СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОРОДОПСИНА Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12P1/04 C07K14/215 

Область техники

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается получения белка, бактериородопсина, путем микробиологического синтеза.

Область возможного применения бактериородопсина поразительна по своему разнообразию. Она включает двухстороннюю голографическую память, ультрабыстрое оперативное запоминающее устройство, пространственную модуляцию света, нелинейные оптические фильтры, распознавательные системы, высококонтрастные дисплеи, оптические переключатели и пикосекундные детекторы. Бактериородопсин находит применение в производстве материалов, которые предохраняют ценные бумаги от подделок, а также в качестве антиоксиданта в медицине, фармацевтике, косметологии и сельском хозяйстве в качестве стимулятора роста растений [1-10].

Предшествующий уровень техники

Из уровня техники известен способ получения бактериородопсина путем выращивания штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 в течение 6 суток, после чего биомассу отделяют центрифугированием при 7000 g и инкубируют в дистиллированной воде, осадок отбрасывают, а полученный супернатант центрифугируют при 50000 g, супернатант отбрасывают, а к полученному осадку приливают дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендируют несколько раз до тех пор, пока в суспендируемом осадке не восстановится отношение оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5, далее супернатант стандартизуют до концентрации бактериородопсина от 10^-9 М до 10^-6 М [1]. Недостатком данного способа является относительно невысокий выход бактериородопсина.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности существенных признаков является способ получения препарата на основе биомассы бактерий Halobacterium salinarum, в котором штамм галофильных бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025 выращивают в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 300 мл при освещении люминесцентными лампами дневного света до стационарной стадии роста на круговой качалке при 37°C и встряхивании 100 об/мин. Через 6 суток осадок отделяют центрифугированием при 7000 g 10 мин и полученную биомассу взвешивают.

Затем к осадку (20 г) приливают дистиллированную воду в объеме 300 мл и инкубируют при перемешивании в условиях комнатной температуры в течение 16 часов. После центрифугирования при 7000 g в течение 10 мин полученный препарат стандартизуют по содержанию в надосадочной жидкости бактериородопсина - основного компонента клеточных мембран, количество которого определяют при длине волны 570 нм [2].

Недостатком данного способа является невысокий выход бактериородопсина.

Раскрытие изобретения

Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, - создание способа, позволяющего получить высокий выход бактериородопсина.

Технический результат, достигаемый при реализации заявленного изобретения, заключается в повышении выхода бактериородопсина.

Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения бактериородопсина включает выращивание в ферментере объемом 10 л в течение 6 суток штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953, отделение биомассы центрифугированием при 7000 g и ее разрушение при инкубации в дистиллированной воде в течение ночи и постоянном перемешивании, отделение осадка центрифугированием при 10000 g 15 мин, центрифугирование полученного супернатанта при 50000 g 55 мин, обработку полученного осадка дистиллированной водой в том же объеме 3-4 раза и хроматографирование на колонке с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля, элюцию и отбор образцов с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5.

Осуществление способа получения бактериородопсина поясняется следующим примером.

Пример 1

Штамм ВКПМ В-11953, а также используемый в качестве контроля штамм ВКПМ В-9025 (прототип) выращивали в ферментере BioFlo 110 (New Brunswick Scientific, USA) в объеме среды культивирования 10 л. Для выращивания использовали среду следующего состава (мас.%): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, KCl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, CaCl₂ - 0,02, вода - остальное, pH среды 7,2-7,4. В ферментере поддерживали температурный режим 36,8-37,2°C. Расход воздуха на аэрацию 2,5 дм³/мин. Исследуемые штаммы выращивали при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, «Osram», PRC) 6 суток.

По окончании ферментации, через 6 суток, отделение и разрушение биомассы проводили аналогично способу, описанному в [1], а именно осадок отделяют центрифугированием при 7000 g 10 мин и полученную биомассу взвешивают. Затем к осадку из расчета на 20 г приливают дистиллированную воду в объеме 300 мл и инкубируют при перемешивании в условиях комнатной температуры в течение 16 часов.

Осадок отделяли центрифугированием при 10000 g 15 мин и отбрасывали, а полученный супернатант центрифугировали при 50000 g 55 мин, супернатант отбрасывали, а к полученному осадку приливали дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендировали 3-4 раза, после чего проводили хроматографию на колонке с силикагелем, уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером pH 7,0. Осадок наносили на хроматографическую колонку с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля [11]. Элюцию проводили тем же буфером. В образец нанесения перед хроматографией добавляли 0,1 М фосфатный буфер pH 7,0 до конечной концентрации в образце 0,01 М.

После элюции отбирали образцы с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5.

Отношение оптических плотностей на длинах волн 280 и 570 не зависит от концентрации белка и служит критерием его чистоты. В зависимости от способа очистки, а также целей применения препарата это отношение должно быть в пределах 1,9-2,4 согласно источнику информации РОССИЙСКИЙ ХИМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ (Журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева), 2006, т. 1, №5, с. 25-36. Гребенников Е.П. «Бактериородопсин - биологический преобразователь световой энергии с уникальными технологическими возможностями».

В отобранных образцах определяли количество бактериородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:

где

D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм;

M_r - молекулярная масса бактериородопсина (26700);

V_p-pa - общий объем раствора бактериородопсина;

V_кюв - объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете;

Е_бр - коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М^-1см^-1);

V_пробы - объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Из приведенных в таблице 1 результатов видно, что заявляемый способ получения бактериородопсина с использования штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 дает более высокий уровень бактериородопсина по сравнению со способом, основанным на применении штамма бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Патент РФ N 2416634, опубликован 20.04.2011.

2. Патент РФ N 2307506, опубликован 10.10.2007.

3. Skladnev D., Tyurin S., Gricevich J. "Plant-growth-promoting effects of biomass lysate of selected agronomically important strain Halobacterium salinarum." Abst. XI International Congress PHYTOPHARM-2007 "Actual problems of creation of new medicinal preparations of natural origin" Leiden, The Netherlands, 2007. - P. 18.

4. Тюрин C.A., Складнев Д.А., Ходонов А.А. "Ретиналь бактериородопсина как иммобилизованный фитогормон. "Тезисы стендовых сообщений. III Российский симпозиум «Белки и пептиды». - Пущино. - 2007. - С. 94.

5. Tyurin S.A., Khodonov А.А., Skladnev D.A. «Unfolded bacteriorhodopsin become a phytohormone» Abstracts 3rd International Meeting "Molecular Simulation Studies in Material and Biological Sciences", September 10-12, JINR, Dubna, Russia, 2008. - P. 36, 37.

6. С.А. Тюрин, Ю.Г. Грицевич, Д.А. Складнев, А.А. Ходонов. "Бактериородопсин как стимулятор роста и развития растений". Агрохимия. - 2009. - №6. - С. 32-39.

7. Коротков А.В., Прусакова Л.Д., Фесенко А.Н., Грицевич Ю.Г., Тюрин С.А. "Способ выращивания гречихи". Объединенный научный журнал. - 2010. - №3. - С. 66-69.

8. Alexander KOROTKOV, Alexey FESENKO, Sergey TYURIN, Yuliy GRITSEVICH, Lidiya PRUSAKOVA. «Effect of Bacteriorhodopsin on the growth and development of buckwheat» Advances in buckwheat research. Proceedings of the 11th International Symposium on Buckwheat. Orel, Russia, 2010. P. 670-674.

9. А.В. Коротков, Л.Д. Прусакова, С.Л. Белопухов, А.Н. Фесенко, С.А. Тюрин, Ю.Г. Грицевич. "Влияние люрастима и бактериородопсина на урожай и качество зерна гречихи". Известия ТСХА, 2011 год, выпуск 1, с. 118-123.

10. Остерман Л.А. «Хроматография белков и нуклеиновых кислот». Москва, Издательство «Наука», 1985 год, с. 58-62.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в производстве физиологически активных соединений. Способ получения бактериородопсина предусматривает выращивание в ферментере в течение шести суток штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953 с последующим отделением биомассы центрифугированием и разрушением ее при инкубации в дистиллированной воде в течение ночи при постоянном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием с получением супернатанта. Полученный супернатант центрифугируют и отбрасывают. К полученному осадку приливают дистиллированную воду в том же объеме, осадок суспендируют в воде 3-4 раза. После чего осадок наносят на хроматографическую колонку с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля. После элюции отбирают образцы с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5. Изобретение позволяет повысить выход бактериородопсина. 1 табл., 1 пр.

Способ получения бактериородопсина, включающий выращивание в ферментере объемом 10 л в течение 6 суток штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-11953, отделение биомассы центрифугированием при 7000 g и ее разрушение при инкубации в дистиллированной воде в течение ночи и постоянном перемешивании, отделение осадка центрифугированием при 10000 g 15 мин, центрифугирование полученного супернатанта при 50000 g 55 мин, обработку полученного осадка дистиллированной водой в том же объеме 3-4 раза, хроматографирование на колонке с силикагелем из расчета 200 оптических единиц в образце нанесения при длине волны 280 нм на 100 мл силикагеля, элюцию и отбор образцов с отношением оптической плотности раствора при длине волны 280 нм к оптической плотности раствора при длине волны 570 нм (D₂₈₀/D₅₇₀) менее 2,5.