. Далее определяли вес биомассы и содержание бактериородопсина в среде выращивания, как в примере 1. Полученные данные представлены в табл.2.

Таблица 2 Исследуемые штаммы. Вес биомассы (г/л) Концентрация бактериородопсина (мг/л) ВКПМВ-10425 45 144 ВКПМВ-9451 30 100 ВКПМВ-9025 23 48

Как следует из результатов, приведенных в табл.1 и 2, заявляемый штамм ВКПМ В-10425 превосходит прототип ВКПМ B-9451 и родительский штамм ВКПМ В-9025 по количеству синтезируемых при различных условиях культивирования бактериородопсина и биомассы.

Источники информации

1. Патент РФ № 2370957.

2. Патент РФ № 2321627.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается штамма-продуцента бактериородопсина. Штамм Halobacterium salinarum ST 2 получен путем многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 без предварительной обработки химическими реагентами и депонирован в ВКПМ под номером В-10425. Штамм Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 превосходит по продуктивности (биомассы и бактериородопсина) как прототип, так и родительский штамм. 2 табл.

Штамм бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-10425 - продуцент бактериородопсина.