ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM FUNICULOSUM - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, β-ГЛЮКАНАЗЫ, β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ И КСИЛОГЛЮКАНАЗЫ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ Российский патент 2008 года по МПК C12N9/42 C12P19/14 C12R1/80 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности области биотехнологической переработки лигноцеллюлозных материалов, и может быть использовано для получения сбраживаемых сахаров, предназначенных для переработки в этанол, а также в качестве кормовых добавок.

Известно достаточно много штаммов - продуцентов отдельных карбогидраз, главным образом целлюлаз, способных ферментативно расщеплять целлюлозосодержащие материалы, и способы их культивирования в аэробных условиях.

Известны (RU, патент РФ 2057179, С12N 9/42, 1996 г.) штаммы Aspergillus niger, при культивировании которых на средах с индукторами целлюлолитических ферментов получают комплекс ферментов, включающих целлюлазу, ксиланазу, β-глюкозидазу, β-ксилозидазу, β-глюканазу и ламинариназу. Активности ферментов в культуральной жидкости составляют соответственно: целлюлаза - 5,0 ед./мл; ксиланаза - 125,0 ед./мл; β-глюкозидаза - 20,0 ед./мл; β-ксилозидаза - 36,0 ед./мл; β-глюканаза - 0,95 ед./мл и ламинариназа - 1,25 ед./мл.

Хотя грибы рода Aspergillus образуют комплексы с широким спектром карбогидраз, однако активность большинства отдельных компонентов комплекса недостаточно высокая, что часто делает нецелесообразным их практическое применение.

Продуцентами целлюлаз являются и штаммы мицелиальных грибов рода Trichoderma.

В частности, мутант Trichoderma. reesei MCG 80 (US, патент 4472504, С12N 9/42, 1984 г.) при непрерывном культивировании на питательной среде с 8% целлюлозы и биотином обеспечивает активность целлюлаз 17,2 ед./мл АФБ (АФБ - активность целлюлазного комплекса, определенная по фильтровальной бумаге и выраженная в международных единицах согласно рекомендации IUPAC [Т.К.Chose., Pure and Appl. Chem., vol.59, 2, p.257-268]).

Известен также штамм мицелиального гриба Tr.longibrachiatum ВКМ F-3634 D (RU, патент 2195490, С12N 9/42, 2002) - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, бета-глюканазы, ксиланазы, пектиназы и маннаназы. Активность целлюлаз, β-глюканаз, ксиланаз, пектиназ и маннаназ составляет примерно 6,5; 25,0; 20,0; 7,0 и 0,5 ед./мл соответственно.

Известен мутант Tr.reesei ВСМ 18.2/КК (ВГНКИ-28) (RU, патент 2001949, С12N 9/42, 1993 г.), полученный с использованием парасексуальных процессов из исходной культуры Tr.reesei IMET 43803, который обладает повышенной продуктивностью и позволяет при одностадийной ферментации обеспечить высокую активность ферментов (целлюлаз) с единицы массы используемого субстрата. Указанный штамм имеет ферментные системы, позволяющие расти на среде с целлюлозой, крахмалом, хитином, пектином, ксиланом, ламинарином, лихенином. При культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигается уровень активности в 3,5-4,2 ед./мл АФБ (время культивирования 110 ч), при культивировании в ферментере на среде с лактозой - 18,2 ед./мл (81 ч), при культивировании в ферментере на молочной сыворотке - 12-14 ед./мл (100-110 ч).

Недостатком указанных штаммов следует признать экспериментально установленные данные, подтверждающие, что грибы рода Trichoderma, как правило, обладают высокой продуктивностью, преимущественно в отношении целлюлаз, но в гораздо меньшей степени - в отношении других карбогидраз (β-глюканаз, ксиланаз, пектиназ, маннаназ и др.), необходимых для гидролиза различных полисахаридов, входящих (помимо целлюлозы) в состав растительного сырья. Все перечисленные штаммы Trichoderma имеют низкую продуктивность по карбогидразам, не являющимися целлюлазами (β-глюканазы, ксиланазы, пектиназы, маннаназы и др.).

Известен (RU, патент 2167197, С12N 11/14, 2001) способ получения биокатализатора для получения сбраживаемых сахаров из целлюлозосодержащего материала путем наработки ферментного материала - глюкоамилазы с последующей иммобилизацией его на твердом носителе, причем иммобилизацию проводят путем адсорбции на поверхности зауглероженного алюмосиликата, имеющего удельную поверхность не менее 2 м²/г, с величиной углеродного покрытия не менее 1,5 мас.% углерода, при этом углеродное покрытие имеет структуру волокнистого каталитического углерода и мезопористую структуру.

Недостатком известного способа следует признать его сложность, а также невысокую каталитическую активность относительно переработки целлюлозосодержащих материалов получаемого биологически активного катализатора.

Техническая задача, на реализацию которой направлено предлагаемое техническое решение, состоит в разработке нового биокатализатора получения сбраживаемых сахаров из целлюлозосодержащих материалов.

Технический результат, получаемый при реализации предложенного технического решения, состоит в увеличении выхода сбраживаемых сахаров из целлюлозосодержащего материала.

При реализации предложенного технического решения использован новый селекционированный штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum S-2006 продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы (целлобиазы), ксиланазы и ксилоглюканазы.

Штамм получен с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Pen.funiculosum BKM F-3661.

Мутагенез и селекцию штаммов Pen.funiculosum проводят, суспендируя споры гриба в дистиллированной воде с добавлением 0,1% Tween-80 и облучая ультрафиолетом (облучение световым потоком мощностью 3 Вт/см²) в течение 3 минут. Затем контрольные и облученные споры высевают на чашки с глюкозо-картофельным агаром и инкубируют 48 ч при 28°С. После этого подсчитывают процент выживаемости. Выживаемость 1-5% считают достаточной для отбора мутантов. Каждый выживший клон переносят на чашки с селективными агаризованными средами, имеющими в своем составе 0,1% карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) или 1% ксилан из овса ("Sigma") и инкубируют 48 ч при 28°С. Мутанты с улучшенной продукцией отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза целлюлаз, ксиланаз и β-глюкозидаз при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах наиболее активные варианты снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С с обязательным пересевом не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Культурально-морфологические признаки полученного штамма.

При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 36 мм на 7-е сутки при росте при 25°С. Колонии плотные, ровные, с выпуклым центром. Мицелий светлый, пушистый. Обратная сторона палево-красновато-оранжевая. Конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом на 7-е сутки имеют 27-30 мм в диаметре, складчатые, с ровным краем, поверхность шерстистая. Мицелий светлый, желтоватый. Обратная сторона - палево-оранжевая. Конидиогенез слабый.

Гриб не растет на среде с глицерином и на агаре Чапека при 5°С. При культивировании на агаре Чапека при 37°С колонии имеют 18 мм в диаметре, складчатые, средней плотности, обратная сторона буровато-красноватая.-t

Конидиогенез: кисточки бивертициллятные, метулы прижатые, гладкие (8-10×2,5-3,0). Фиалиды ацерозные (8-9×2,5-3,0), с короткой шейкой. Конидии эллиптические, мелкие (2,2×1,5-2,0), гладкие.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,35 ч^-1, в конце культивирования 0,1 ч^-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма.

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом не наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилозу, D-маннозу, D-маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - D-ксилозу, L- и D-арабинозу, L-рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу и 5-тио-D-глюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную форму азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, ламинарине, β-глюкане, лихенине, пектине и галактоманнане. Способен утилизировать молочную кислоту при концентрации ниже ингибирующей.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Культивирование предлагаемого штамма Pen.funiculosum проводят в аэробных условиях в погруженном состоянии на питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - источников углерода, являющихся индукторами биосинтеза ферментов. В качестве субстратов могут использоваться и субстраты, не являющиеся индукторами. Штамм способен в соответствующих условиях проведения процесса культивирования на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы или лактозы, секретировать в культуральную среду комплекс ферментов - карбогидраз, содержащего целлюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы (пеллобиазы), ксиланазы и ксилоглюканазы. Глюкоза в среде культивирования может быть заменена более дешевым продуктом - гидролизатом крахмала.

Активность целлюлаз по фильтровальной бумаге (АФБ) определяли стандартным методом [Ghose Т.К. Measurement of cellulase activity. Pure Appl. Chem., 1987, v.59, p.257-268] при 50°С и pH 4,8, используя бумагу хроматографическую №1 производства фирмы "Whatman" (Англия) и динитросалициловый метод анализа восстанавливающих сахаров (ВС). Ферментативные активности по отношению к КМЦ, авицелу (микрокристаллической целлюлозе), β-глюкану, ксилану и ксилоглюкану определяют по начальным скоростям образования ВС (за 5-10 мин ферментативной реакции) методом Шомоди-Нельсона [А.П.Синицын, А.В.Гусаков, И.М.Черноглазов. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие. - М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156] из соответствующего субстрата (5 г/л) при pH 5,0 (0,1 М Na-ацетатный буфер) и 50°С (активность по авицелу определяли при 40°С).

Активность по отношению к n-нитрофенил-β-глюкозиду определяли при рН 5,0 и 40°С. Аликвоту (0,05 мл) запасного раствора субстрата (10 мМ) смешивали с 0,85 мл 0,1 М Na-ацетатного буфера, смесь предварительно прогревали при 40°С в течение 5 мин и далее начинали ферментативную реакцию внесением 0,1 мл предварительно разбавленного и подогретого таким же образом раствора фермента. Ровно через 10 мин инкубации раствора при 40°С реакцию останавливали, добавляя 0,5 мл 1 М раствора Na₂CO₃. Далее на спектрофотометре измеряли поглощение раствора при 400 нм против кюветы сравнения, в которой находился контрольный раствор субстрата, приготовленный точно так же, но в который вместо раствора фермента вносили 0,1 мл ацетатного буфера. Количество выделившегося n-нитрофенола рассчитывали, используя его коэффициент экстинкции (D₄₀₀=18300 М^-1 см^-1).

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, в виде концентрированных препаратов, получаемых с помощью улътрафильтрации или вакуум-выпарки, или в виде сухих препаратов.

Возможность использования изобретения подтверждена примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Предлагаемый штамм был получен следующим образом.

Пример 1. Для получения посевного материала (инокулята) культуру заявленного штамма гриба Pen. funiculosum S-2006 выращивают на сусло- или СМ-агаре при 29°С в течение 7 сут. и далее при комнатной температуре на свету в течение 5 сут. Засев колб проводят 1 мл суспензии спор, смытых с агара водой, содержащей 0,1% твина 80. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях в качалочных колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл водного раствора питательной среды следующего состава, в г/л: свекловичный жом - 40, солодовые ростки - 14, (NH₄)₂SO₄ - 6, КН₂PO₄ - 2, MgSO₄×H₂O - 0,6; pH 5,4. Колбы инкубируют на качалке при 30°С и 200 об/мин в течение 120 ч.

Активность авицелазы, карбоксиметилцеллюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы, ксиланазы, ксилоглюканазы и АФБ в культуральной жидкости на 120 ч культивирования составляет 15, 130, 140, 10, 380, 100 и 12 ед./мл, соответственно.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах Эрленмейера как описано в примере 1, используя водную питательную среду следующего состава, в г/л: целлюлоза - 40, глюкоза - 10, (NH₄)₂SO₄ - 6, КН₂PO₄ - 2, MgSO₄×7H₂O - 0,6; pH 5,4.

Активность авицелазы, карбоксиметилцеллюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы, ксиланазы, ксилоглюканазы и АФБ в культуральной жидкости составляет на 120 ч культивирования 25, 260, 275, 15, 510, 140 и 18 ед./мл, соответственно.

Пример 3. Ферментный препарат получают культивированием штамма Pen.funiculosum S-2006 в ферментере АНКУМ-2М (рабочий объем 7 л) на водной питательной среде следующего состава, в г/л: целлюлоза - 50, глюкоза - 10, KH₂PO₄ - 8, (NH₄)₂SO₄ - 3, MgSO₄×7H₂O - 0,2, CaCl₂×2H₂O - 0,2 при 28°С и поддержании pH в диапазоне 4,5-5 путем подачи HCl или NH₄OH. При культивировании осуществляют подпитку глюкозой путем непрерывной ее подачи в ферментер со скоростью 2-3 г/л/час. Через 144 ч отделяют культуральную жидкость, содержащую комплекс высокоактивных карбогидраз, и концентрируют с помощью ультрафильтрации (на мембранах с пределом пропускания 10 кДа) с получением жидкого биокатализатора.

Активности авицелазы, карбоксиметилцеллюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы, ксиланазы, ксилоглюканазы и АФБ в культуральной жидкости составляют на 144 ч культивирования 45, 650, 690, 28, 1280, 260 и 42 ед./мл, соответственно. Активности авицелазы, карбоксиметилцеллюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы, ксиланазы, ксилоглюканазы и АФБ в жидком ферментном препарате (УФ-концентрате) составляют 280, 3900, 4250, 170, 7580, 1570 и 260 ед./мл, соответственно.

Пример 4. Ферментный препарат получают культивированием штамма Pen.funiculosum S-2006 в ферментере АНКУМ-2М (рабочий объем 7 л) на водной питательной среде следующего состава, в г/л: целлюлоза - 60, глюкоза - 30 (в качестве глюкозы используют ферментативный гидролизат крахмала), КН₂PO₄ - 12, (NH₄)₂SO₄ - 7, MgSO₄×7H₂O - 0,4, CaCl₂×2H₂O - 0,4 при 28°С и поддержании рН в диапазоне 4,5-5 путем подачи HCl или NH₄OH. При культивировании осуществляют подпитку глюкозой (в качестве глюкозы используют ферментативный гидролизат крахмала) путем непрерывной ее подачи в ферментер со скоростью 2-3 г/л/час. Через 144 часов отделяют культуральную жидкость, содержащую комплекс карбогидраз, подвергают ее ультрафильтрации и лиофильно высушивают ультраконцентрат с получением сухого биокатализатора.

Активности авицелазы, карбоксиметилцеллюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы, ксиланазы, ксилоглюканазы и АФБ в культуральной жидкости составляют на 144 ч культивирования 58, 820, 870, 38, 1520, 360 и 55 ед./мл, соответственно. Активности авицелазы, карбоксиметилцеллюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы, ксиланазы, ксилоглюканазы и АФБ в сухом ферментном препарате составляют 870, 13100, 13500, 610, 22900, 5760 и 870 ед./г, соответственно.

Эксперимент по определению гидролитической (осахаривающей) способности полученного биокатализатора проводят в термостатируемой при 50°С ячейке, помещенной на качалку. В ячейки вносят навеску субстрата (предварительно обработанную паровым взрывом или органозольвом древесину лиственных или хвойных пород, предварительно обработанную паровым взрывом солому злаковых растений, свекловичный жом, отход целлюлозно-бумажного производства - коротковолокнистую целлюлозу, обрезки пергамента), 6,8 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,0, и 1 мл раствора предварительно разбавленного ферментного препарата. Реакционную смесь перемешивают на качалке при частоте 250 колебаний/мин. Концентрация субстрата в реакционной смеси составляет 50 г/л (в пересчете на сухое вещество), а разбавление ферментного препарата подбирают таким образом, чтобы АФБ была 10 ед. на 1 г сухого субстрата. Через 12 ч гидролиза из реакционной смеси отбирают пробы (1 мл), центрифугируют 1 мин при 10000 об/мин и измеряют в супернатанте концентрацию ВС и глюкозы. За критерий гидролитической способности препаратов принимают выход глюкозы за 12 ч гидролиза нерастворимого субстрата при 50°С.

Концентрацию глюкозы определяют глюкозооксидазно-пероксидазным методом [Березин И.В., Рабинович М.Л., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, т.42, №9, с.1631-1636].

Согласно полученным экспериментальным данным при любом исходном сырье (древесина хвойных или лиственных пород, солома злаковых растений, свекловичный жом, целлюлозные отходы) наибольшее количество сбраживаемой в спирт глюкозы за 12 ч образовал ферментный препарат Penicillium funiculosum S-2006, предлагаемый для реализации способа. Он обеспечивал выход глюкозы на 15-50% глюкозы больше, чем коммерческие или лабораторные ферментные препараты Penicillium и коммерческие или лабораторные ферментные препараты Trichoderma.

Таким образом, предлагаемый штамм Penicillium funiculosum S-2006 обладает способностью продуцировать комплекс высокоактивных карбогидраз, включающий целлюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы (целлобиазы), ксиланазы и ксилоглюканазы, что создает возможность получения полного комплекса ферментов, а также при необходимости отдельных индивидуальных ферментов (компонентов) комплекса.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения сбраживаемых сахаров, предназначенных для переработки в этанол, а также в качестве кормовых добавок. Штамм мицелиального гриба получен с помощью многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Penicillium funiculosum BKM F 3661. Полученный штамм культивируют на жидкой питательной среде при непрерывной подпитке глюкозой. Через 120 ч после начала культивирования культуральную жидкость отделяют и концентрируют ультрафильтрацией с получением жидкого ферментного препарата или высушивают. 2 н.п. ф-лы.

1. Штамм мицелиального гриба Penicillium funiculosum BKM F-3887D - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего целлюлазы, β-глюканазы, β-глюкозидазы, ксиланазы и ксилоглюканазы.2. Способ получения ферментного препарата комплекса карбогидраз для осахаривания лигноцеллюлозных материалов, характеризующийся тем, что штамм Penicillium funiculosum BKM F-3887D культивируют на питательной среде, содержащей, г/л: целлюлозу 50-60, глюкозу 10-30, минеральные соли - КН₂РО₄ 8-12, (NH₂)₂SO₄ 3-7, MgSO₄·7H₂O 0,2-0,4, CaCl₂·Н₂О 0,2-0,4, при непрерывной подпитке глюкозой, при температуре 26-30°С и поддержании рН в диапазоне 4,5-5,0, через 120-144 ч после начала культивирования культуральную жидкость отделяют и концентрируют с помощью ультрафильтрации с получением жидкого ферментного препарата или высушивают с получением сухого ферментного препарата.