СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНЕЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ У ТЕЛЯТ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарии, касается метода ранней диагностики болезней органов дыхания у телят с целью принятия мер для повышения сохранности и продуктивности животных.

Болезни органов дыхания у телят широко распространены, они наносят большой экономический ущерб и снижают рентабельность животноводства. В отдельных хозяйствах гибель по их причине телят в совокупности с вынужденным убоем достигает 40-55%, а привесы и окупаемость корма у больных и переболевших животных снижаются в 2-3 раза. Болезни этой группы самые распространенные и способны снижать экономическую эффективность отрасли до 20-30% [Красочко П.А., Красочко И.А. Диагностика, профилактика и терапия респираторных желудочно-кишечных заболеваний молодняка // Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в жив-ве: Материалы науч.-практ. конф. - Минск, 1998. - С. 15-18. Особенности респираторных инфекций телят / В.А. Мищенко, А.А. Гусев, Н.А. Яременко [и др.] // Ветеринария. - 2000. - №9. - С. 5-6]. Отмеченное указывает на необходимость повышения эффективности диагностики, профилактики и терапии органов дыхания у телят.

Известно проведение ранней диагностики бронхопневмонии на основании результатов общих клинических исследований [Ленец И.А. Диагностика незаразных болезней животных с применением вычислительной техники. - М.: Агропромиздат, 1989. - 163 с.]. К такому способу диагностики можно отнести пальпацию первого трахеального кольца, при которой у животных с повышенной чувствительностью слизистой оболочки регистрируется кашель [Беляков И.М. Диагностика внутренних незаразных болезней сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1975. - 45 с.].

Недостатком данного способа является то, что повышенная чувствительность трахеи регистрируется при выраженном воспалительном процессе, что также проявляется другими симптомами трахеита и бронхита: жесткое везикулярное дыхание, хрипы, одышка и т.д.

С целью повышения информативности указанного выше теста предложена ранняя диагностика выявления трахеобронхита у новорожденных телят на основании проявления кашлевой реакции на пальпацию последнего трахеального кольца [RU №2175214 C1, A61B 5/08, 27.10.2001].

К числу недостатков данного подхода следует отнести то, что он отражает наличие воспалительного процесса в трахеи, но расценивается как диагностический прием при микробронхите и бронхите. Помимо этого воспаление слизистой оболочки трахеи - это уже проявление клинических признаков трахеита, что дает основание для использования его в качестве метода выявления ранних клинических симптомов, но не субклинической стадии патологии.

Известен способ ранней диагностики респираторных заболеваний животных, предусматривающий сравнительный анализ голоса здорового и больного животного, записанного на магнитную ленту [RU №2037316 C1, А61В 5/00, 19.06.1995]. По соотношению спектров звука делают вывод о функциональном состоянии животного, а по узким спектральным полосам и распределению в данных полосах интенсивности сигнала судят о конкретном виде заболевания.

Однако для данного способа требуется специальное оборудование. Во время записи голоса животных высока вероятность наличия фоновых акустических шумов и изменения спектрального состава голоса под действием факторов внешней среды (температура, влажность, запыленность и т.д.), что снижает информативность данного метода диагностики.

Для выявления скрытых патологий органов дыхания используют нагрузочные пробы. Так, известен способ выявления легочной недостаточности у животных, который заключается в применении дозированной физической нагрузки в течение 15 минут. У животных определяют частоту дыхательных движений в покое и после легкой пятнадцатиминутной прогонки, а затем данный показатель определяют до его нормализации. После прогона количество дыхательных движений восстанавливается у здоровых животных через 7-10 минут, а при дыхательной недостаточности - через 20-30 минут и более [Клиническая диагностика внутренних незаразных болезней сельскохозяйственных животных. - В.И. Зайцев и др. - 3-е издание, перераб. и доп. - М., 1971 - С. 135-136].

Недостатками данного способа являются его трудоемкость и затрата большого количества времени на проведение данного метода, а также влияние состояния сердечнососудистой системы и факторов внешней среды.

Известен способ выявления легочной недостаточности у телят, в котором функциональная нагрузка создается краткосрочным (30 сек) прекращением дыхания, с последующим расчетом индекса легочной недостаточности на основании разницы частоты дыхания [RU №2263467 С1, А61В 5/08, 10.11.2005].

Данный способ диагностики не позволяет в полной мере выявить легочную недостаточность, так как, контактируя с животным, происходит возбуждение его нервной системы, учащается дыхание, что повышает риск ложноположительных результатов.

Предложен способ ранней диагностики трахеобронхита у телят, основанный на внутривенном введении 0,6% раствора перекиси водорода в дозе 0,4 мл на кг массы тела [RU №2372051 С1, A61D 99/00, 10.11.2009]. В случае возникновения кашлевой реакции через 1-7 минут после введения диагностируют трахеобронхит. Авторы отмечают, что в основе данного теста лежит способность перекиси водорода вызывать у больных телят контрактацию трахеи и бронхов, которая проявляется кашлевым рефлексом. Данное явление, по их мнению, наблюдается при повышенном содержании продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Однако активация ПОЛ наблюдается при большом количестве болезней, поэтому высока вероятность получения положительного результата данного теста не только при патологии органов дыхания, но и при других заболеваниях. Так, в медицине имеется способ диагностики легочной гипертензии, предложенный Е.Ф. Онищенко и Н.В. Крашенинниковой. Способ также основан на внутривенном введении 0,3% раствора перекиси водорода и направлен на выявление пороков сердца и заболеваний легких [RU №2103910 C1, A61B 5/02, 10.02.1998]. Помимо этого следует отметить, что введение перекиси водорода больным с повышенным уровнем ПОЛ может привести к ухудшению состояния больного по причине резкого увеличения количества активных форм кислорода и последующего разрушения мембран, а также контрактации бронхов, которая вызывает усиление дыхательной недостаточности. Поэтому данный тест является небезопасным.

В качестве прототипа выбран способ прогнозирования респираторных болезней у телят в течение 24 часов после рождения по уровню соотношения содержания в сыворотке крови кальция и магния. При снижении соотношения меньше 3,5:1 прогнозируют развитие респираторных болезней [RU №2491550 C1, G01N 33/49, 27.08.2013].

Соотношение содержания в сыворотке крови кальция и магния отражает состояние метаболизма мышечных клеток у новорожденных, и его снижение указывает на наличие мышечной дистонии, являющейся следствием нарушения антенатального развития или интранатальной асфиксии. При этом снижается резистентность новорожденного и возрастает риск развития заболеваний, поэтому соотношение кальция и магния является прогностическим показателей, но не тестом диагностики болезней органов дыхания.

Технический результат изобретения - создание эффективного способа ранней диагностики болезней органов дыхания у телят, являющегося информативным и точным.

Технический результат достигается тем, что в способе ранней диагностики болезней органов дыхания у телят, включающем отбор проб крови у телят, согласно изобретению у телят в возрасте от 20 суток до 8 месяцев определяют уровень мочевинного гемолиза эритроцитов до и после внесения модификаторов адреналина и адреноблокатора в пробы крови, а затем рассчитывают коэффициент модификации мембран по формуле КМА=Е_ав/Е_бл-ав, где Е_ав - экстинция пробы на длине волны 541 нм с адреналином; Е_бл-ав - экстинция пробы на длине волны 541 нм, в которую вначале внесли блокатор, а затем - активное вещество, при этом КМА у здоровых телят находится в пределах от 0,98 до 1,2, и в случае превышения уровня 1,2 диагностируют начальную стадию болезни органов дыхания.

Коэффициент модификации мембран адреналином (КМА) отражает состояние бета-адренорецепторов на мембранах эритроцитов. Адренорецепторы - это белковые структуры, расположенные на мембранах клеток, которые распознают и связывают адреналин, норадреналин и их синтетические аналоги. Они присутствуют во всех органах, тканях и клетках организма, отражают состояние симпатического отдела вегетативной нервной системы, участвуют в регуляции обмена веществ и функций всех органов и систем организма. В зависимости от вызываемых эффектов, локализации и чувствительности к фармакологическим препаратам различают альфа- и бета-адренорецепторы. От состояния бета-адренорецепторов зависит частота сердечных сокращений и сократимость миокарда, вазодилатация, тонус бронхов и активность липолиза. Эта группа рецепторов сопряжена с аденилатциклазой, катализирующей превращение АТФ в цАМФ [Шишкина Г.Т., Дыгало Н.Н. Молекулярная физиология адренергических рецепторов // Усп. физиол. наук. - 1997.- Т.28. - №1.- С. 61-74]. Состояние адренорецепторов часто оценивают на основании результатов исследования мембранно-рецепторных комплексов эритроцитов.

Вторичные нарушения симпатического отдела вегетативной нервной системы наблюдаются при многих патологиях, однако наиболее выраженные изменения бета-адренорецепторов преимущественно отмечаются при патологиях сердечнососудистой системы и органов дыхания. Развитие бронхолегочных болезней начинается с повреждения покровного эпителия и активизации клеток воспаления, что приводит к дисбалансу рецепторов бронхов. Наряду с этим, нарушаются регулирующие механизмы на организменном уровне, в основе которых лежит глюкокортикоидная недостаточность и обусловленное ею изменение чувствительности бета-адренорецепторов [Holloway J.W., Dunbar P.R., Riley G.A. et al. Association of beta2-adrenergic receptor polymorphisms with severe asthma // Din. Exp.Allergy - 2000. - V.30(8) - P. 1097-1200; Хроническая обструктивная болезнь легких / Под ред. А.Г. Чучалина. - М.: ЗАО Изд-во БИНОМ; СПб.: Невский диалект, 1998. - 512 с].

Таким образом, теоретическим обоснованием предлагаемого способа диагностики является наличие в патогенезе большинства бронхолегочных болезней изменений состояния бета-адренорецепторов на мембранах клеток-мишеней, в том числе и эритроцитах.

Способ осуществляют следующим образом. У телят берут пробы крови и количественно определяют степень мочевинного гемолиза эритроцитов в интактных пробах и после внесения модификаторов (адреналин и адреноблокатор) в соответствии с авторской методикой [Алехин Ю.Н. Методы диагностики перинатальной патологии у крупного рогатого скота: методическое пособие. - Воронеж, 2013. - 25 с.]. Для этого вначале готовят реактивы: 1. Раствор адреналина гидрохлорида (4 мг на 100 мл дистиллированной воды); 2. Раствор пропранолола гидрохлорида (2,5 мг на 100 мл дистиллированной воды); 3. Рабочий раствор мочевины (1,4 г мочевины, 0,213 г NaCl и до 100 мл дистиллированной воды); 4. Контрольный раствор мочевины (1,8 г и до 100 мл дистиллированной воды); 5. Физиологический раствор натрия хлорида. Из специального оборудования требуются фотоэлектроколориметр и термостат (20°C). Цельную стабилизированную (гепарин) кровь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Удаляют надосадочную жидкость. К осадку добавляют равное количество физиологического раствора натрия хлорида, перемешивают, центрифугируют (3000 об/мин, 5 минут) и удаляют надосадочную жидкость. К осадку добавляют равное количество физиологического раствора натрия хлорида и перемешивают (взвесь эритроцитов). Содержимое пробирок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут. Экстинцию надосадочной жидкости определяют при длине волны 541 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против дистиллированной воды. КМА, отражающий баланс соотношения эффекта антагониста и агониста, вычисляют по формуле: КМА=Е_ав/Е_бл-ав, где Е_ав - экстинция пробы с адреналином; Е_бл-ав - экстинция пробы, в которую вначале внесли блокатор, а затем - активное вещество. У здоровых телят КМА=0,98-1,2.

Сущность способа поясняется примерами.

Пример 1. Определение состояния бета-адренорецепторов эритроцитов при болезнях органов дыхания у телят

Проведены исследования клинического статуса и состояния бета-адренорецепторов на мембранах эритроцитов у телят на разных стадиях экспериментальной патологии органов дыхания.

Объектом исследования были клинически здоровые телята в возрасте 2,5-3 месяца, которые содержались в типовом помещении с оптимальными условиями микроклимата (температура воздуха 18,7±0,6°C, относительная влажность 61,0±1,5%). Были сформированы две группы по 30 голов в каждой. Контрольная группа в течение всего опыта находилась в помещении с оптимальными параметрами микроклимата. Телята из опытной группы утром (4 часа) первого дня опыта были переведены в экспериментальное помещение с выраженными нарушениями параметров микроклимата: температура воздуха +5…+8°C, относительная влажность 90-93%, сквозняки. Все задействованные в опыте животные находились под постоянным наблюдением до появления клинических признаков поражения органов дыхания. Они подвергались комплексному обследованию, включающему в себя отбор проб крови и назальной слизи для анализа (5⁰⁰ и 18⁰⁰), а также исследование с использованием клинических и инструментальных методов (5³⁰, 12⁰⁰ и 18³⁰). Показатели соотношения фаз дыхания - выдох/вдох (СФД), дыхательного объема (ДО) и минутного объема дыхания (МОД) определяли с помощью спирометра «MicroRind» (Micro Medical, Великобритания). Биохимические исследования проводили на анализаторе «Hitachi-902» и с использованием диагностических наборов. Оценку состояния мембрано-рецепторных комплексов эритроцитов и расчет коэффициента модификации мембран адреналином (КМА) проводили по авторской методике Алехина Ю.Н., принцип которой заключается в количественном определении степени мочевинного гемолиза эритроцитов в интактных пробах и после внесения модификаторов (адреналин и адреноблокатор). Результаты приведены в таблице 1.

Таблица №1 Порядок проведения исследования Реактивы № пробирки   1 - экстинция пробы, в которую вначале внесли блокатор, а затем - активное вещество 2 - экстинция пробы с адреналином Взвесь эритроцитов, мл 0,1   Пропранолол, 0,0025% раствор, мл 1,0   Водяная баня, 20°C, 5 минут     Взвесь эритроцитов, мл   0,1 Натрия хлорида, 0,9% раствор, мл   1,0 Адреналин, 0,004% раствор, мл 1,0 1,0 Водяная баня, 20°C, 5 минут     Рабочий раствор: в 100 мл дистиллированной воды 1,4 г мочевины и 0,213 натрия хлорида, мл 3,0 3,0 Перемешать и оставить при комнатной температуре на 30 минут Содержимое пробирок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут Надосадочную жидкость фотометрируют в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 541 нм против дистиллированной воды Расчет коэффициент модификации мембран адреналином (КМА): КМА=Е2/Е1, где Е1 - экстинкция надосадочной жидкости в пробирке №1; Е2 - экстинкция надосадочной жидкости в пробирке №2

На протяжении всего опыта у телят, находившихся в помещении с оптимальными параметрами микроклимата, не отмечалось каких-либо изменений состояния здоровья. Показатель КМА находился в пределах от 0,98 до 1,20. У телят, находившихся в неблагоприятных условиях существования (таблицы 2 и 3), частота дыхательных движений (ЧДД) в течение всего опыта имела тенденцию к увеличению, а дыхательный объем и минутный объем дыхания - к уменьшению, однако достоверные изменения этих показателей были отмечены только на 4 день. Помимо этого в этот день было отмечено увеличение на 7,7% длительности выдоха (СФД), а при аускультации грудной клетки фиксировали усиление везикулярного дыхания в области первых трех межреберных промежутков в средней трети груди.

Таблица 2 Клинико-биохимические показатели Показатели Дни наблюдения 1 2 3 4 ЧДД/мин 25,0±1,50 26,8±1,03 27,0±0,56 29,2±0,50³ СФД 1,17±0,011 1,15±0,010 1,17±0,010 1,26±0,004³ ОД, мл 543,8±9,7 530,0±8,5 538,8±4,2 527,0±5,1¹ МОД, л 13,8±0,40 14,3±0,42 14,5±0,22 15,0±0,20² Темп. тела, °C 38,9±0,17 39,0±0,12 38,8±0,15 38,7±0,15 Общий белок, г/л 70,5±1,16 70,8±0,88 71,2±0,82 71,5±0,69 Мочевина, мМ/л 4,8±0,37 4,3±0,21 4,8±0,27 5,3±0,29 ЩФ, нМ/(с.л) 388,0±15,0 397,0±18,1 407,2±18,1 410,0±17,7 АлАт, нМ/(с.л) 120,6±9,03 122,1±7,38 137,0±11,8 140,0±11,5 АсАт, нМ/(с.л) 154,4±6,02 152,0±4,40 169,8±3,91 166,2±5,30 Коэф. ДеРитис 1,29±0,012 1,26±0,020 1,24±0,020 1,18±0,023 Глюкоза, мМ/л 4,2±0,17 4,4±0,20 5,1±0,153 4,8±0,18 Пируват, мкМ/л 127,3±4,0 103,0±3,71 110,0±4,22 107,5±4,22 Лактат, мМ/л 1,35±0,02 1,43±0,011 1,40±0,012 1,9±0,023 Л/П 10,7±0,52 13,9±0,37 12,6±0,38 17,4±0,38 Холестерин, мМ/л 2,8±0,13 2,3±0,091 2,0±0,203 2,0±0,172 Креатинин, мМ/л 0,062±0,0030 0,062±0,003 0,063±0,0012 0,065±0,0010 Примечание: «1» - достоверные различия с предыдущим показателем, «2» - достоверные различия с показателями первого дня наблюдения, «3» - достоверные различия с предыдущим и исходным показателями.

Таблица 3 Показатели аутоинтоксикации и коэффициента модификации мембран в присутствии адреналина с адреноблокатором Длительность опыта, ч КМА ССМ ССЭ 0 1,00±0,011 0,28±0,003 30,0±0,85 4 1,18±0,008³ 0,27±0,003 28,7±0,98 8 1,24±0,011² 0,30±0,005 29,3±1,07 12 1,38±0,010³ 0,30±0,005 30,4±1,08 24 1,45±0,011³ 0,34±0,02³ 32,0±1,11 48 1,44±0,009² 0,36±0,011² 34,4±1,51² 72 1,22±0,012³ 0,41±0,013³ 37,0±1,35³ 96 1,02±0,005¹ 0,41±0,032² 39,3±1,30²

Результаты пальпации колец трахеи и перкуссии в области проекции легких были без патологических изменений. У трех телят (10%) появилась экспираторная одышка, а у двадцати одного животного (70,0%) - скудное истечение из носа серозного экссудата и умеренная гиперемия сосудов стенки носовой полости.

На 3 день опыта, т.е. за день до визуализации болезни отмечены достоверные изменения АсАТ, глюкозы, холестерина, пировиноградной и молочной кислоты. Хотя отклонение двух последних показателей было отмечено еще на вторые сутки. Однако наиболее ранние изменения были отмечены со стороны маркеров состояния адренорецепторов (КМА) и аутоинтоксикации. Содержание средних молекул (ССМ) превышало исходный уровень на 21,4% через 24 часа, а сорбционная способность эритроцитов (ССЭ) на 14,7% через 48 часов. В дальнейшем сохранялась постоянная тенденция к повышению этих показателей. КМА уже через 4 часа увеличился на 18,0%, а через 12, 24 и 48 часов превышал уровень в начале опыта на 38,0-45,0%.

Заключение. В результате воздействия неблагоприятных факторов внешней среды на 4-й день у большинства животных появился комплекс симптомов, позволяющий диагностировать ринит и трахеобронхит. Однако визуализации болезни предшествовали изменения состояния ряда биохимических показателей. Первыми происходили изменения состояния бета-адренорецепторов на мембранах эритроцитов, количество или число которых возрастало в течение двух суток воздействия неблагоприятных факторов, но затем наблюдалось их снижение, что уже происходило в сочетании с отклонением большинства показателей внешнего дыхания и состава крови.

Таким образом, изменения чувствительности или количества адренорецепторов относятся к числу наиболее ранних признаков развития болезней органов дыхания.

Пример 2. Определение прогностической и диагностической информативности показателей состояния бета-адренорецепторов эритроцитов при болезнях органов дыхания у телят.

Для определения информативности разработанного способа проведены исследования по изучению влияния уровня коэффициента модификации мембран (КМА) эритроцитов телят на уровень их заболеваемости респираторными болезнями. В условиях специализированного хозяйства по производству говядины во время комплектации на 14-й день после закупки, телята в возрасте 2-3 месяца, подвергались клиническому обследованию. У клинически здоровых животных отбирали пробы крови, в которых определяли состояние бета-адренорецепторов на мембранах эритроцитов. На основании полученных результатов были сформированы две опытные группы: №1 (n=180) телята у которых КМА находился в пределах 0,98-1,2 и №2 (n=207) КМА более 1,2. В течение 30 дней животные находились под клиническим наблюдением, результаты которого представлены в таблице 4.

Из данных таблицы 4 видно, что в группе №1 заболело 6,1% животных, при этом болезнь проявлялась на заключительном этапе опыта, что дает основание предположить возникновение и развитие патологии уже в условиях хозяйства. Заболеваемость в группе №2 составила 70,0%, визуализация болезни наблюдалась в период с 8 по 16 день опыта. В данном случае большинство телят первых дней комплектации, вероятно, находились на преморбидной стадии патологии.

Таблица 4 Уровень заболеваемости респираторными болезнями телят с разным уровнем КМА Показатели Группа № 1 2 Всего, гол. 180 207 В течение опыта: Клинически здоровые 169 62 Заболели, гол., всего 11 145 в т.ч. в течение 0-3 сут 0 0 4-7 сут 0 1 8-12 сут 0 37 13-16 сут 0 105 17-20 сут 1 2 21-24 сут 3 0 25-30 сут 7 0

Степень связи определяемого показателя с заболеваемостью животных оценивали на основании показателя достоверности связи по критерию χ² [Хамитов Г.П., Ведерникова Т.И. Вероятности и статистика. Иркутск: БГУЭП, 2006. - 272 с.]. Полученные при этом результаты (табл.4) показали, что χ²=160,92; коэффициент корреляции (r) - 0,65; коэффициент детерминации (r_d) - 0,42, Р<0,001. Это указывает на то, что между уровнем КМА у телят и заболеваемостью их респираторными болезнями имеется достоверная корреляционная связь средней степени выраженности. Доля влияния увеличения КМА (выше 1,20) на заболеваемость составляет 42%, что позволяет расценивать его как достоверный показатель ранней диагностики с высоким уровнем прогностического значения.

Таким образом, новый способ ранней диагностики болезней органов дыхания у телят характеризуется сравнительно высокой информативностью и прогностическим значением. Его применение позволит выявлять животных на ранних стадиях болезни, что будет основанием для проведения превентивной терапии, которая является более эффективной и экономически менее затратной.

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для ранней диагностики болезней органов дыхания у телят. Способ включает отбор проб крови у телят. У телят в возрасте от 20 суток до 8 месяцев определяют уровень мочевинного гемолиза эритроцитов до и после внесения модификаторов адреналина и адреноблокатора в пробы крови. Затем рассчитывают коэффициент модификации мембран по формуле КМА=Е_ав/Е_бл-ав, где Е_ав - экстинция пробы на длине волны 541 нм с адреналином; Е_бл-ав - экстинция пробы на длине волны 541 нм, в которую вначале внесли блокатор, а затем - активное вещество. При этом КМА у здоровых телят находится в пределах от 0,98 до 1,2, и в случае превышения уровня 1,2 диагностируют начальную стадию болезни органов дыхания. Заявленное изобретение позволяет быстро и точно диагностировать болезни органов дыхания у телят. 4 табл., 2 пр.

Способ ранней диагностики болезней органов дыхания у телят, включающий отбор проб крови у телят, отличающийся тем, что у телят в возрасте от 20 суток до 8 месяцев определяют уровень мочевинного гемолиза эритроцитов до и после внесения модификаторов адреналина и адреноблокатора в пробы крови, а затем рассчитывают коэффициент модификации мембран по формуле КМА=Е_ав/Е_бл-ав, где Е_ав - экстинция пробы на длине волны 541 нм с адреналином; Е_бл-ав - экстинция пробы на длине волны 541 нм, в которую вначале внесли блокатор, а затем - активное вещество, при этом КМА у здоровых телят находится в пределах от 0,98 до 1,2, и в случае превышения уровня 1,2 диагностируют начальную стадию болезни органов дыхания.