Способ диагностики неалкогольного стеатоза печени на основе определения микроРНК в плазме крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к гепатологии, гастроэнтерологии, патофизиологии, и может быть использовано для диагностики неалкогольного стеатоза печени.

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) становится одним из наиболее распространенных хронических заболеваний печени во всем мире, поражающим 25% населения мира. Данная патология проявляется жировой дистрофией печени и способна прогрессировать до неалкогольного стеатогепатита, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы. Прогрессия заболевания значительно ухудшает качество жизни, приводя к инвалидизации и смертности [1]. В России НАЖБП занимает ведущее место среди внутренних болезней [2].

Наличие избыточной массы тела или ожирения в висцеральной области, приводит к чрезмерной гипертрофии адипоцитов, что обуславливает неспособность жировой ткани хранить и мобилизовать липиды и характеризуется системной липидной перегрузкой в печени, мышцах и сосудах [3]. Так, согласно современным представлениям, неалкогольный стеатоз формируется в печени пациентов на фоне дисрегуляции липидного профиля. Избыток свободных жирных кислот в кровотоке запускает липогенез de novo, приводя к чрезмерной липидной инфильтрации гепатоцитов.

Формирование системной гипергликемии, гиперинсулинемии и инсулинорезистентности в условиях ожирения способствуют прогрессии неалкогольного стеатоза печени в неалкогольный стеатогепатит, ассоциированный с развитием лобулярного и портального воспаления, баллонной дистрофии гепатоцитов и некрозу клеток органа.

Исследованием, необходимым для постановки диагноза - неалкогольная жировая болезнь печени в настоящее время является инвазивный и непрактичный метод взятия биопсии для проведения гистологического анализа. Несвоевременная диагностика проводит к прогрессии патологии, значительно ухудшает качество жизни и налагает серьезное социально-экономическое бремя на государство. В связи с этим, возникаетнеобходимость в диагностике данного заболевания на ранних этапах и выявление новых диагностических маркеров, возможных мишеней для терапии НАЖБП и ее осложнений.

В большинстве случаев клинические проявления НАЖБП отсутствуют и появляются на поздних стадиях (фиброз). Различное течение и прогрессия НАЖБП могут быть связаны с микроРНК-зависимой эпигенетической регуляцией [4].

МикроРНК регулируют практически все биологические процессы в метаболически активных тканях. Поэтому их дерегуляция может служить важным индикатором патологии в этих органах [5].

Они имеют большой потенциал в качестве диагностических и терапевтических мишеней при патологиях в органах и тканях за счет секреции в системный кровоток и достаточно высокой стабильности в ней [6].

По результатам скрининговых исследований и биоинформатического анализа было показано, что hsa-miR-423-5p обладает значительным потенциалом для диагностики неалкогольной жировой болезни и печени и свидетельствует о нарушениях на уровне органа [4, 7].

Известен «СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ СИНДРОМЕ (RU 2803945, С1 22.09.2023)» основаный на определении концентрации аммиака в капиллярной крови пациента и используется для диагностики стадий неалкогольной жировой болезни печени.

К недостатку данного способа относится невысокая специфичность выбранного аналита. Кроме этого, авторы не приводят данные о показателях чувствительности и специфичности данного способа. Так, аммиак образуется во всех тканях, где происходит белковый обмен. Из желудочно-кишечного тракта поступает большая часть аммиака в системный кровоток, порядка 75%. Следует отметить, что нарушение детоксицирующей функции печени наблюдается при значительном поражении паренхимы печени с формированием печеночной недостаточности, что и проявляется увеличением концентрации аммиака, из-за неспособности печени превращать аммиак в мочевину в орнитиновом цикле. Кроме этого, гиперазотемия является результатом дерегуляции работы печени или почек.

Существует «СПОСОБ СКРИНИНГОВОЙ ДИАГНОСТИКИ ЖИРОВОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ ПЕЧЕНИ ПРИ АБДОМИНАЛЬНОМ ОЖИРЕНИИ (RU 2684201 С1 04.04.2019)». Определение окружности талии и детекция в крови уровня триглицеридов, АЛТ, глюкозы натощак, холестерина липопротеидов высокой плотности - ХсЛПВП необходимы для того, что рассчитать показатель стеатоза печени для мужчин и дляженщин. Недостатками данного способа являются подтверждение диагноза на основе результатов УЗИ исследования и биохимических показателей: УЗИ является малоэффективным методом диагностики; полученные в ходе его выполнения данные не позволяют оценить морфофункциональные изменения и, в конечном итоге, точно поставить диагноз НАЖБП.

Наиболее близким, прототипом, является «МАЛОИНВАЗИВНЫЙ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ НА ОСНОВЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОРНК И MIP1β ПЛАЗМЕ КРОВИ» (RU 2798163, 16.06.2023). Для подсчета коэффициента НАЖБП используют значения экспрессии микроРНК miR-423-5p и let-7a-5p и определяют уровень MIP-1β методом в плазме крови больных ожирением. Недостатками данного способа является незначительный размер выборки (n=8); детекция неспецифического маркера (MIP-1B), свидетельствующего о наличии воспалительного процесса.

Поставленной задачей является создание эффективного способа подтверждения диагноза - неалкогольная жировая болезнь печени, основанного на получении антропомерических параметров, необходимых для расчета ИМТ и на измерении в крови уровней глюкозы фотометрическим методом и уровня экспрессии hsa-miR-423-5p методом ПЦР, которые в совокупности, позволят судить о нарушении работы органа.

Технический результат изобретения состоит в малоинвазивности и уточнении, или возможности диагностики неалкогольного стеатоза печени.

Сущность способа заключается в проведении физикального осмотра, клинико-лабораторных методов исследования и внесения полученных данных в разработанную формулу, с последующей оценкой показателя, свидетельствующего о наличии/отсутствии неалкогольного стеатоза печени при ожирении.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в определении комплекса значимых показателей, который обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

На Фиг. 1 показан анализ ROC-кривой для оценки диагностики стеатоза с учетом выявленных показателей (ИМТ, уровень hsa-miR-423-5p, глюкоза натощак).

В данном изобретении нам удалось увеличить выборку участников исследования и провести для каждого пациента гистологический анализ для подтверждения диагноза, а также соотнести уровень экспрессии микроРНК в ткани печени с его плазменным содержанием. Повышение плазменного уровня микроРНК в плазме крови при развитии неалкогольного стеатоза печени подтверждается результатами гистологического анализа ипозволит проводить малоинвазивную диагностику в медицинских учреждениях, исключая необходимость взятия биопсии ткани печени.

Проведен гистологический анализ 58 биопсий: группу контроля составили 27 условно здоровых лиц, НАЖБП на стадии стеатоза диагностирована у 31 пациента.

На Фиг. 2. показан уровень hsa-miR-423-5p в плазме крови пациентов без патологии и с НАЖБП на стадии стеатоза.

Так, при использовании трех параметров (ИМТ, уровень глюкозы натощак, уровень hsa-miR-423-5p) позволило сформировать более эффективную систему, AUC которой равен 0,8413 (95% CI: 0,7147-0,9678, р=0,0002). Данная тест система работает при сложении трех показателей: уровень hsa-miR-423-5p, глюкозы натощак и ИМТ пациента. При значении показателя равном и более 27,58 усл. ед. - диагностируют наличие неалкогольного стеатоза с чувствительностью (85,71%) и специфичностью (76,19%).

Детекция микроРНК может быть осуществлена методом ПЦР в режиме реального времени, измерение концентрации глюкозы - фотометрическим методом, определение ИМТ рассчитывается по стандартной формуле.

Способ осуществляется следующим образом:

1) Анализ уровня экспрессии hsa-miR-423-5p

Образцы плазмы крови и тотальной РНК хранить при температуре -80°С до последующего использования. Получение тотальной РНК из плазмы крови, используя методику выделения нуклеиновых кислот с магнитными частицами MagMAX или MagPure (Thermo Fisher Scientific, США Magen, Китай), согласно протоколу производителя. Полученные препараты РНК использовать для синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции с использованием набора реагентов MicroRNA Reverse transcription kit (Thermo Fisher Scientific, США), которая служит матрицей для проведения стандартной ПЦР в реальном времени, с использованием технологии TaqMan, по программе амплификации: 30 мин 16°С, 30 мин 42°С, 5 мин 85°С.Объем реакции обратной транскрипции 15 мкл. Для нормализации данных использовать синтетический олигонуклеотид Arabidopsis thaliana ath-miR-159a (М10000189, Invitrogen), как описано в [8], добавить в реакционную смесь в количестве 0,932 нг. Далее выполнить ПЦР с использованием реагентов TaqMan Universal Master Mix II, no UNG и специфических праймеров TaqMan® MicroRNA assay, согласно протоколу производителя. Протокол для амплификации: 95°С 10 мин один раз для активации полимеразы, 40 циклов денатурации и элонгации 95°С 15 сек и 60°С 1 мин (на данном этапе происходит считывание флуоресцентного сигнала с реакции). Объем реакционной смеси 20 мкл.

2) Определение уровней глюкозы

Определение концентрации глюкозы проводили на автоматическом биохимическом анализаторе Furuno СА-180 (Furuno Electric Company, Япония) с использованием тест-систем DiaSys (DiaSys Diagnostic Systems, Хольцхайм, Германия) фотометрическим методом. Принцип метода основан на реакции Триндера. Соединение хинонимин или хинониминовый краситель изменяет цвет реакционной смеси. Интенсивность окраски реакционной смеси прямо пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Диапазон референсных значений в сыворотке крови - 4,1-6,1 мМоль/л.

3) Определение ИМТ

Измеряют рост (см), массу (кг) и определяют индекс массы тела (ИМТ) (кг/м²) по следующей формуле: ИМТ=масса, кг/рост, м².

Оборудование:

1) Амплификатор CFX96 («BioRad», США) со стандартным программным обеспечением, магнитный планшет, дозаторы на 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 1000 мкл; микропробирки типа эппендорф на 0,2 и 1,5 мл.

Реактивы: Набор для выделения суммарной РНК, в том числе микроРНК с использованием технологии магнитов (Thermo Fisher Scientific, США или Magen); для специфической обратной транскрипции, необходимой для получения кДНК использовали набор Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, США); для проведения количественной ПЦР использовали реагент Applied Biosystems TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (Thermo Fisher Scientific, США) и специфические зонды TaqMan MicroRNA Assay (Thermo Fisher Scientific, США). Реактивы хранят при температуре от +4°С до -20°С.

2) Автоматический биохимический анализатор FC-180 (FURUNO ELECTRIC CO., LTC, Япония) или аналог. Дозаторы на 10 мкл, 100 мкл, 200 мкл, 1000 мкл («Sartorius», Германия или «Accumax», Индия); микропробирки типа эппендорф на 0,2 и 1,5 мл.

Реактивы: набор реагентов «Glucose God FS (DiaSys, Германия или аналог)». Реактивы хранят при температуре +4°С.

3) Ростомер медицинский Р-Сс-«МСК» (МСК 233) (МЕДСТАЛЬКОНСТРУКЦИЯ», Россия), весы медицинские (Мид, Россия).

Материал исследования: венозная кровь и биоптаты печени больных ожирением с метаболическими нарушениями. Диагноз ожирение и СД 2 типа был установлен врачомэндокринологом в условиях стационара; НАЖБП диагностировали по результатам биопсии печени.

В исследование вошли 58 пациентов, у которых были сделаны: гистологический анализ биоптатов печени, клинико-диагностический анализ (биохимия и антропометрия), анализ уровня has-miR-423-5p в плазме крови.

Все пациенты с ожирением прекращали прием лекарственных препаратов, влияющих на параметры углеводного и липидного обменов за 36 часов до оперативного вмешательства. Забор ткани печени объемом до 0,5 см³ осуществлялся вовремя во время плановых бариатрических и рутинных лапароскопических операций (паховая грыжа справа или слева, бедренная, диафрагмальная и вентральная грыжи, нефроптоз) у исследуемых групп для гистологических и молекулярных исследований.

Критериями исключения были: наличие инфекционных заболеваний печени; острые и тяжелые хронические соматические и инфекционные сопутствующие заболевания; длительный прием гиполипидемических препаратов; наличие новообразований добро- и злокачественной природы; пациенты, отказавшиеся от медицинского и лабораторного контроля во время исследования.

Статистическая обработка полученных результатов была осуществлена с помощью программы GraphPad Prism 9.3.1. Полученные данные о профиле экспрессии были трансформированы в логарифмы по степени 10 для приведения данных к нормальному распределению. Далее гипотеза о равенстве выборочных средних была проверена с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляции рассчитывались по методу Пирсона для непрерывных данных и по Спирману для дискретных данных (гистологические баллы). Различия считались значимыми при р<0,05.

Для разработки формулы были использованы показатели, которые имели сильные взаимосвязи между собой. Так, уровень hsa-miR-423-5p достоверно повышался в плазме у лиц с диагнозом стеатоз, который подтверждался данными гистологического анализа. Наличие неалкогольного стеатоза печени коррелировало с уровнем глюкозы натощак (r=0,333 при р=0,0114) в плазме крови и ИМТ (r=0,533 при р<0,0001).

Для оценки диагностического потенциала уровней плазменной miR-423-5p, для предсказания стеатоза у пациентов был проведен анализ ROC («receiver operating characteristic», т.н. «рабочая характеристика приемника»). AUC («агеа under curve», площадь под кривой) предлагаемой тест-системы равен 0,8413 (95% CI: 0,7147-0,9678, р=0,0002). По индексу Юдена был определен оптимальный показатель, равный 27,58 усл.ед., при нем достигаются оптимальные значения как чувствительности (85,71%), так и специфичности (76,19%) теста.

Формулу для расчета показателя неалкогольного стеатоза: показатель стеатоза=47+8,0+(-5,9), где 47 - индекс массы тела пациента, 8,0 - уровень глюкозы натощак; -5,9 - уровень экспрессии hsa-miR-423-5p, нормализованный на ath-miR-159a.

При значении показателя/порога равном и более 27,58 усл.ед. - диагностируют наличие неалкогольного стеатоза печени с чувствительностью (85,71%) и специфичностью (76,19%). Такое значение порога дает оптимальное сочетание чувствительности и одновременно специфичности. При значении показателя менее 27,58 усл.ед. стеатоз имеют лишь 14% пациентов (таблица 2).

Примеры практического выполнения предложенного способа.

Пример 1. Больной X, женщина, 59 лет, ИМТ равен 30,0 кг/м², что соответствует первой степени ожирения. В анамнезе верифицированные диагнозы: постхолецистэктомический синдром, стаз холедоха. Алкоголем пациентка не злоупотребляет. Уровень глюкозы в крови у пациентки натощак: 5,23 ммоль/л.

Применение предложенного способа: значения уровня экспрессии miR-423-5p: -5,28 усл.ед. экспрессии.

Коэффициент стеатоза=30,0+5,23+(-5,28)=29,95 усл.ед., что выше 27,58. Это свидетельствует о высоком риске (свыше 85%) наличия у пациентки стеатоза.

Гистологический анализ биоптата печени подтверждает, что печень пациентки содержит более 5% липидных включений, что является признаком стеатоза первой степени.

Пример 2. Больной Y, женщина, 67 лет, ИМТ равен 30,9 кг/м², что соответствует первой степени ожирения. Диагноз желчнокаменная болезнь, послеоперационная вентральная грыжа, сахарный диабет 2 типа. Алкоголем пациентка не злоупотребляет. Уровень глюкозы в крови у пациентки натощак: 3,25 ммоль/л.

Применение предложенного способа: значения уровня экспрессии miR-423-5p: -6,87 усл.ед. экспрессии.

Коэффициент стеатоза=30,9+3,25+(-6,87)=27,28 усл.ед., что ниже 27,58. Это свидетельствует об отсутствии высокого риска наличия у пациентки неалкогольного стеатоза печени.

Гистологический анализ биоптата печени подтверждает, что липидные включения составляют менее 5% от площади печени пациентки, что говорит об отсутствии у нее стеатоза.

Список использованной литературы:

1. Younossi Z. М., Marchesini G., Pinto-Cortez Н., Petta S. Epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis: implications for liver transplantation. Transplantation 2019, 103, 22-27. doi: 10.1097/TP.0000000000002484

2. Лазебник Л.Б., Голованова Е.В., Туркина С.В., Райхельсон К.Л., Оковитый С.В., Драпкина О.М., Маев И.В., Мартынов А.И., Ройтберг Г.Е., Хлынова О.В., Абдулганиева Д.И., Алексеенко С.А., Ардатская М.Д., Бакулин И.Г., Бакулина Н.В., Буеверов А.О., Виницкая Е.В., Волынец Г.В., Еремина Е.Ю., Гриневич В.Б., Долгушина А.И., Казюлин А.Н., Кашкина Е.И., Козлова И.В., Конев Ю.В., Корочанская Н.В., Кравчук Ю.А., Ли Е.Д., Лоранская И.Д., Махов В.М., Мехтиев С.Н., Новикова В.П., Остроумова О.Д., Павлов Ч.С, Радченко В.Г., Самсонов А.А., Сарсенбаева А.С, Сайфутдинов Р.Г., Селиверстов П.В., Ситкин С.И., Стефанюк О.В., Тарасова Л.В., Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П., Фоминых Ю.А., Хавкин А.И., Цыганова Ю.В., Шархун О.О. Неалкогольная жировая болезнь печени у взрослых: клиника, диагностика, лечение. Рекомендации для терапевтов, третья версия. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2021, 1, 4-52. https://doi.org/l0.31146/1682-8658-ccg-185-1 -4-52

3. Lee Е., Korf Н., Vidal-Puig A. An adipocentric perspective on the development and progression of non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 2023, 78, 1048-1062. doi: 10.1016/j.jhep.2023.01.024.

4. Vulf M., Shunkina D., Komar A., Bograya M., Zatolokin P., Kirienkova E., Gazatova N., Kozlov I., Litvinova L. Analysis of miRNAs profiles in serum of patients with steatosis and steatohepatitis. Front Cell Dev Biol. 2021, 9, 9:736677. doi: 10.3389/fcell.2021.736677.

5. Vulf M., Khlusov I., Yurova K., Todosenko N., Komar A., Kozlov I., Malashchenko V., Shunkina D., Khaziakhmatova O., Litvinova L. MicroRNA Regulation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in the Development of Osteoporosis in Obesity. Front Biosci (ScholEd). 2022, 23, 14(3): 17. doi: 10.31083/j.fbsl403017.

6. Muth, D.C, Powell, B.H., Zhao, Z. Witwer KW. miRNAs in platelet-poor blood plasma and purified RNA are highly stable: a confirmatory study. BMC Res Notes. 2018, 11, 273. https://doi.org/10.1186/sl3104-018-3378-6

7. Vulf M., Bograya M., Komar A., Khaziakhmatova O., Malashchenko V., Yurova K., Sirotkina A., Minchenko A., E. Kirienkova E., N. Gazatova N., Litvinova L. NGR4 and ERBB4 as Promising Diagnostic and Therapeutic Targets for Metabolic Disorders. Front. Biosci. (Elite Ed). 2023, 15(2), 14. https://doi.org/10.31083/i.fbel502014

8. Kupec Т., Bleilevens A., Iborra S., Najjari L., Wittenborn J., Maurer J., Stickeler E. Stability of circulating microRNAs in serum. PLoS One. 2022, 31, 17(8): e0268958. doi: 10.1371 /journal.pone.0268958.

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ диагностики неалкогольного стеатоза печени на основе определения микроРНК в плазме крови, при котором рассчитывают индекс массы тела, определяют уровень экспрессии hsa-miR-423-5p методом ПЦР в режиме реального времени и концентрацию глюкозы натощак фотометрическим методом. Для определения показателя неалкогольного стеатоза полученные данные подставляют в формулу для расчета показателя неалкогольного стеатоза и при значении показателя, равном и более 27,58 усл.ед. - диагностируют наличие неалкогольного стеатоза. Технический результат изобретения состоит в малоинвазивности и уточнении, или возможности диагностики неалкогольного стеатоза печени. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ диагностики неалкогольного стеатоза печени на основе определения микроРНК в плазме крови, при котором рассчитывают индекс массы тела, определяют уровень экспрессии hsa-miR-423-5p методом ПЦР в режиме реального времени и концентрацию глюкозы натощак фотометрическим методом; для определения показателя неалкогольного стеатоза полученные данные подставляют в формулу для расчета показателя неалкогольного стеатоза: показатель неалкогольного стеатоза=47+8,0+(-5,9), где 47 - индекс массы тела пациента, 8,0 - уровень глюкозы натощак, -5,9 - уровень экспрессии hsa-miR-423-5p, нормализованный на ath-miR-159a; при значении показателя, равном и более 27,58 усл.ед. - диагностируют наличие неалкогольного стеатоза с чувствительностью (85,71%) и специфичностью (76,19%); при этом способ является малоинвазимным за счет детекции маркеров в крови пациента.