Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и касается получения новой линии клеток яичников козы, предназначенной для репродукции вирусов животных в целях их детектирования, выделения, проведения вирусологических исследований, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных биопрепаратов.
Постоянные линии клеток млекопитающих широко используются в научных исследованиях и биотехнологии (Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. - Вирусные болезни животных, М.: ВНИИТ и БП, 1998; Спиер Р.Е., Гриффитс Дж.Б. - Биотехнология клеток животных. М.: Агропромиздат, 1989). Их получают из различных органов и тканей животных (Дьяконов Л.П., Ситьков В.И. - Животная клетка в культуре. Методы и применение в биотехнологии. М.: Спутник, 2000). Известны, в частности, следующие линии клеток:
- почек сирийского хомячка (ВНК-21),
- свиной почки эмбриональной версенизированной (СПЭВ),
- тестикул поросят,
- почек сибирского горного козерога (ПСГК-30),
- почки кролика (RK-13/91),
- линия внутривидовых гибридов соматических клеток, полученных при слиянии перевиваемых клеток СПЭВ с первичными спленоцитами свиньи.
Эти и другие линии клеток используются для культивирования вируса ящура, вируса классической чумы свиней, вируса болезни Ауески и других вирусов (патенты RU 2065496, C12N 5/02, 20.08.1996; RU 2082758, C12N 5/06, 27.06.1997; RU 2061753, C12N 5/06, C12N 7/00, 10.06.1996; RU 2140451, С12N 5/06, С12N 7/00, А61К 39/135, 10.27.1999).
Линии клеток различаются по индексу пролиферации, адгезионности, чувствительности к вирусам, способности размножаться в той или иной питательной среде, антигенности, цитогенетическим характеристикам, морфологии. Даже клоны одной линии клеток могут иметь отличающиеся характеристики. В частности, известны клоны линии IB-RS-2, отличающиеся по чувствительности к вирусу ящура (De Castro, M.P. (1964). Behaviour of the foot-and-mouth disease virus in cell cultures: susceptibility of the IB-RS-2 cell line. Archivos do Instituto Biologica, Sao Paulo 31, 63-78).
Подобные случаи описаны при получении сублиний многих линий клеток (Спиер Р.Е., Гриффитс Дж.Б. - Биотехнология клеток животных. М.: Агропромиздат, 1989).
В ходе продолжительного пассирования популяция клеток, как правило, неоднородная по цитогенетическим, морфологическим и физиологическим характеристикам проявляет лишь ограниченную стабильность, что обусловливает необходимость расширения арсенала клеток животных посредством получения новых клеточных линий с определенными свойствами.
Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, являлось получение новой линии клеток с улучшенными биотехнологическими характеристиками, пригодной для детектирования и выделения широкого спектра вирусов, а также для изготовления средств диагностики и специфической профилактики вирусных заболеваний животных.
Получение линии клеток ЯДК-04
Нами получена новая линия клеток ЯДК-04, происходящая от штамма CG-91 клеток гонад козы, охраняемого патентом RU 2061753, С12N 5/06, С12N 7/00, 06.10.1996.
Родительские клетки CG-91 адаптировали к росту в монослое при низкой посевной плотности, разбавляя средой Игла с 0,25% гидролизата лактальбумина (ГЛА), 0,03% глютамина и 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) до плотности 30-40 кл./мл.
Высеянные таким образом клетки культивировали в пластиковых матрасах в течение 5-6 суток при +37°С, дожидаясь формирования клеточных колоний, состоящих из 50-100 клеток. Затем пастеровской пипеткой при визуальном контроле под микроскопом с кратностью увеличения 100-200 отдельные колонии клеток переносили в матрасы со свежей средой. Клетки пассировали в указанных условиях 20 раз, после чего они приобрели способность формировать сплошной монослой через 3-4 дня с момента субкультивирования, обеспечивая урожай 250-350 тыс.кл./мл. В дальнейшем оказалось возможным перейти к регулярному ритму пассирования с кратностью рассевания от 1:3 до 1:4 в среде Игла с 0,25% гидролизатом альбумина КРС, 10% сыворотки крови КРС и 0,03% глютамина.
В период от 5-го до 20-го пассажа пролиферативная активность была сравнительно низкой: монослой формировался лишь на 4-е или 5-е сутки, урожай не превышал 200-300 тыс.кл./мл. Заметное улучшение кинетических характеристик клеточной культуры произошло на 21-м пассаже, когда урожай вырос до 400-500 тыс.кл./мл, то есть до 90 миллионов клеток с одного клинского матраса.
При дальнейшем пассировании срок формирования монослоя снизился до 72 часов. Это позволило увеличить кратность рассевания, обеспечивающую ритмичное пассирование, до 1:3-1:4. Одновременно было замечено уменьшение средних размеров клеток, что свидетельствовало о повышении их устойчивости к стрессу.
Клетки претерпели в общей сложности 36 пассажей до превращения в линию с указанными выше свойствами. Их образцы, отобранные на 21-136 пассажах, были заморожены в клеточном банке ВНИИЗЖ под авторским названием ЯДК-04. Образец постоянной линии клеток ЯДК-04, отобранный на 134-м пассаже, депонирован 6 октября 2004 г.в коллекции перевиваемых соматических клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии (ВСКК СХЖ РАСХН) под №63.
Биотехнологические характеристики
Клетки ЯДК-04 выращивают при рН 7,0-7,2 и температуре 37-38°С в монослое в пластиковых или стеклянных сосудах емкостью от 50 до 1500 мл при соотношении объемов среды и сосуда в пределах 1:6-1:6,5. При этом используют среду Игла на солевом растворе Эрла или Хенкса, или среду 199 на солевом раствором Хенкса с добавлением 0,03% глютамина, 10% сыворотки крови КРС, 0,25% ГЛА или ферментативного гидролизата белков крови КРС (ФГБК-с).
При кратности рассевания 1:3-1:4 плотный монослой образуется спустя 2-4 дня культивирования без смены среды. Субкультивирование производят общепринятым методом, вызывая диссоциацию монослоя смесью, содержащей 0,02% этилендиаминтетраацетата, 0,25% трипсина, 0,5% D(+)-глюкозы. Долю жизнеспособных клеток определяют методом исключения красителя (трипанового синего), а также по результатам наблюдения за ростом посеянной культуры.
Ампулы с клетками ЯДК-04, суспендированными при плотности 2,0-3,0×106 кл./мл в свежей ростовой среде с 10% диметилсульфоксида, хранят в жидком азоте. Клетки размораживают, оттаивая ампулы в водяной бане при температуре 37-38°С. Кинетические характеристики клеточной культуры, отмеченные перед замораживанием, достигаются уже через 2-3 пассажа при высевах после оттаивания.
При кратности рассевания от 1:3 до 1:4 и посевной плотности от 1,5 до 2,0×105 кл./мл время образования полного монослоя находится в пределах от 2 до 4 суток. Исследование кинетических характеристик линии ЯДК-04, проведенное на 136-м пассаже, показало, что их максимальный урожай на уровне 80-100 миллионов клеток в матрасе объемом 1500 мл обеспечивается через 72 часа при посевной плотности 150-200 тыс./мл (табл.1).
Монослой, формируемый клетками ЯДК-04, характеризуется упорядоченной ориентацией вытянутых смежных фибробластоподобных клеток, образующих радиальные веерообразные сгущения вокруг скоплений полигональных эпителиоподобных клеток. Ядра клеток, как правило, округлой или овальной формы, различной величины, число ядрышек 1-3, реже 4-7.
В процессе получения линии клеток ЯДК-4 их видовая принадлежность была проверена методами изоферментного и кариологического анализа на 16, 36, 47, 76, 91, 134, 156 пассажах. Во всех случаях клетки обнаруживали признаки, характерные для козы домашней. Доля клеток с 57-58 хромосомами составляет 20-22% популяции, с 54-61 хромосомами 63-67%, тетраплоидных или околотетраплоидных клеток (имеющих от 115 до 123 хромосом) 7-9%.
При обследовании клеток посредством окрашивания акридиновым оранжевым или оливомицином, а также при высевах на индикаторные среды (МПБ, МПА, ТГС и 0,3% PPLO-агар) и при исследовании методом электронной микроскопии наличие бактерий, грибов и микоплазм не выявлено.
Клетки ЯДК-04 предназначены для выделения и накопления вирусов животных, для определения их инфекционной активности, изучения генетических и фенотипических свойств, а также для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, включающих вирусы и/или их компоненты. Данные клетки чувствительны к заражению вирусом ящура различных типов, вирусом болезни Ауески, вирусом оспы овец, вирусом пневмовирусной болезни птиц. Так, вирус ящура типов А, О, С и Азия-1 накапливается в монослойной культуре клеток ЯДК-04 с титрами 6,0-7,0 ТЦД50/мл (табл.3, 4).
Сведения, подтверждающие осуществление изобретения
Пример 1. Репродукция штамма А22-663 вируса ящура
Суспензию клеток с плотностью 125-200 тыс.кл./мл рассевали в стационарные или вращающиеся сосуды. Культивирование клеток проводили в среде Игла или среде 199 с 0,25% ГЛА или ФГБК-с с 10% сыворотки крови КРС и 0,03% глютамина при температуре 37-38°С и рН 7,0-7,2 без смены среды вплоть до формирования полного монослоя. Для размножения вируса использовали клеточный монослой, не имеющий признаков контаминации, дегенерации и апоптоза.
Заражение проводили посредством контакта концентрированной суспензии вируса с монослоем, предварительно удалив использованную ростовую среду и дважды ополоснув клетки подогретым до 37-38°С раствором Хенкса. Контакт вируса с клетками осуществляли при 37°С в течение 1 часа с помощью двух-трех миллилитров свежей среды с вирусом, добавленным в количестве, обеспечивающем множественность заражения 0,01-1,0 ТЦД/50 на одну клетку. Этой порцией вируса равномерно орошали монослой, слегка покачивая культуральный сосуд. Для обеспечения указанной множественности заражения концентрат посевного вируса и поддерживающую среду смешивали, как правило, в соотношении 1:30-1:50.
Затем монослой отмывали для удаления неадсорбированного клетками вируса, вносили в культуральные сосуды среду Игла без сыворотки, инкубировали при температуре 37°С и рН 7,5 в течение 24-48 часов до наступления полного лизиса инфицированной культуры.
Полученный таким образом материал дважды замораживали при - 40°С и оттаивали при 37°С для извлечения максимального вирусного урожая. Затем его титровали в первично-трипсинизированной культуре клеток почки свиньи или культуре клеток ЯДК-04. Титр вируса был в пределах от 5,5 до 6,5 lg ТЦД50/мл.
В последующих опытах было установлено, что при заражении клеток ЯДК-04, взятых на любом уровне пассирования после 21-го пассажа, штаммом А22-663 вируса ящура его урожай стабильно воспроизводился с титрами инфекционности, находившимися в тех же пределах.
Пример 2. Репродукция штамма O1-194 вируса ящура
С клетками и вирусом обращались так же, как в примере 1, при этом получали урожай с титром 5,75±0,25 lg ТЦД50/мл.
Пример 3. Репродукция вакцинного штамма С1-564 вируса ящура типа С
С клетками и вирусом обращались так же, как в примере 1. При этом вирус ящура C1-564 получали с титром 6,0±0,25 lg ТЦД50/мл (табл.3).
Пример 4. Репродукция штамма Азия-1/48 вируса ящура
С клетками и вирусом обращались так же, как описано в примере 1, вирусный урожай получали с титром 5,75±0,25 lg ТЦД50/мл (табл.3).
Пример 5. Репродукция штамма А22-663 вируса ящура с использованием поддерживающих сред, включающих ГЛА или ФГБК
Монослой линии клеток ЯДК-04 получали так, как описано в примере 1. Клетки инфицировали штаммом А22-663 вируса ящура при множественности заражения 0,01-1,0 ТЦД50/мл. Контакт монослоя с вирусом осуществляли в течение 1 часа при +37°С, затем монослой отмывали раствором Эрла для удаления вируса, неадсорбированного клетками. В качестве поддерживающей среды использовали одну из указанных выше питательных сред с примесью 0,25-0,5% ГЛА или ФГБК-с. Культивирование, сбор и титрование вируса ящура выполняли так, как описано в примере 1, при этом получали урожай с титром 5,75±0,25 lg ТЦД50/мл (табл.7).
Пример 6. Репродукция штамма O1-194 вируса ящура
С клетками обращались так, как описано в примере 1, а с вирусом - как в примере 5, при этом был получен урожай с титром 5,5-5,75 lg ТЦД50/мл (табл.3).
Пример 7. Репродукция штамма C1-564 вируса ящура
С клетками обращались так, как описано в примере 1, с вирусом - как в примере 5, получали урожай с титром 5,75-6,0 lg ТЦД50/мл (табл.3).
Пример 8. Репродукция штамма Азия-1/48 вируса ящура
При выращивании в клетках ЯДК-04 штамма Азия-1/48 вируса ящура на поддерживающей среде с 0,25-0,5% ГЛА или ФГБК-с получали урожай с титром 5,25-6,0 lg ТЦД50/мл.
В целях обеспечения жизнеспособности клеток в ходе продолжительной репродукции вирусов, за исключением вируса ящура, в поддерживающую среду вносили 2,5% сыворотки крови КРС.
Пример 9. Репродукция штамма 18 В вируса болезни Ауески
Вирус культивировали в течение 36-48 часов до максимального проявления цитолитического действия. Затем вирус собирали и титровали так, как описано в примере 1. Максимальный титр инфекционности достигал 8,25±0,25 lg ТЦД50/мл. При культивировании в других линиях клеток урожай вируса болезни Ауески имел следующие значения:
Пример 10. Репродукция вируса болезни Ауески в клетках ЯДК-04 и CG-91
Клетки обеих линий выращивали в среде Игла на растворе Хенкса с 0,25% ГЛА и 5% сыворотки крови КРС по методу, описанному в примере 1. Кроме того, культуру ЯДК-04 выращивали также в среде Игла на растворе Хенкса с 0,25% ГЛА и 10% сыворотки КРС.
При выращивании вируса болезни Ауески в двух указанных культурах по методу, описанному в примерах 1 и 9, установлено, что в клетках ЯДК-04 урожай был несколько выше (8,0-8,75 lg ТЦД50/мл), а значения титров инфекционности воспроизводились от опыта к опыту стабильнее, чем при использовании клеток CG-91 (табл.5).
Пример 11. Репродукция штамма 18 В вируса болезни Ауески
С клетками и вирусом обращались так же, как описано в примере 6. Штамм 18 В вируса болезни Ауески культивировали в течение 48-72 часов, при этом получали урожай с титром 8,0-8,75 (табл.4).
Пример 12. Репродукция штамма Ши-Мынь вируса классической чумы свиней
Вирус штамма Ши-Мынь классической чумы свиней получали с титром 5,5-6,0 lg ТЦД50/мл (табл.3, 7)
Пример 13. Репродукция штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец
С клетками и вирусом обращались так же, как описано в примере 1. Штамм «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец культивировали в течение 72 часов и получали урожай с титром 5,5-6,0 lg ТЦД50/мл (табл.4). Из полученного таким образом вируса изготавливали вакцину против оспы овец.
Пример 14. Репродукция пневмовируса серотипа В
С клетками обращались так, как описано в примере 1. Вирус культивировали в течение 48-72 часов и получали с титром 5,0±0,25 lg ТЦД50/мл (табл.6).
Кроме того, в нескольких сериях экспериментов было установлено, что клетки ЯДК-04, взятые на уровне от 21-го до 150-го пассажа, при их использовании в течение 10 последовательных пассажей обеспечивали репродукцию штаммов А22-663, O1-194, C1-564, Азия-1/48 вируса ящура с урожаем 5,0-6,5 lg ТЦД50/мл. Сведения о достигнутых титрах инфекционности для некоторых клеточных пассажей представлены в табл.3. Эти данные подтверждают возможность использования клеток ЯДК-04 для детектирования и выделения штаммов, относящихся к разным типам вируса ящура.
Проведены исследования по титрованию вируса ящура, вируса болезни Ауески (штамма 18 В), вируса оспы овец и пневмовируса птиц в культурах CG-91, ЯДК-04, ПСГК и СПЭВ. Результаты опытов, приведенные в табл.3, 4, свидетельствуют о том, что максимальная чувствительность к вирусу обеспечивается клетками ЯДК-04 в случае вируса болезни Ауески.
Урожай вируса болезни Ауески в монослое клеток ЯДК-04 на втором и третьем пассажах после их размораживания достигал уровня 8,0-8,5 lg ТЦД50/мл (табл.3).
Результаты исследований репродукции вируса ящура и вируса болезни Ауески в культуре ЯДК-04 с использованием различных поддерживающих сред представлены в табл.7. Эти данные подтверждают особенно высокую чувствительность линии клеток ЯДК-04 к вирусу болезни Ауески, что обеспечивает ее успешное применение в качестве средства диагностики данного заболевания и субстрата для выделения инфекционного агента и/или получения протективных вирусных антигенов.
Сравнительные исследования репродукции вируса болезни Ауески и пневмовируса птиц в родительской линии CG-91 и линии ЯДК-04 позволяют сделать вывод о статистически достоверном повышении урожая указанных вирусов, выращенных в клетках ЯДК-04, в сравнении с их урожаем, обеспеченным клетками CG-91 (табл.5, 6).
Таким образом, линия клеток гонад козы ЯДК-04 может быть использована для репродукции вирусов животных, относящихся к разным семействам.
Кинетические характеристики клеток ЯДК-04 на 136 пассаже в среде Игла с 0,25% ГЛА, 0,03% глютамина и 10% сыворотки крови КРС в матрасах емкостью 1500 мл
Репродукция вируса ящура, вируса болезни Ауески (БА), вируса оспы овец (BOO), пневмовируса (ПВ) птиц (lg ТЦД/50/мл) в клетках CG-91, ЯДК-04, ПСГК и СПЭВ
Репродукция и цитопатическое действие вируса ящура типов А, О, С, Азия-1; вируса болезни Ауески (БА); вируса классической чумы свиней (КЧС); вируса оспы овец (BOO) и пневмовируса (ПВ) птиц в клетках ЯДК-04, пассированных после размораживания
Репродукция вируса ящура (ВЯ), вируса болезни Ауески (БА), вируса оспы овец (BOO), пневмовируса (ПВ) птиц (lg ТЦД-50/мл.) в клетках CG-91, ЯДК-04, ПСГК, СПЭВ
Репродукция вируса болезни Ауески в клетках ЯДК-04 и CG-91 при оценке в 30 опытах (инфекционная активность в lg ТЦД50/мл / количество результатов в процентах от 30)
Репродукция пневмовируса птиц в клетках ЯДК-04 и CG-91 при оценке в 20 опытах (инфекционная активность в lg ТЦД50/мл / количество результатов в процентах от 20)
Репродукция вируса ящура, вируса классической чумы свиней (КЧС), пневмовируса (ПВ) птиц, вируса оспы овец (BOO) и вируса болезни Ауески (БА) в клетках ЯДК-04 с использованием среды Игла без гидролизата, либо с ГЛА или ФГБК-с (инфекционная активность вирусов в lg ТЦД50/мл)
Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. Получена линия клеток яичников козы Capra hircus L., депонированная в СХЖ РАСХН под №63. Линия предназначена для репродукции вирусов животных: вируса ящура типов А, О, Азия-1, вируса болезни Ауески, вируса оспы овец, вируса классической чумы свиней, пневмовируса птиц в целях их детектирования, выделения, проведения вирусологических исследований, а также для изготовления диагностических и профилактических ветеринарных препаратов. 7 табл.
Линия клеток яичников козы домашней Capra hircus L., депонированная 06.10.2004 г. в ВСКК СХЖ РАСХН под №63, для репродукции вирусов животных, характеризующаяся тем, что она
получена из клеток штамма CG-91, происходящего из тканей яичников козы домашней Capra hircus L., при адаптации названных клеток, взятых с посевной концентрацией менее 50 клеток/мл, к росту на среде Игла с солевым раствором Хенкса и сывороткой крови КРС;
образует неоднородную по кариологическим признакам популяцию клеток, в основном анеуплоидных, при этом доля клеток с 57-58 хромосомами составляет 20-22%, с 54-61 хромосомами 63-67%, с 115-123 хромосомами 7-9%;
при культивировании в монослое циклическим способом обеспечивает репродукцию вируса ящура типа А с титром 6,0-6,5 lg ТЦД50/мл, вируса ящура типа О с титром 5,0-5,5 lg ТЦД50/мл, вируса ящура типа Азия-1 с титром 5,25-5,5 lg ТЦД50/мл, вируса болезни Ауески с титром 8,0-8,5 lg ТЦД50/мл, вируса оспы овец с титром 5,75-6,25 lg ТЦД50/мл, вируса классической чумы свиней с титром 5,5-6,5 lg ТЦД50/мл, пневмовируса птиц с титром 5,0-5,5 ТЦД50/мл.
| ШТАММ ВНУТРИВИДОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК SUIS DOMESFICE, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ | 1994 |
|
RU2082758C1 |
| ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ГОНАД CAPRA HIRCUS L-ПРОДУЦЕНТ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ | 1994 |
|
RU2061753C1 |
| ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ SUIS DOMESTICA L. ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ | 1998 |
|
RU2140451C1 |
