ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ШТАММ ENTEROVIRUS SUIS ВОЗБУДИТЕЛЯ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА У СВИНЕЙ (БОЛЕЗНЬ ТЕШЕНА), ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/125 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к производственным штаммам энтеровирусов свиней, которые могут быть использованы для изготовления диагностических и вакцинных препаратов на предприятиях биологической промышленности.

На основании результатов реакции нейтрализации выделенные в разных регионах мира энтеровирусы свиней отнесены к 11 серотипам (Derbishire J.D. Porcine Enterovirus Polioencephamielitis. In: Virus infections of porcine, Amsterdam etc. , 1989, pp.225-233). Энтеровирусы свиней 1 серотипа вызывают у этого вида животных энтеровирусный энцефаломиелит свиней (болезнь Тешена).

На территории Российской Федерации и некоторых стран СНГ в качестве производственного используется штамм "Закарпатский" вируса болезни Тешена. В частности, штамм "Закарпатский" является производственным штаммом, ближайшим аналогом предлагаемого изобретения, при изготовлении "Вакцины против энтеровирусного энцефаломиелита свиней инактивированной эмульгированной" по ТУ 9384-020-00008064-96 и "Набора препаратов для идентификации вируса болезни Тешена реакцией нейтрализации" по ТУ 9388-022-00495549-89.

Штамм "Закарпатский" размножается в перевиваемых культурах клеток свиного происхождения: перевиваемых клетках эмбриона свиньи (СПЭВ), перевиваемых клетках тестикул поросенка (ПТП), перевиваемой линии клеток почки эмбриона поросенка (ППК), накапливаясь в титрах 10⁷ - 10⁹ ТЦД_50/мл, а также в организме свиньи, вызывая при внутримозговом заражении поросят 2-4-месячного возраста заболевание с поражением головного и спинного мозга.

При изучении краевой эпизоотологии болезни Тешена в Брянской области, в 1995-1996 гг. было установлено, что инактивированная вакцина, приготовленная на основе штамма "Закарпатский", при однократной прививке согласно наставлению по применению не обеспечивала полную защиту животных от болезни. Проведенные вирусологические исследования показали наличие иммунологического несоответствия штамма "Закарпатский" эпизоотическому вирусу возбудителя болезни Тешена, циркулирующему на территории Брянской области. Это обусловило необходимость поиска нового производственного штамма для совершенствования противоэпизоотических средств и методов специфической защиты против болезни Тешена.

Целью изобретения является получение нового, иммунологически отличающегося от известных, производственного штамма энтеровируса свиней 1-го серотипа, гомологичного по протективному антигену эпизоотическим штаммам вируса болезни Тешена, циркулирующих в центральных регионах Российской Федерации.

Цель была достигнута путем выделения эпизоотического (вирулентного) вируса болезни Тешена в очаге инфекции в 1996 г. среди свинопоголовья в Навлинском районе Брянской области, привитого против болезни Тешена вакциной из штамма "Закарпатский". Для этого патологическим материалом головного мозга от павшего подсвинка с признаками энтеровирусного энцефаломиелита инокулировали перевиваемую культуру СПЭВ в пробирках, выдерживали ее 5 суток при 37^oC, замораживали-оттаивали и проводили еще один пассаж, до развития цитопатического действия (ЦПД). Выделенный цитопатический агент идентифицировали в реакции нейтрализации, согласно требований Методических указаний по диагностике болезни Тешена. Штаммоспецифические особенности изолята изучали в реакции нейтрализации по Методическим указаниям по типированию и субтипированию вируса ящура. Выделенный штамм вируса болезни Тешена по месту и времени выделения был назван штаммом "Навля - 96".

Согласно результатам реакции нейтрализации установлено, что этот вирус как и штамм "Закарпатский" принадлежит к 1-ому серотипу энтеровирусов свиней, но отличается от этого штамма по индексу нейтрализации (табл. 1).

Разность индексов нейтрализации вирусов штамма "Закарпатский" и штамма "Навля-96" специфической сывороткой к шт. "Закарпатский" не превышает 1,0 lg ТЦД_50/мл и находится в пределах 0,75- 1,0 lg ТЦД_50/мл:
в опыте N 1 7,25-6,25=1,0 lg ТЦД_50/мл;
в опыте N 2 5,5-4,75=0,75 lg ТЦД_50/мл;
в опыте N 3 5,5-4,5=1,0 lg ТЦД_50/мл.

Из этого следует, что сравниваемые штаммы являются антигенно родственными, в то же время между ними имеются значительные иммунологические различия.

Данные табл. 2 также свидетельствуют о неполном серологическом соответствии штаммов "Закарпатский" и "Навля-96". Так сыворотка на шт. "Навля-96" нейтрализовала в равной мере оба штамма "Закарпатский" и "Навля-96" в разведении 1:256. Тогда как сыворотка на штамм "Закарпатский" нейтрализовала гомологичный штамм вируса в разведении 1:1024, а гетерологичный штамм "Навля-96" - в разведении 1:512.

Штамм "Навля-96" был адаптирован к перевиваемым клеточным культурам ПСГК (перевиваемые клетки сибирского горного козерога), ПТП (перевиваемая культура клеток тестикул поросенка), ППК-66 (перевиваемая линия клеток почки эмбриона поросенка). В культурах клеток вирус накапливается в высоких титрах (8,0-9,0 lg ТЦД_50/мл), продуцирует высокоактивный протективный антиген, который эффективно выявляется в иммунологических тестах (в РСК, ИФА, РДП) и индуцирует образование вируснейтрализующих антител в высоких титрах после однократного введения морским свинкам и кроликам. Штамм "Навля-96" депонирован в Музее микроорганизмов института, ему присвоен регистрационный номер 1970.

Штамм "Навля-96" характеризуется следующими признаками.

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
Вирус устойчив к жирорастворителям (хлороформу, фреону), при электронной микроскопии имеет форму и размеры, типичные для энтеровирусов. В реакциях нейтрализации, связывания комплемента (РСК), диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментного анализа (ИФА) обнаруживает наличие антигенов, общих для всех энтеровирусов свиней 1-го серотипа.

МАРКЕРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Адаптационные свойства и контагиозность: вирус репродуцируется в культуральной системе первичных (ПС) и перевиваемых линий клеток свиньи (СПЭВ, РК-15, SK-6, ПТП), почки сибирского горного козерога (ПСГК) при оптимальной температуре (37,5 ± 0,5^oC) до инфекционных титров 8,0 -9,0 lg ТЦД_50/мл. Штамм контагиозен для свиней.

Патогенные и нейровирулентные свойства: вирус не проявляет патогенности для грызунов при внутримышечном и подкожном способах заражения, но вызывает у них краткосрочную виремию и персистенцию вируса. Обладает нейровирулентными свойствами для свиней, вызывая заболевание и гибель части животных, которые повышаются при пассаже через организм грызунов.

Свойства полезного вещества, продуцируемость вирусом: вызывает образование вируснейтрализующих протективных, комплементсвязывающих, преципитирующих антител. Инактивированный вирус индуцирует иммунитет у свиней против эпизоотических вариантов возбудителя болезни Тешена, циркулирующих в настоящее время на территории Российской Федерации.

Свойства агглютинации: не агглютинирует эритроциты мыши, морской свинки, свиньи, курицы, утки без дополнительной обработки.

Терморезистентность (T₅₆- признак): полностью утрачивает инфекционные свойства в результате прогревания при 56^oC в течение 2 часов, частично сохраняя антигенную активность.

Ингибиторочувствительность: хлороформ, эфир, фреон и другие жирорастворители не подавляют инфекционной активности вируса. Проявляет чувствительность к антителам против гетерологичных энтеровирусов свиней, к термолабильным В-ингибиторам нативных сывороток крупного рогатого скота и свиней. Вирус инактивируют растворы формальдегида, сернокислой меди, теотропина, кристалл-виолета.

Стабильность генетических и иммунобиологических признаков: стабильность генетических и иммунобиологических признаков сохранялась при его пассировании в культуре клеток, чувствительных к вирусу болезни Тешена, в течение не менее 21 пассажа (срок наблюдения).

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами: не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.

СТАНДАРТНЫЕ УСЛОВИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ
Перевиваемые культуры клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК) или тестикул поросенка (ЛТП), выращенные в матрасах, пробирках, планшетах или роллерным способом в бутылях из стекла или пластика, инокулируют вирусом болезни Тешена шт. "Навля-96" и инкубируют при 37^oC до полного развития цитопатического действия (ЦПД), т.е. до полной деструкции монослоя клеток, проявляющейся в виде округления и объединения пораженных клеток в гроздья, с последующим отслоением в культуральную жидкость. При множественности (М) заражения 0,001 ТЦД 50/клетку ЦПД развивается через 96 часов инкубации в стационарных условиях и примерно через 72 часа при роллерном культивировании. При увеличении М до 0,01 ТЦД 50/клетку ЦПД наступает через 48, а при М 0,1 ТЦД 50/клетку - через 24 часа.

Штамм стабилизируют обезжиренным молоком или другими стабилизаторами и хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 40^oC. Вирус освежают пассированием его в культурах клеток ПТП или ПСГК один раз в пять лет.

Выделенный на территории Брянской области штамм "Навля-96" Enterovirus suis возбудителя энтеровирусного энцефаломиелита свиней (болезни Тешена) в настоящее время используется в институте, как производственный для разработки и изготовления биологических препаратов.

Пример 1. Применение штамма для изготовления вакцины
Из вируса штамма "Навля-96" изготовляют инактивированную эмульгированную вакцину против болезни Тешена и контролируют ее в соответствии с требованиями ТУ 9384-020-00008064-96 "Вакцина против болезни Тешена инактивированная эмульгированная". При этом наличие вируснейтрализующих антител у привитых кроликов и подсвинков проверяют с использованием 100 - 1000 ТЦД_50/мл вируса "Навля-96". Через 14-21 день после прививки титры антител составляют от 1/16 до 1/64. Вакцина из штамма "Навля-96" в энзоотичных очагах болезни Тешена на территории Брянской области, в рамках производственных испытаний по заданию Департамента ветеринарии РФ, проявляла 100%-ную противоэпизоотическую эффективность. В то же время вакцины из штамма "Закарпатский" различных фирм-производителей в 15-40% случаев не проявляли защитного действия в связи с неполным иммунологическим соответствием эпизоотического и вакцинного штамма (см. табл. 3)
Пример 2. Применение штамма для разработки подтиповых диагностикумов.

Вирусом "Навля-96" с активностью 7,5 lg ТЦД_50/мл инокулируют морских свинок (n= 5) и в клетке с сетчатым полом подсаживают их над кормовой зоной станка со свиньями. Через 2-4 недели с начала контакта свиньи заболевают болезнью Тешена. Часть из них погибает, а некоторые (до 25%) выживают. У свиней в терминальной стадии болезни титр сывороточных вируснейтрализующих антител составляет от 1:32 до 1:256, а у свиней-реконвалесцентов - от 1:64 до 1: 1024. Свиней с наиболее активными в реакции нейтрализации сыворотками обескровливают, полученную сыворотку крови осветляют центрифугированием или методом микрофильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 22 мкм, расфасовывают по 0,5-1,0 мл в ампулы и лиофилизируют в стандартном режиме, в аппарате для сублимационной сушки любого типа. Активность антительного диагностикума контролируют в реакции нейтрализации, иммуноферментном анализе и т.д. Рабочим считают разведение сыворотки, равное 4-кратному предельному титру. Например, если предельный титр сыворотки в реакции нейтрализации составляет 1:1024, то ее рабочее разведение равно 1:256. Аналогично разрабатывают антительный диагностикум для подтиповой идентификации вируса "Закарпатский". Обоими антительными диагностикумами комплектуют набор для подтиповой идентификации возбудителя болезни Тешена.

Сыворотка депонирована в музее штаммов ВНИИВВиМ (инв. N. 1971 от 06.11.1997) и применяется для целей подтиповой идентификации возбудителя болезни Тешена при проведении эпизоотологических исследований и для оптимизации вакцинопрофилактики.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к новому штамму энтеровирусов свиней, используемому для приготовления вакцин и диагностических препаратов. Штамм получен из патматериала свиней, в перевиваемых культурах клеток с признаками энтеровирусного энцефаломиелита в период эпизоотии вируса болезни Тешена. Штамм накапливается в титрах 8,0-9,0 lg ТЦД 50/мл, обладает контагиозностью для свиней, вызывая у них болезнь Тешена при интрацеребральном и контактном заражении, у зараженных грызунов - персистенцию вируса. Имеет выраженную антигенную и иммуногенную активность и не содержит биологических контаминантов. Приготовленная из штамма "Навля-96" инактивированная эмульгированная вакцина против болезни Тешена проявляет 100%-ную противоэпизоотическую эффективность. В комплекте со штаммом "Закарпатский" штамм "Навля-96" является антительным диагностикумом для подтиповой идентификации возбудителя болезни Тешена. 3 табл.

Производственный штамм Enterovirus suis возбудителя энцефаломиелита свиней (болезнь Тешена), депонированный в коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии за 1970 от 06.11.1997 г, пригодный для изготовления биологических препаратов.