Способ отбора проб бронхоальвеолярного лаважа для прижизненной диагностики бронхопневмонии у телят Российский патент 2024 года по МПК A61B5/00 A61M3/00 A61M25/01 A61K33/14 A61P43/00 

Область техники

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при проведении прижизненной диагностики бронхопневмонии у телят путем изоляции микроорганизмов-инициаторов гнойно-воспалительного процесса из проб бронхоальвеолярного содержимого, отобранного в области бифуркации трахеи.

Уровень техники

Среди высокопродуктивных животных широко распространены болезни органов дыхания, которые диагностируются чаще всего у молодняка. Эти болезни приводят к значительным экономическим убыткам, которые складываются из гибели животных, недополучения продукции от больных или переболевших, замедлением их роста и развития, стрессов, затрат на лечение и профилактику [1]. В этой связи совершенствование прижизненной диагностики бронхопневмонии у телят путем определения микробиоценозов из бронхоальвеолярного содержимого, отобранного из нижних дыхательных путей больных животных, является вопросом первостепенной важности, который требует своевременного и грамотного решения.

Из уровня техники известен способ выявления легочной недостаточности у телят, при котором в качестве функциональной нагрузки используют прекращение дыхания на 30 секунд, после чего определяют индекс легочной недостаточности [2]. Указанный способ позволяет определить наличие легочной недостаточности у телят. Недостатком является то, что при его проведении невозможно определить причину возникновения респираторной патологии и, как следствие, назначить адекватное лечение.

Общеизвестен способ ранней диагностики трахеобронхита у новорожденных телят путем пальпации последнего трахеального кольца. При наличии воспалительного процесса в области трахеи и бронхов у больного теленка возникает кашель и повышение общей двигательной реакции [3].

Известен также способ ранней диагностики трахеобронхита у телят, при котором внутривенно вводят 0,6% раствор перекиси водорода на 0,9% растворе хлорида натрия в дозе 0,4 мл на кг массы тела. В случае возникновения кашлевой реакции через 1-7 минут после введения диагностируют трахеобронхит [4]. Недостатками описанных способов является то, что диагностировать наличие трахеобронхита можно по проявлению клинических признаков у животных и без дополнительной функциональной нагрузки. Кроме этого, определение предварительного диагноза не дает отчетливой картины о возбудителях-инициаторах инфекционного процесса в трахее и бронхах, и не позволяет назначить своевременную антибактериальную терапию.

Из уровня техники известен способ ранней диагностики болезней органов дыхания у телят, включающий отбор проб крови у телят в возрасте от 20 суток до 8 месяцев для определения уровня мочевинного гемолиза эритроцитов до и после внесения модификаторов адреналина и адреноблокатора в пробы крови. При этом рассчитывают коэффициент модификации мембран, и в случае превышения критического уровня диагностируют начальную стадию болезни органов дыхания [5]. Обнародован также способ прогнозирования развития респираторных болезней у новорожденных телят, включающий взятие крови у телят в течение 24 ч после рождения, определение в сыворотке крови содержания кальция и магния, расчета кальций-магниевого соотношения, и в случае значений кальций-магниевого соотношения в сыворотке крови меньших, чем 3,50:1, у телят прогнозируют развитие респираторных болезней [6]. Однако на животноводческих фермах заболевания респираторного тракта широко распространены, при этом одновременно заболевает достаточно большое поголовье. В этой связи у всех больных животных необходимо отобрать венозную кровь и провести материально затратные исследования в условиях специализированной лаборатории. Поэтому описанные способы весьма трудоемки. К числу их недостатков также следует отнести, что полученные результаты лишь укажут на наличие болезней органов дыхания, а не на характеристику их возбудителей. Это не даст, необходимой для назначения адекватной терапии, информации.

В качестве прототипа выбран известный способ отбора биомаркеров назального микробиома для прогнозирования начала респираторных заболеваний крупного рогатого скота и их лечения [7]. При указанном способе для выявления причин развития и прогнозирования возникновения респираторных заболеваний у крупного рогатого скота проводят взятие мазка из носового отверстия у коровы для измерения с помощью ПЦР-анализа уровня, по крайней мере одного биомаркера из приведенных антигенов: Fusobacterium mortiferum, Prevotella stercorea, Bacteroides vulgatus, Prevotella oris, Clostridium saudiense, Lactobacillus plantarum, Bacteroides uniformis, [Clostridium] clostridioforme, Lactobacillus mucosae, Gemmiger formicilis, Prevotella copri, Terrisporobacter petrolearius, Blautia obeum, [Clostridium] scindens, Lactobacillus caviae, Ruminococcus lactaris, Catenibacterium mitsuokai, Kineothrix alysoides, Streptococcus pasteurianus, Clostridium butyricum, Lactobacillus gasseri, Holdemanella biformis, Faecalibacterium prausnitzii, Ruminococcus faecis, Fusicatenibacter saccharivorans, [Eubacterium] eligens, Butyricicoccus pullicaecorum, Blautia wexlerae, Ruminiclostridium cellobioparum, Massihprevotella massiliensis, и Prevotellamassilia timonensis. В дальнейшем проводят анализ результата для определения стоит ли лечить животное. При этом считают, что корова инфицирована и ее следует лечить, если обнаруживают одно или более из приведенных ниже различий в содержании пробы, относительно содержания у здоровой коровы: снижение уровня Fusobacterium mortiferum, снижение количества Prevotella stercorea, снижение количества Bacteroides vulgatus, снижение количества Prevotella oris, снижение или увеличение количества Clostridium saudiense (где снижение указывает на то, что корова, вероятно, заболеет респираторной патологией, а увеличение указывает на то, что у коровы уже развивается заболевание), увеличение Lactobacillus plantarum, снижение Bacteroides uniformis, снижение {Clostridium] clostridioforme, снижение или увеличение Lactobacillus mucosae (где снижение указывает на то, что корова уже болеет, а увеличение указывает на то, что у коровы, вероятно, возникнет респираторное заболевание), снижение Gemmiger formicilis, снижение Prevotella copri, снижение Terrisporobacter petrolearius, увеличение Blautia obeum, снижение [Clostridium] scindens, увеличение Lactobacillus caviae, увеличение Ruminococcus lactaris, уменьшение или увеличение Catenibacterium mitsuokai (где снижение указывает на то, что корова больна, а увеличение указывает на то, что у коровы, вероятно, возникнет респираторная патология), увеличение Kineothrix alysoides, увеличение Streptococcus pasteurianus, увеличение Clostridium butyricum, снижение Lactobacillus gasseri, снижение Holdemanella biformis, снижение Faecalibacterium prausnitzii, снижение Ruminococcus faecis, снижение Fusicatenibacter saccharivorans, снижение [Eubacterium] eligens, снижение Butyricicoccus pullicaecorum, снижение Blautia wexlerae, увеличение количества Ruminiclostridium cellobioparum, уменьшение Massiliprevotella massiliensis или уменьшение Prevotellamassilia timonensis.

Однако по данным отечественных исследователей и нашим данным развитие бронхопневмонии у телят в животноводческих хозяйствах Российской Федерации обусловлено совершенно иным спектром микроорганизмов. К тому же необходимо учитывать, что метод ПЦР-диагностики, основанный на определении указанных биомаркеров всего поголовья достаточно дорог и экономически неэффективен. Недостатком данного способа также является то, что при проведении ПЦР-анализа биомаркеров, отобранных из мазков носовой полости, возможно определить лишь микробный пейзаж носовой полости, а не возбудителей-инициаторов, обусловивших развитие гнойно-воспалительного процесса в области нижних дыхательных путей.

Целью исследования является проведение прижизненной малоинвазивной диагностики телят с острой катаральной бронхопневмонией при помощи отбора проб бронхоальвеолярного лаважа в области бифуркации трахеи и детального изучения микробиоценозов из отобранного содержимого.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка нового безопасного способа отбора проб бронхоальвеолярного лаважа для прижизненной диагностики бронхопневмонии у телят путем изоляции микроорганизмов-инициаторов гнойно-воспалительного процесса из проб, отобранных в области бифуркации трахеи.

При достижении технического результата от больных телят из проб, отобранных в области нижних дыхательных путей изолированы ассоциации возбудителей бронхопневмонии, проведена их видовая и серологическая идентификация, изучены патогенные свойства. Способ прижизненной диагностики бронхопневмонии у телят может быть использован при проведении комплекса диагностических исследований при патологиях респираторного тракта.

Материалом для исследования служили телята в возрасте 1-3 месяца, больные острой катаральной бронхопневмонией (n=37). Животные, которых лечили в течение 14 дней до отбора проб, были исключены из исследования.

Изобретение осуществляется следующим способом.

От больных телят патологическое бронхоальвеолярное содержимое отбирается с помощью стерильных силиконовых медицинских трубок, диаметром 4 мм, внутренним диаметром отверстия - 3 мм, толщиной стенки 1,0 мм и длиной 150 см, в стерильные пробирки.

Перед отбором проб бронхоальвеолярного содержимого руки исследователя и обе ноздри больных телят обрабатывают 70° этиловым спиртом. Отбор проб осуществляет один и тот же ветеринарный специалист без проведения седации больных животных.

Животное фиксируют в положении стоя, в фиксационном станке. Помощник, держа теленка за носовую перегородку и нижнюю челюсть максимально вытягивает голову и шею животного краниально для того, чтобы силиконовая трубка могла беспрепятственно попасть в трахею во время фазы вдоха дыхательного цикла. При этом силиконовую трубку аккуратно продвигают через гортань и трахею до достижения бифуркации.

Если силиконовый зонд при попытке продвижения к трахее случайно попадает в пищевод, его незамедлительно удаляют и используют новый стерилизованный инструмент, во избежание контаминации пробы.

Назогастральную трубку продвигают трансназально до тех пор, пока не возникает незначительного сопротивления. Показателем достижения области бифуркации трахеи служит повторяющийся кашлевой рефлекс. По достижении области бифуркации трахеи, назогастральный зонд отодвигают назад на 1 см, присоединяют к свободному концу одноразовый шприц, объемом 50 мл и с его помощью в трахею вводят 30-40 мл стерильного изотонического физиологического раствора температурой 37°С, а затем сразу же аспирируют до 10 мл бронхоальвеолярного содержимого. Отобранная описанным способом проба бронхоальвеолярного содержимого в течении трех часов доставляется в лабораторию для проведения бактериологических исследований.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-26-00091, https://rscf.ru/project/24-26-00091/.

Возможность проведения прижизненной диагностики телят с бронхопневмонией при помощи отбора проб в области бифуркации трахеи и детального изучения микробиоценозов из отобранного содержимого, подтверждается представленными примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Изучение видового спектра микроорганизмов, изолированных из проб бронхоальвеолярного содержимого

При проведении бактериологических исследований 37 проб бронхоальвеолярного содержимого, отобранного представленным способом от телят с признаками острой катаральной бронхопневмонии изолировано 115 микроорганизмов 13 видов, отнесенных к девяти родам. Чаще всего при бронхопневмонии телят из патологического материала изолировали Staphylococcus aureus и Mannheimia haemolytica по 18 (15,6%) штаммов, Escherichia coli - 15 (13,1%) штаммов, Pasteurella multocida и Klebsiella pneumoniae no 11 (9,6%) штаммов, а также Streptococcus pyogenes и Klebsiella ozaenae no 7 (6,1%) штаммов, от общего их количества. Реже выделяли Streptococcus uberis, Trueperella pyogenes и Pseudomonas aeruginosa no 6 (5,2%) культур, соответственно; Streptococcus faecalis - 4 (3,5%); Staphylococcus intermedius и Proteus mirabilis no 3 (2,6%) штамма. Большинство изолятов - 71 (61,7%) при проведении окраски по Грамму отнесены к грамотрицательным, а 44 (38,3%) выделенных из бронхотрахеальной слизи телят бактерий - к грамположительной микрофлоре.

Пример 2. Проведение серологической типизации изолированных из проб бронхоальвеолярного лаважа культур Escherichia coli

Изоляты культур кишечных палочек, изолированных из проб бронхоальвеолярного содержимого представлены пятью серотипами. Чаще регистрировали O8 - 5 (33,3%), O26 - 4 (26,7%) и O111 - 3 (20,0%) серотипы от общего количества штаммов. Значительно реже идентифицировали O127 и О119 серотипы Escherichia coli - 2 (13,3%) и 1 (6,7%), соответственно. Необходимо также отметить, что одиннадцать изолированных культур Escherichia coli проявляли гемолизин-продуцирующую активность.

Пример 3. Определение патогенности у изолированных из проб бронхоальвеолярного содержимого штаммов микроорганизмов

Из 115 штаммов микроорганизмов-инициаторов бронхопневмонии у телят патогенными свойствами обладали большинство - 75 (65,2%) культур. При этом чаще всего вызывали гибель белых мышей при их внутрибрюшинном введении представители родов Mannheimia sp.p.- 18 (24,0%), Staphylococcus sp.p.- 15 (20,0%), Pasteurella sp.p и Escherichia sp.p.no 11 (14,7%), соответственно, от общего количества патогенных микроорганизмов. Значительно реже патогенными свойствами обладали представители родов Klebsiella sp.p.-9 (12,0%) штаммов, Streptococcus sp.p.-7 (9,3%) культур и Pseudomonas sp.p.- 4 (5,3%) изолята.

Пример 4. Характеристика микробных ассоциаций, изолированных из проб бронхоальвеолярного лаважа при острой катаральной бронхопневмонии у телят

Чаще всего развитие острой катаральной бронхопневмонии у телят обусловлено ассоциациями условно-патогенных микроорганизмов, в состав которых входит от 2 до 5 патогенов. При этом чаще из бронхоальвеолярных проб изолировали ассоциации, в состав которых входило три сочлена - 21 (56,8%) и два сочлена - 8 (21,6%). Значительно реже выделяли четырехкомпонентные и пятикомпонентные ассоциации микроорганизмов - по 4 (10,8%) случая, соответственно. Установлено, что во всех пятикомпонентных ассоциациях основным патогеном всегда выступал штамм Mannheimia haemolytica: Mannheimia haemolytica+Pasteurella multocida+ Pseudomonas aeruginosa+Staphylococcus aureus+Streptococcus uberis; Mannheimia haemolytica+Pasteurella multocida+Klebsiella pneumoniae+Staphylococcus aureus+Streptococcus pyogenes; Mannheimia haemolytica+Pseudomonas aeruginosa+Escherichia coli O26+Klebsiella ozaenae+Staphylococcus aureus и Mannheimia haemolytica+Proteus mirabilis+Escherichia coli O26+Staphylococcus aureus+Streptococcus pyogenes. Кроме этого, Mannheimia haemolytica был сочленом большинства - 75,0% четырехкомпонентных ассоциаций. Следует также отметить, что лишь две ассоциации были представлены грамположительной микрофлорой, а именно двухкомпонентная Staphylococcus aureus+Streptococcus uberis и трехкомпонентная Staphylococcus aureus+Streptococcus faecalis+Streptococcus pyogenes.

Список литературы

1. Effectiveness of hypericum perforatum L. Phytosorbent as a part of complex therapy for acute non-specific bronchopneumonia / Y. Vatnikov, I. Donnik, E. Kulikov [et al.] // International Journal of Pharmaceutical Research. 2020; 12(Suppl. 1): 1108-1116. doi: 10.31838/ijpr/2020.SP1.165

2. Патент RU № 2263467 C1, МПК A 61 В 5/08. Способ выявления легочной недостаточности у телят / А.И. Золотарев, СМ. Сулейманов, опубл. 10.11.2005 г. Бюл. № 31.

3. Патент RU № 2320254 С1, МПК A61B 1/267, A61D 99/00. Способ ранней диагностики трахеобронхита у новорожденных телят / А.И. Золотарев, А.Г. Шахов, М.И. Рецкий, Г.Н. Близнецова, опубл. 27.03.2008 г. Бюл. № 9.

4. Патент RU № 2372051 С1, МПК A61D 99/00, А61К 33/14, А61К 33/40. Способ ранней диагностики трахеобронхита у телят / А.Е. Черницкий, М.И. Рецкий, А.Г. Шахов, А.И. Золотарев, опубл. 10.11.2009 г. Бюл. № 31.

5. Патент RU № 2558850 С1, МПК G01N 33/48. Способ ранней диагностики болезней органов дыхания у телят / Ю.Н. Алехин, О.В. Пригородова, М.С.Жуков, опубл. 10.08.2015 г. Бюл. № 22.

6. Патент RU № 2491550 С1, МПК G01N 33/49. Способ прогнозирования развития респираторных болезней у новорожденных телят / А.Е. Черницкий, М.И. Рецкий, А.И. Золотарев, Л.И. Ефанова, Ю.Н. Алехин, В.В. Давыдова, опубл. 27.08.2013 г. Бюл. № 24.

7. Patent US № 20230272490 Al, IC C12Q1/689, A61D99/00. Nasal microbiome biomarkers for predicting the onset of bovine respiratory disease and treating the same / J. Zhao, J. Chai, E.B. Kegley, J. Powell, publication date: 31.08.2023. Appl. № 18/020241.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к клинической диагностике. Телятам вводят трансназально стерильную силиконовую медицинскую трубку, диаметром 4 мм, внутренним диаметром отверстия 3 мм, толщиной стенки 1,0 мм и длиной 150 см. Во время введения при появлении сопротивления и повторяющегося кашлевого рефлекса, по достижении области бифуркации трахеи назогастральный зонд отодвигают назад на 1 см. Затем присоединяют к свободному концу одноразовый шприц, объемом 50 мл и с его помощью в трахею вводят 30-40 мл стерильного изотонического физиологического раствора при температуре 37°C. Затем аспирируют до 10 мл бронхоальвеолярного содержимого. Способ позволяет безопасно провести отбор проб микроорганизмов-инициаторов гнойно-воспалительного процесса, что в свою очередь дает возможность провести прижизненную диагностику бронхопневмонии и применить способ для комплекса диагностических исследований при патологиях респираторного тракта. 4 пр.

Способ отбора проб бронхоальвеолярного лаважа для прижизненной диагностики бронхопневмонии у телят, включающий отбор проб смывов для проведения микробиологического исследования, отличающийся тем, что проводят трансназальное введение больному животному стерильной силиконовой медицинской трубки, диаметром 4 мм, внутренним диаметром отверстия 3 мм, толщиной стенки 1,0 мм и длиной 150 см, до появления сопротивления и повторяющегося кашлевого рефлекса, по достижении области бифуркации трахеи назогастральный зонд отодвигают назад на 1 см, присоединяют к свободному концу одноразовый шприц объемом 50 мл и с его помощью в трахею вводят 30-40 мл стерильного изотонического физиологического раствора температурой 37°C, а затем аспирируют до 10 мл бронхоальвеолярного содержимого.