СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ МЕЛАНОЦИТАРНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ КОЖИ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к дерматологии, онкологии, патологической анатомии, и может применяться для диагностики меланомы кожи в лабораторных центрах.

Существуют различные методы диагностики меланоцитарных новообразований. К прижизненным неинвазивным методам относится традиционная дерматоскопия, заключающаяся в том, что исследование пигментного новообразования кожи проводят с увеличением до х10, используя эффект эпилюминисценции при создании масляной среды между объектом исследования и дерматоскопом. Однако при использовании дерматоскопии в настоящее время остаются нерешенными проблемы дифференциальной диагностики диспластических невусов и меланомы in situ, выявления беспигментной меланомы, динамического наблюдения за группой высокого риска развития меланомы кожи, что требует продолжения научных исследований в данной области [Соколов Д.В. Дерматоскопия (эпилюминесцентная поверхностная микроскопия): in vivo диагностика меланомы кожи (обзор литературы) / Соколов Д.В., Махсон А.Н., Демидов Л.В. [и др.] // Сибирский онкологический журнал.- 2008. - №29. - С. 63-67].

Также используется гистологическое исследование, которое на настоящий момент является золотым стандартом для диагностической классификации меланоцитарных новообразований. Данный способ представляет собой исследование тканей, взятых во время диагностической процедуры или операции с последующим приготовлением гистологического препарата для изучения с помощью светового или электронного микроскопа состава исследуемой ткани, наличия или отсутствия патологических клеток. Однако, несмотря на то что гистологические критерии позволяют отнести большинство меланоцитарных опухолей либо к невусу, либо к меланоме, существуют так называемые неясные случаи [Sparrow, L.E. Differential expression of epidermal growth factor receptor in melanocyte tumours demonstrated by immunohistochemistry and mRNA in situ hybridization / L.E. Sparrow, P.J. Heenan // Australas J Dermatol. - 1999. - Vol. 40, №1. - P. 19-24]. Результаты гистологического исследования зависят от квалификации врача и возможностей диагностического центра, поэтому необходимы поиски альтернативных и более точных способов диагностики.

Другой современный способ для первичной и дифференциальной диагностики меланоцитарных поражений кожи на молекулярно-генетическом уровне проводят с помощью реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). [Hikita, Т. Immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization studies on noninvasive and invasive extramammary paget′s disease / T. Hikita, Y.Ohtsuki, T. Maeda [et al.] // International Journal of Surgical Pathology - 2012. - Vol. 20, №5. - P. 441-448.] Способ FISH-цитогенетический способ, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или интерфазных ядрах in situ. Данный способ является дорогостоящим и применяется для неясных случаев. Недостатки его - высокая трудоемкость для клинической лаборатории патологоанатомического профиля, субъективность оценки результатов без четких количественных критериев.

На данный момент актуальным является разъяснение молекулярных механизмов развития меланомы кожи. Идентифицированными регуляторами экспрессии генов на посттранскрипционном уровне являются так называемые микро-рибонуклеиновые кислоты (микроРНК) - малые некодирующие РНК длиной около 22 пар нуклеотидов, которые комплиментарно связываются с мРНК, вызывая ингибирование трансляции или разрушение мРНК. Каждый отдельный вид микроРНК может связываться с различными мРНК-мишенями, а также мРНК может находиться под регуляторным контролем сразу нескольких разновидностей микроРНК. [Segura M.F. MicroRNA and cutaneous melanoma: from discovery to prognosis and therapy. Carcinogenesis / M.F. Segura, H.S. Greenwald, D. Hanniford [et al.] // Oxford Journals - 2012. - Vol. 33, №10. - P. 1823-1832.] Одной из таких микроРНК является miR-205, которая работает как супрессор опухолевого роста. Известно, что в случае некоторых видов опухолей miR-205 индуцирует апоптоз и тормозит рост опухоли. Также miR-205 имеет значение в регуляции эпителиально-мезенхимальной трансформации и опухолевой инвазии [Cai J. MiR-205 targets PTEN and PHLPP2 to augment АКТ signaling and drive malignant phenotypes in non-small cell lung cancer/ J. Cai J, L. Fang, Y. Huang [et al.] // Cancer Res. - 2013. - Vol. 73, №17. P. 5402-5415].

Наиболее близким к предлагаемому является способ, в основу которого положено определение уровня экспрессии значимых микроРНК для диагностирования диспластического невуса и меланомы, включающий анализ образцов от пациентов с целью определения уровней экспрессии микроРНК (US patent 2013/0196869 A1, 01.08.2013). Однако данный способ является многоемким и дорогостоющим, так как необходимо определять большое число микроРНК.

Задача предлагаемого способа - оптимизация дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований кожи.

Поставленную задачу решают за счет того, что с исследуемым образцом проводят ПЦР в реальном времени по нормализующей микроРНК-SNRNA-U6, маркером дифференциальной диагностики является ген hsa-miR-205: при относительном уровне экспрессии от 0,29926 до 13,202 исследуемое меланоцитарное образование кожи является меланомой, а при относительном уровне экспрессии от 25,70993 до 1583,114 - невусом; при промежуточном интервале значений от 13,202 до 25,70993 необходимо проведение иммуногистохимического исследования биоптата с применением первичных антител к специфичным маркерам: S 100, НМВ 45, MART 1, MELAN A, CD-63, MITF.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Проводят забор исследуемой ткани (биоптата) у обследуемых лиц. Полученный биоптат подвергают стандартной фиксации в парафине для получения гистологических срезов, далее проводят нарезку срезов на микротоме.

Осуществляют выделение РНК по стандартному протоколу с помощью системы «Рибозоль-В» (AmpliSens, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора). Затем переходят к постановке реакции обратной транскрипции с праймером к микроРНК - hsa-miR-205 и нормализующей микро-РНК - snRNA-U6 (Applied Biosystems) для получения кДНК, чтобы исследовать относительный уровнь экспрессии микроРНК методом ПНР в реальном времени.

Амплификацию проводят на амплификаторе Applied Biosystems StepOne в 48-луночных планшетах в объеме по 20 мкл в каждой лунке, содержащем ПЦР буфер: 7.67 мкл безРНКазная вода, 1 мкл TagMan Small RNA Assay (20X), 10 мкл TagMan Master Mix, 1.33 мкл праймера hsa-miR-205 и snRNA-U6 в соответствующие лунки. Условия ПЦР следующие: 50°C - 2 мин, 95°C - 10 мин и 40 циклов: 95°C - 15 с, 60°C - 1 мин.

Содержание микроРНК в исследуемом образце вычисляем как относительный уровень экспрессии по формуле: 2^-ΔСТ, где ΔСТ=(CT miR-205 - CT U6RNA). [Chan, SH. MiR-21 MicroRNA Expression in Human Gastric Carcinomas and its Clinical Association/ SH. Chan, CW. Wu, AF. Li //Anticancer Research - 2008. - №28. - P. 907-912.]

Статистическую обработку проводили между двумя группами при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни (программа Statistics 7). Для исследуемой микроРНК (miR-205) выявлены достоверно значимые различия для этих групп (меланома и невус): значительное снижение уровня экспрессии miR-205 в меланоме по сравнению с невусом.

При относительном уровне экспрессии miR-205 от 0,29926 до 13,202 исследуемое меланоцитарное образование кожи является меланомой, а при относительном уровне экспрессии miR-205 от 25,70993 до 1583,114 является невусом (см. табл. 1). В таблице представлены группы исследуемых образцов, их количество и числовые значения для относительных уровней экспрессии микроРНК в меланомах и невусах.

Таблица Относительный уровень экспрессии miR-205 в невусе и меланоме Группа исследуемого биоптатного образца Количество образцов Относительный уровень экспрессии miR-205 невус 16 (25,709-1583,114) меланома 57 (0,29926-13,202)

Предлагаемый способ диагностики является более быстрым и менее затратным.

Пример 1. Пациент А., 50 лет, обратился в Красноярский краевой онкологический диспансер с предварительным диагнозом меланома кожи голени. Произведено хирургическое иссечение, полученный биоптат исследуемой ткани подвергли стандартному способу фиксации для получения гистологических срезов.

Гистологическое заключение онкологического диспансера: пигментная узловая меланома, III стадия по Кларку, по Бреслоу 4 мм.

Одномоментно с полученным биоптатом проведено исследование методом ПЦР в реальном времени.

Заключение ПЦР в реальном времени: уровень экспрессии miR-205=8,123, данное значение относительного уровня экспрессии свидетельствует о том, что исследуемое образование является меланомой кожи.

Пример 2. Пациент П., 38 лет, поступил в Красноярский краевой онкологический диспансер с предварительным диагнозом пигментный невус кожи спины. Произведено хирургическое иссечение, полученный биоптат исследуемой ткани подвергся стандартной методике фиксации для получения гистологических срезов.

Гистологическое заключение: картина сложного пигментного невуса с папилломатозом, гиперкератозом плоского эпителия.

Одномоментно с полученным биоптатом проведено исследование методом ПЦР в реальном времени.

Заключение ПЦР в реальном времени: уровень экспрессии miR-205=124,809, данное значение относительного уровня экспрессии свидетельствует о том, что исследуемое образование является невусом.

Пример 3. Пациент О., 27 лет, поступил в Красноярский краевой онкологический диспансер с предварительным диагнозом пигментный невус кожи правой молочной железы. Произведено хирургическое иссечение, полученный биоптат исследуемой ткани подвергся стандартной методике фиксации для получения гистологических срезов.

Гистологическое заключение: участки кожи с наличием в дерме гнезд тяжей невусных клеток с гранулами пигмента в цитоплазме. Строение внутридермального невуса.

Одномоментно с полученным биоптатом была выполнена амплификация методом ПЦР в реальном времени.

Заключение ПЦР в реальном времени: уровень экспрессии miR-205=22,809, данное значение относительного уровня экспрессии попадает в промежуточный интервал значений, поэтому в этом случае дополнительно проведено иммуногистохимическое исследование, которое показало отсутствие положительной иммуногистохимической реакции на специфические маркеры: S 100, НМВ 45, MART 1, MELAN A, CD-63, MITF, следовательно, данное образование является невусом.

На примере пациента А. и пациента П. видно, что проведенные исследования подтверждают гистологические заключения, что говорит о достоверности поставленного нами диагноза. Пример пациента О., свидетельствует о том, что, если относительный уровень экспрессии miR-205 попадает в промежуточный интервал значений, то для постановки диагноза необходимо дополнительное проведение иммуногистохимического исследования биоптата по стандартной методике с применением первичных антител к специфичным маркерам: S 100, НМВ 45, MART 1, MELAN A, CD-63, MITF.

Предлагаемый способ позволяет в кратчайшие сроки и с наименьшими затратами устанавливать диагноз при меланоцитарных новообразований кожи.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований кожи. Способ включает получение биоптата исследуемого новообразования кожи, затем с исследуемым образцом проводят ПЦР в реальном времени для количественного определения относительного уровня экспрессии микроРНК по нормализующей микро-РНК - snRNA-U6, при этом маркером дифференциальной диагностики является ген hsa-miR-205. При относительном уровне экспрессии от 0,29926 до 13,202 исследуемое меланоцитарное образование кожи является меланомой, а при относительном уровне экспрессии от 25,70993 до 1583,114 - невусом; при промежуточном интервале значений от 13,202 до 25,70993 необходимо проведение иммуногистохимического исследования биоптата с применением первичных антител к специфичным маркерам: S 100, НМВ 45, MART 1, MELAN A, CD-63, MITF. Использование изобретения позволяет оптимизировать и ускорить дифференциальную диагностику меланоцитарных новообразований кожи. 1 табл., 3 пр.

Способ дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований кожи, включающий получение биоптата исследуемого новообразования кожи, отличающийся тем, что с исследуемым образцом проводят ПЦР в реальном времени для количественного определения относительного уровня экспрессии микроРНК по нормализующей микроРНК - snRNA - U6, при этом маркером дифференциальной диагностики является ген hsa-miR-205: при относительном уровне экспрессии от 0,29926 до 13,202 исследуемое меланоцитарное образование кожи является меланомой, а при относительном уровне экспрессии от 25,70993 до 1583,114 - невусом; при промежуточном интервале значений от 13,202 до 25,70993 необходимо проведение иммуногистохимического исследования биоптата с применением первичных антител к специфичным маркерам: S 100, НМВ 45, MART 1, MELAN A, CD-63, MITF.