ШТАММ "АЛЕКСЕЕВСКИЙ" ВИРУСА ОСПЫ СВИНЕЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ, МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ, МОНИТОРИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2015 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к штаммам вируса оспы свиней (ВОС), и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и диагностических центрах в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов.

Согласно принятой классификации вирус оспы свиней (Swinepox) относится к семейству Poxviridae род Suipoxvirus. Вирус является этиологическим агентом высококонтагиозного заболевания, характеризующегося лихорадкой и пузырьково-пустулезной сыпью. Оспа свиней регистрируется во всех странах мира и поражает животных всех возрастов, хотя наиболее тяжелое течение наблюдают у молодняка (0-4 мес.) (4, 5). Источник и резервуар инфекции - больные свиньи. Передача вируса осуществляется в основном алиментарным путем и через механических переносчиков - свиную вошь (Haematopinus suis), в которой вирус сохраняется в течение года. К вирусу оспы свиней восприимчивы только свиньи. Вирус способен индуцировать стабильный иммунитет. Ограниченный круг естественно восприимчивых животных и способность индуцировать стабильный защитный иммунитет позволяет использовать данный вирус в качестве вектора экспрессии (1, 2, 3).

Целью данного изобретения является получение нового штамма вируса оспы свиней, обладающего стабильными культуральными и антигенными свойствами для использования в качестве референс-штамма при проведении вирусологических, молекулярно-генетических, мониторинговых исследований и изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Поставленная цель достигается путем выделения вируса из патологического материала от больных поросят с участка доращивания крупного свиноводческого комплекса Белгородской области. Вирус выделили с использованием культур клеток.

Штамм является новым, ранее неизвестным, выделенным на территории РФ и обозначен как штамм «Алексеевский».

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИВВиМ за инв. №3072 от 20.11.13.

Новый штамм «Алексеевский» характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства. При электронно-микроскопических исследованиях в вируссодержащем материале обнаружены вирусные частицы размером 300×250×200 нм, морфологически тождественные представителям рода Suipoxvirus семейства Poxviridae.

Культуральные свойства. Штамм «Алексеевский» размножается в первичных культурах почки и тестикул поросенка, а также в перевиваемых культурах свиного происхождения СПЭВ, РК-15. Репродукция вируса сопровождается цитопатическим действием, приводящим к полной деструкции монослоя на 3-4 сутки культивирования. В культурах гетерологичного происхождения (ПС, МДВК, VERO) вирус не размножается.

Инфекционная активность. Обладает высокой инфекционной активностью, накапливается в культурах клеток свиного происхождения 6,0-7,5 lg ТЦД_50/см3. Этот штамм размножается в культурах клеток СПЭВ в титре 6,0-7,0 lg ЦПД_50/см3, РК-15 - в титре 7,0-7,5 lg ЦПД _50/см3.

Способ выращивания. Штамм культивируют в монослое перевиваемых линий культур клеток свиного происхождения (СПЭВ, РК-15) в стационарных и роллерных культурах. При оптимальных условиях максимальное накопление достигается через 72-96 часов культивирования. В качестве поддерживающей среды используют среду Игла-МЭМ с 2% сыворотки КРС.

Антигенные свойства. Вызывает образование вируснеитрализующих антител.

Гемаглютинирующие свойства. Не обладает.

Патогенность для человека. Не патогенен.

Патогенные свойства. Штамм патогенен только для свиней всех пород и возрастных групп. При экспериментальном заражении взрослых свиней вызывает повышение температуры тела (41°-41,5) и потерю веса, а также характерные оспенные поражения на слабопокрытых щетиной местах. При отсутствии осложнений выздоровление наступает на 21-28 сутки. У молодняка наблюдается более тяжелое течение.

Контагиозность. Штамм контагиозен для свиней. Интактные свиньи заболевают оспой свиней при совместном содержании с инфицироваными животными.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами. Штамм не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

Способ и срок хранения, периодичность пассажей. Штамм хранят при минус 40°С и «освежают» пассированием в культуре клеток РК-15, СПЭВ. Периодичность освежения штамма один раз в 10 лет. Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. Накопление вируса в культуре клеток СПЭВ и РК-15. В табл. 1 приведены сведения по культивированию штамма «Алексеевский» вируса оспы свиней в монослое культур клеток СПЭВ и РК-15.

Как следует из табл. 1, титры выделенного вируса в культуре клеток СПЭВ на уровне третьего пассажа составили 6,5-7,0 lg ЦПД_50/см3, в культуре клеток РК-15 на уровне этого же пассажа 7,25-7,5 lg ЦПД _50/см3, что обеспечивает возможность использования культурального вирусного материала для проведения экспертизных исследований, в частности реакции нейтрализации.

Как видно из таблицы 2, штамм «Алексеевский» как нативный, так и лиофилизированный стабилен при длительном пассировании в культурах клеток. Множественность заражения 0,03-0,05 ТЦД₅₀/кл. Стабильность штамма обеспечивает возможность использования вирусного материала для конструирования инактивированных вакцин и диагностических препаратов.

Пример 3. Использование вируса оспы свиней, штамм «Алексеевский», для приготовления инактивированной вакцины против оспы свиней.

Для получения производственного вируса отбирали 1-2-х дневную культуру клеток РК-15 с полным равномерным монослоем, выращенную на культуральных пластиковых одноразовых матрасах с посадочной площадью 225 см². Из матрасов удаляли ростовую среду и в каждый вносили по 100 мл поддерживающей питательной среды. Затем вносили вирус, множественность заражения при этом составляла 0,03-0,05 ТЦД₅₀/кл. Матрасы с инфицированной культурой помещали в термостат. Выращивание вируса проводили при температуре (37,0±0,5)°С в течение 48-60 часов до проявления характерных цитопатических изменений и поражении 90-100% клеточного монослоя. Затем вирусную суспензию сливали, объединяли и хранили при температуре (-20,0±4,0)°С. Для приготовления инактивированной вакцины использовали вирус с активностью 7,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Биологическую активность вируса определяли титрованием на монослойной культуре клеток РК-15.

Инактивацию вируса проводили β-пропиолактоном в разведении 1:4000, поддерживая pH раствора в пределах 7,0-7,4. Вирус инактивировали при комнатной температуре (21±4)°C в течение 2 ч на магнитной мешалке, а затем при 2-6°C в течение ночи (12-14 ч). Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяли путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток РК-15. Для этого в 3 матраса с посадочной площадью 25 см² с монослоем 1-2-х суточной культуры клеток РК-15 вносили по 1 см³ вируса в разведении 1:10, выдерживали 20 мин при температуре (37,0±0,5)°C, затем монослой отмывали питательной средой, в матрасы заливали поддерживающую среду и инкубировали в течение 5 суток. Для проведения пассажей испытуемую культуру клеток кратковременно замораживали-оттаивали, содержимое матрасов в разведении 1:10 переносили в 1-2-х дневную культуру клеток РК-15 с полным равномерным монослоем и инкубировали еще 5 дней. Полноту инактивации оценивали по отсутствию ЦПД в культуре клеток РК-15 на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляли 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5-10 мг/мл, тщательно перемешивали и оставляли при температуре (2-6)°C для адсорбции вирусного антигена. Через 24 часа осторожно, не взбалтывая, декантировали 1/3 часть надосадка, доливали инактивированную вирусную суспензию до первоначального объема, тщательно перемешивали и выдерживали еще 24 часа.

Приготовленная таким образом вакцина представляла собой суспензию бледно-розового цвета с белым осадком.

Проверку иммуногенных свойств вакцины осуществляли на лабораторных животных - кроликах.

До иммунизации и через 21 день после вакцинации от животных отбирали кровь и исследовали сыворотку на наличие вируснейтрализующих (ВН) антител в реакции нейтрализации (PH). PH проводили по стандартной методике со 100-300 ТЦД₅₀ вируса оспы микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:256) с использованием культуры клеток РК-15. Вакцина вызывала образование ВН-антител у испытуемых животных в титрах 1:8-1:16.

Пример 4. Приготовление культурального специфического антигена вируса оспы свиней штамм «Алексеевский».

Монослойную культуру клеток РК-15, выращенную в матрасах с посадочной площадью 225 см³, заражали вирусом оспы свиней штамм «Алексеевский» с множественностью заражения 0,03 ТЦД₅₀/кл. Вирус культивировали при (37,0±0,5)°C, поддерживая pH среды в пределах 7,0-7,4 в течение 24-48 часов до появления 30% ЦПД. Культуральную жидкость удаляли и монослой отмывали двукратно ФБР. Клетки снимали с пластика механически. Отделившиеся клетки собирали в небольшом количестве физиологического раствора, осаждали центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 минут. Затем клетки лизировали добавлением дистиллированной воды в объеме, равном 1/100 исходного объема вируссодержащей жидкости. Полученный материал дважды замораживали-оттаивали и обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 минуты с интервалом 1 мин. Суспензию с клеточным дебрисом снова замораживали-оттаивали и удаляли клеточный детрит центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин.

Полученный осветленный лизат инактивировали β-пропиолактоном. С этой целью в 50 мл надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса оспы свиней, вносили 0,05 мл β-пропиолактона и выдерживали 18 часов при (4,0±2,0)°C. Полноту инактивации антигена проверяли в 3-х последовательных пассажах в чувствительной культуре клеток РК-15. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности и обладал активностью в реакции диффузионной преципитации 1:2-1:4.

Источники информации

1. Foley, P.L., P.S. Paul, R.L. Levings, S.К. Hanson, and L.A. Middle. 1991. Swinepox virus as a vector for the delivery of immunogens. Ann. N.Y. Acad. Sci. 646:220-222.

2. Tripathy, D.N. 1999. Swinepox virus as a vaccine vector for swine pathogens. Adv. Vet. Med. 41:463-480.

3. Williams, P.P., M.R. Hall, and M.D. McFarland. 1989. Immunological responses of cross-bred and in-bred miniature pigs to swine poxvirus. Vet. Immunol. Immunopathol. 23:149-159.

4. MUNZ, E.; DUMBELL, K. Swinepox. In: COETZER, J.A.W.; THOMSON, G.R.; TUSTIN, R.C. (Eds.). Infectious diseases of livestock. New York: Oxford University Press, 1994. v. l. p. 627-629.

5. BARLOW, A.M. & G RIST, C. An outbreak of congenital pig pox. Pig. J. Proceed. Sec, v.46, p. l18-121, 2000.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается штамма вируса оспы свиней семейства Poxviridae рода Suipoxvirus. Охарактеризованный штамм выделен из патологического материала от больных поросят свиноводческого комплекса Белгородской области и депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии под №3072. Штамм может быть использован для проведения вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов. 2 табл., 4 пр.

Штамм «Алексеевский» вируса оспы свиней семейства Poxviridae род Suipoxvirus, депонированный в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии под №3072, для проведения вирусологических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований, изготовления вакцин и диагностических препаратов.