НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2015 года по МПК A61K31/351 A61K31/19 A61P25/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине и фармакологии, а именно средствам для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением мозга.

Ишемические поражения головного мозга являются важнейшими медицинской и социальной проблемами в связи с высокой их распространенностью и тяжелыми последствиями для состояния здоровья населения. Предотвращение прогрессирования этих заболеваний является одной из ключевых задач неврологии [Смирнова И.Н., Федорова Т.Н., Танашян М.М., Суслина З.А. Клиническая эффективность и антиоксидантная активность Мексидола при хронических цереброваскулярных заболеваниях // Нервные болезни. 2006. - №1. - С. 33-36]. Эффективным подходом к снижению ишемического повреждения считается воздействие на эксайтотоксические механизмы повреждения нервной ткани: блокада глутаматных рецепторов с помощью прямых ингибиторов, воздействие на ионный гомеостаз, применение антиоксидантов и подавление активных форм кислорода [Суслина З.А., Максимова М.Ю. Концепция нейропротекции: новые возможности ургентной терапии ишемического инсульта. Симпозиум НИИ неврологии РАМН «Лечение ОНМК: состояние проблемы» // Нервные болезни. - 2004. - №3. - С. 4-7]. В соответствии с вышеизложенным для предотвращения распространения необратимых ишемических повреждений, способствующих развитию нейродегенеративных заболеваний человека (мозговые инсульты, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и прочие) в последнее время рассматривается необходимость разработки и применения нейропротекторных лекарственных средств, избирательно корригирующих эти процессы, способных препятствовать чрезмерному накоплению радикалов и поддерживать собственную антиоксидантную систему организма.

Известно применение лекарственного средства Мемантин (химическое название - 3,5-диметил-1-адамантанамин (в виде гидрохлорида)), он действует как неконкурентный антагонист NMDA-рецепторов с высокой селективностью и низкой аффинностью. Мемантин является одним из немногих низкоаффинных терапевтических агентов, использующихся в клинической практике. Обладает ноотропным, церебровазодилатирующим, противогипоксическим и психостимулирующим действием. Клинические исследования показали, что мемантин (20 мг/сут) эффективен при умеренной и тяжелой стадиях болезни Альцгеймера, смешанной деменция всех степеней тяжести, болезни Паркинсона. [Lipton S.A. Paradigm shift in neuroprotection by NMDA receptor blockade: memantine and beyond //Nat Rev. 2006. Vol. 5. P. 161-170; Reisberg В., Doody R., Stoffler A., Schmitt F., Ferris S., Mobius H.J. Memantine in moderate-to-severe Alzheimer′s disease //N. Engl. J. Med. 2003. Vol. 348. P. 1333-1341]. Обладает побочным действием: головокружение, повышенная возбудимость, усталость, повышение внутричерепного давления, тошнота. Меры предосторожности: с осторожностью применять во время работы водителям транспортных средств и людям, профессия которых связана с повышенной концентрацией внимания [http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_2206.htm].

Известен лекарственный препарат Нимодипин (Nimodipine) (химическое название - 3-(метоксиэтил) 5-пропан-2-ил 2,6-диметил-4-(3-нитрофенил)-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоновая кислота). Нимодипин является эффективным церебральным блокатором Са²⁺, избирательно блокирующим потенциал зависимые Са²⁺ L-каналы [Dorhout Mees S.M., Rinkel G.J., Feigin V.L., et al. Calcium antagonists for aneurysmal subarachnoid haemorrhage // Cochrane Database Syst. Rev. 2007. Vol. 18. N 3. P. CD000277]. Применяется при ишемическом нарушении мозгового кровообращения (в т.ч. при гипертоническом кризе), неврологических расстройствах, возникающих вследствие спазма сосудов головного мозга, обусловленного субарахноидальным кровоизлиянием, сенильной деменцией. Имеет противопоказания: гиперчувствительность, выраженная гипотензия, отек мозга, повышенное внутричерепное давление, тяжелые нарушения функции печени, оказывает побочные действия: гипотензия, спазм периферических сосудов, гипертензия, анемия и тромбоцитопения и другие. [Нимодипин (Nimodipine): инструкция, применение и формула http://www.rlsnet.m/mnn_index_id_1024.htm#protivopokazaniya].

Известно применение лекарственного препарата мексидол (3-окси-6-метил-2-этилпиридин сукцинат). Действие мексидола заключается в антиоксидантном и мембранопротекторном эффектах. Мексидол существенно уменьшает повреждение липопротеиновых структур, восстанавливая активность эндогенной антиоксидантной системы [Смирнова И.Н., Федорова Т.Н., Танашян М.М., Суслина З.А. Клиническая эффективность и антиоксидантная активность мексидола при хронических цереброваскулярных заболеваниях // Нервные болезни. - 2006. - №1. - С. 33-36]. Рекомендуется соблюдать осторожность при отеке мозга и остром повышении внутричерепного давлении, а также при нарушении функции почек. Не следует назначать препарат внутрь одновременно с его инфузией. Не рекомендуется применять при беременности [Универсальный справочник лекарственных средств [http://lekarstwo.ru/preparati/nimodipine.htm].

Известно применение пантогама (кальциевая соль гопантеновой кислоты). Пантогам (Pantogamum) относится к ноотропным препаратам смешанного типа с широким спектром показаний к клиническому применению. По химической структуре пантогам представляет собой кальциевую соль D(+)-пантоил-γ-аминомасляной кислоты и является высшим гомологом D(+)-пантотеновой кислоты (витамина B₅), в которой β-аланин замещен на ГАМК. Механизм действия препарата обусловлен прямым влиянием пантогама на ГАМКБ-рецептор-канальный комплекс. Он также оказывает активирующее влияние на синтез ацетилхолина. Пантогам обладает ноотропным и противосудорожным действием, повышает устойчивость мозга к гипоксии и воздействию токсических веществ, стимулирует анаболические процессы в нейронах, сочетает умеренное седативное действие с мягким стимулирующим эффектом, уменьшает моторную возбудимость, активирует умственную и физическую работоспособность. Перспективным представляется применение пантогама для профилактики и лечения цереброваскулярных заболеваний, у больных, перенесших инсульт и черепно-мозговую травму, при эпилепсии и ряде других показаний. Обладает побочным действием: возможны аллергические реакции: ринит, конъюнктивит, кожные высыпания; возможны нарушения сна или сонливость, шум в ушах [Бадалян О.Л., Бурд С.Г., Савенков А.А., Тертышник О.Ю., Юцкова Е.В. Возможности применения пантогама в практике невролога / ФАРМАТЕКА для практикующих врачей. Архив журнала/ 2006. - № s2-06. С52-56; http://www.pharmateca.ru/ru/archive/article/6708].

Наиболее близким аналогом является коменовая кислота (5-гидрокси-γ-пирон-2-карбоновая)

Коменовая кислота обладает антиоксидантным и нейротропным свойствами. Оказывает выраженный ростстимулирующий эффект на культуры нейронов коры головного мозга, пренатально стрессированных животных [Шурыгин А.Я. Препарат бализ. Краснодар. - 2002. - 416 с. ], обладает мягким седативным действием, не вызывающим привыкания [патент РФ на изобретение №2209062, МПК (7) A61K 31/351, А61Р 25/20], является высокоэффективным ненаркотическим анальгетическим средством, не имеющим негативных побочных эффектов, не вызывающих зависимости и привыкания, приводящий к долговременному снятию болевого синдрома [патент РФ на изобретение №2322977, МПК A61K 31/351 (2006.01), А61Р 29/02 (2006.01)]. Обладает антиабстинентным, анксиолитическим и антидепресантными свойствами [Панова Т.И. Механизмы влияния коменовой кислоты на интегративную деятельность мозга // Теоретическая экспериментальная медицина. Медицина сегодня и завтра. - 2005. - №1. - С. 28-33].

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в применении кальцевой соли коменовой кислоты (комената кальция) для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением мозга.

Технической задачей является расширение арсенала высокоэффективных антиоксидантных стресс - и нейропротекторных средств.

Для достижения технического результата предлагается применять кальциевую соль коменовой кислоты для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением мозга один раз ежедневно перорально натощак в течение 3-х суток.

Известно, что коменат кальция - комплексное соединение коменовой кислоты с ионами кальция, твердое вещество с установленным составом и строением [Пирогова А.Н. Синтез, строение и свойства соединений коменовой кислоты с некоторыми щелочными и щелочноземельными элементами. Автореф. дисс. канд. хим. наук. Краснодар.- 2011. - 20 с]. Фармакологические свойства комената кальция не изучались.

Кальциевую соль коменовой кислоты получают смешением раствора коменовой кислоты, подогретого до температуры 60°C±5°C с реагентом гидроксида кальция, взятых в стехиометрических соотношениях до значений pH раствора ≈ 4,6 и окрашивания раствора в желтый цвет и выделением кальциевой соли коменовой кислоты из раствора отгонкой воды под вакуумом.

Известно, что кальций, основной внеклеточный двухвалентный катион, обладает высокой биологической активностью, выполняет в организме многообразные функции. Ионы кальция обеспечивают физиологическую регуляцию проведения нервного импульса, участвуя в поддержании трансмембранного электрического потенциала, в осуществлении рецептор-эффекторных реакций (через систему протеинкиназы и кальмодулина), в поддержании оптимального уровня нейропластичности нейронов (способности к адаптации путем активации роста дендритов и образования новых синапсов и т.д.). Кроме того, кальций выполняет роль второго посредника многих гормонов, медиаторов и пр. При этом ведущее значение принадлежит поддержанию физиологического баланса вне- и внутриклеточной концентраций ионов кальция, определяющего полноценность клеточного ответа на различные экзо- и эндогенные воздействия [Клиническая фармакология по Гудману и Гилману. - Т. 4./ Редактор: профессор А.Г. Гилман. Изд.: Практика, 2006 г.; Стенникова О.В., Санникова Н.Е. Патофизиологические и клинические аспекты дефицита кальция у детей. Принципы его профилактики // Вопр. совр. педиатр. - 2007. - Т. 6. - №4. - С. 58-65].

Антиоксидантные, стресс- и нейропротекторные свойства кальциевой соли коменовой кислоты изучали с использованием модельной системы, генерирующей свободные радикалы - система «цитрат-фосфат-люминол» (ЦФЛ), культуры нейронов головного мозга и спинальных ганглиев, а также модели стресса на экспериментальных животных.

Антиокислительные свойства кальциевой соли коменовой кислоты in vitro.

Действие комената кальция на генерацию активных форм кислорода (АФК) в модельной системе изучали в среде ЦФЛ (цитратнофосфатный буфер с добавлением люминола). В данной модели окисление ионов железа в присутствии ортофосфата и цитрата сопровождается образованием АФК и при этом возникает хемилюминесценция (ХЛ), избирательно усиливающаяся люминолом, которая подавляется в присутствии антиоксидантов. Регистрацию ХЛ осуществляли прибором SmartLum 5773 в течение 5 минут. Антиокислительную активность кальциевой соли коменовой кислоты оценивали по угнетению ХЛ модельной системы при добавлении водных растворов препарата в сравнении с раствором коменовой кислоты. Конечная концентрация вещества в кювете составляла 0,1 мг/мл и 0,01 мг/мл. Хемилюминесценсия свободных радикалов модельной системы ЦФЛ (контроль) принимали за 100%. Результаты экспериментов определяли по интенсивности хеми-люминесценции (в у.е.) и рассчитывали в процентах от контроля [Фархутдинов P.P., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. 1995. Уфа. 90 с. ]. Достоверность отличий оценивали с помощью критерия Стьюдента. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1 Уровень снижения свободных радикалов в модельной системе ЦФЛ в присутствии коменовой кислоты и ее кальциевой соли (%) № п/п Препарат Концентрация, мг/мл 0,01 0,1 1 коменат кальция 29,41±1,12* 64,59±1,33*_** 2 коменовая кислота 33,29±1,36* 69,39±1,16*_** Примечание: 1 * p<0,001 в сравнении с контролем; 2 _** p<0,001 в сравнении с 0,01 мг/кг.

Анализ данных, представленных в таблице 1, показывает, что кальциевая соль коменовой кислоты значительно снижает содержание свободных радикалов в сравнении с контролем в модельной системе ЦФЛ. При этом уровень снижения свободных радикалов коменатом кальция практически не отличается от уровня гашения свободных радикалов коменовой кислотой. Антиокислительные свойства комената кальция и коменовой кислоты зависят от концентрации вещества. Так, увеличение их концентрации в испытуемом растворе с 0,01 мг/мл до 0,1 мг/мл способствует значительному (более чем на 30%) повышению уровня гашения свободных радикалов.

Таким образом, кальциевая соль коменовой кислоты обладает выраженным антиоксидантным действием, при этом ее антиокислительные свойства практически не отличаются от свойств коменовой кислоты.

Влияние комената кальция на интенсивность свободнорадикального окисления и содержание МДА в мозге стрессированных животных.

Известно, что влияние различных негативных факторов, в том числе физическая нагрузка, стресс, сопровождается увеличением образования свободных радикалов (СР), инициирующих повреждение клеток и ведущих к развитию различных патологических состояний. При этом для оценки состояния оксидативных механизмов наиболее часто используется определение продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), вторичным продуктом которого является малоновый диальдегид (МДА), а также исследование хемилюминесценции биологических сред, интегрально отражающей баланс про- и антиоксидантных процессов в организме [Ayarapetyanz M.G., Yakovlev А.А.,. Levshina I.P, Vorontsova О.N., Stepanichev M. Yu., Onufriev M.V., Lazareva N.A., and Gulyaeva N.V. Studies of Mechanisms Involved in Neuronal Cell Death Induced by Chronic Stress in Rats// Neurochemical Journal. 2007. Vol. 1. №1. P. 86-92; B.A. Барабой, Д.А. Сутковой Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и патологии / Под. ред. акад. АМН Украины Ю.А. Зозули. - К.: Чернобыльинтеринформ, 1997. - Ч. 1, 2].

Уровень свободнорадикального окисления (СРО) в мозге стрессированных мышей определяли хемилюминесцентным методом [Фархутдинов У.Р., Фархутдинов P.P. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2000. Т. 129. №3. С. 260-264] на приборе SmartLum 5773. Результаты экспериментов оценивали по интенсивности хемилюминесценции (светосумма хемилюминесценции в у.е.). Содержание МДА определяли по методу Гаврилова Б.В. и соавт. [Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Вопросы мед. химии. 1987. №1. С. 19-21.]. Статистический анализ результатов проводили с использованием критерия Стьюдента [Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: 1990. 352 с. ].

Эксперимент проводили на белых беспородных мышах-самцах, массой 20-22 г. Коменат кальция вводили мышам per os, один раз в сутки, натощак в дозах 1, 2 и 4 мг/кг массы тела в течение 3-х суток, до стрессирования животных. Стресс вызывали методом иммобилизации, путем подвешивания мышей за шейную складку в течение пяти часов. Через 5 часов мышей декапитировали, головной мозг помещали в жидкий азот и затем определяли СРО и МДА. Дозы комената кальция были определены по результатам предварительных исследований. Анализ данных экспериментов показал, что коменат кальция, применяемый нами в более низких концентрациях - менее 1 мг/кг массы тела, практически не оказывает влияния на антиокислительные процессы в мозге стрессированных животных. В тоже время применение комената кальция в концентрациях, превышающих дозу в 4 мг/кг массы не способствовало повышению его эффективности.

Были сформированны следующие группы животных:

1. интактные, контроль;

2. интактные, коменат кальция 1 мг/кг массы тела;

3. интактные, коменат кальция 2 мг/кг массы тела;

4. интактные, коменат кальция 4 мг/кг массы тела;

5. стрессированные, контроль;

6. стрессированные, коменат кальция 1 мг/кг массы тела;

7. стрессированные, коменат кальция 2 мг/кг массы тела;

8. стрессированные, коменат кальция 4 мг/кг массы тела. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Анализ данных, представленных в таблице 2, показал, что введение кальциевой соли коменовой кислоты в концентрациях 1-4 мг/кг интактным мышам (группы 2, 3, 4) не оказывает существенного влияния на интенсивность свободнорадикального окисления и содержание малонового диальдегида в головном мозге. Показатели СРО и МДА остаются на уровне интактного контроля или незначительно превышают таковые. Резкое повышение уровня свободных радикалов и содержания МДА в головном мозге мышей наблюдается после стрессового воздействия (группа 5) (р<0,01). Применение же в течение 3-х дней до стрессирования мышей (группы 6, 7, 8) кальциевой соли коменовой кислоты в концентрациях 1-4 мг/кг массы предотвращает развитие окислительных процессов в головном мозге. Так, в группах, получавших коменат кальция в концентрации 2 и 4 мг/кг (группы 7, 8) такие показатели как СРО и МДА практически не отличаются от таковых в группе интактные, контроль (группа 1, р<0,01). Менее выраженное антиокислительное действие коменат калия проявил в концентрации 1 мг/кг. При этом содержание МДА в головном мозге мышей было достоверно ниже, чем у стрессированных (группа 5), в тоже время достоверного снижения активности СРО у них не наблюдалось.

Таким образом, установлено, что применение комената кальция в количествах 1, 2 и 4 мг/кг массы в течение 3 дней перорально натощак до стрессирования оказывает антиоксидантное стресспротекторное действие, проявляющееся в интенсивном снижении гиперпродукции свободных радикалов и содержания продуктов перекисного окисления липидов в мозге стрессированных животных. При этом наиболее выраженное статистически значимое антиоксидантное, стресспротекторное действие кальциевая соль коменовой кислоты оказывает в количестве 2 мг/кг массы тела (р<0,01).

Следует отметить, что указанная нами наиболее оптимальная доза кальциевой соли коменовой кислоты 2 мг/кг массы тела не является окончательной и может быть изменена в связи с экстраполяцией ее на другие субъекты, например, на человека, в том числе, и в связи с тяжестью нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением головного мозга.

Влияние кальциевой соли коменовой кислоты на глутаматную цитотоксичность в культуре нейронов мозжечка крысят

Исследования выполнены на крысятах линии Wistar. Культуры зернистых клеток мозжечка получали из мозга 7-9-дневных крысят методом ферментно-механической диссоциации [Викторов И.В., Хаспеков Л.Г., Шашкова Н.А. // Руководство по культивированию нервной ткани: Методы, техника, проблемы. - 1986. - М. - 266 с. ]. Культуры клеток после 7 дней культивирования подвергали действию глутамата и/или кальциевой соли коменовой кислоты, коменовой кислоты. Влияние кальциевой соли коменовой кислоты на глутаматную цитотоксичность в культуре нейронов мозжечка крысят изучали в сравнении с коменовой кислотой. Коменат кальция и коменовую кислоту вносили в группы культур нейронов без воздействия глутамата и после 10-минутного воздействия (100 мкМ) глутамата в сбалансированном солевом растворе (ССР), предварительно поместив их в исходную питательную среду. После чего культуры инкубировали в СО₂-инкубаторе еще 4,5-5 часов. Исследовано влияние комената кальция в концентрациях 10^-3 М - 10^-7 М и коменовой кислоты в концентрациях 10^-3 М - 10^-5 М. Контролем служили культуры, помещенные на 10 мин в ССР, а также культуры, обработанные глутаматом в ССР. После фиксации культур учитывали число живых и погибших нейронов на инвертированном микроскопе Invertoscopes ID 03. Достоверность отличий оценивали с помощью критерия Стьюдента в МО Excel 2003. Культуры нейронов мозжечка, полученные от интактных крысят, делили на следующие группы соответственно:

1.1 контроль ССР;

1.2 ССР + коменат кальция 10^-3 М;

1.3 ССР + коменат кальция 10^-4 М;

1.4 ССР + коменат кальция 10^-5 М;

1.5 ССР + коменат кальция 10^-6 М;

1.6 ССР + коменат кальция 10^-7 М;

1.7 ССР + коменовая кислота 10^-3 М;

1.8 ССР + коменовая кислота 10^-4 М;

1.9 ССР + коменовая кислота 10^-5 М;

2.1 контроль ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ;

2.2 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат кальция 10^-3 М;

2.3 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат кальция 10^-4 М;

2.4 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат кальция 10^-5 М;

2.5 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат кальция 10^-6 М.

2.6 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат кальция 10^-7 М;

2.7 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменовая кислота 10^-3 М;

2.8 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменовая кислота 10^-4 М.

2.9 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменовая кислота 10^-5 М

Результаты исследования представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, коменат кальция (группы 1.2-1.6) и коменовая кислота (группы 1.7-1.9) во всех исследуемых нами концентрациях не оказывают влияния на выживаемость нейронов мозжечка в культуре. Число выживших нейронов остается на уровне интактного контроля (группа 1.1). После воздействия глутамата выживаемость зернистых клеток мозжечка значительно (на 60,3%) снижается (группа 2.1), p<0,001. Добавление к культивируемым нейронам мозжечка обработанных глутаматом комената кальция в концентрации 10^-3 М - 10^-7 М, способствует достоверному повышению устойчивости нейронов к глутаматной цитотоксичности во всех группах культур (группы внесение 2.2-2.6). При этом максимальная и практически одинаковая выживаемость нейронов отмечалась в группах культур 2.4 и 2.5 с внесением комената кальция в концентрации 10^-5 и 10^-6 М. Достоверно более высокая устойчивость нейронов мозжечка к глутаматной цитотоксичности в сравнении с группой контроль-глутамат (1.2) отмечалась и при применении коменовой кислоты в концентрациях 10^-3 М - 10^-5 М (группы 2.7-2.9). Максимум эффективности коменовой кислоты наблюдался при применении ее в концентрации 10^-3 М.

При этом число выживших нейронов практически не отличалось от числа таковых при применении комената кальция в концентраци 10^-5 и 10^-6 М. То есть, максимальный нейропротекторный эффект при глутаматной цитотоксичности коменовая кислота проявляет в значительно более высокой концентрации в сравнении с коменатом кальция.

Таким образом, установлено, что применение кальциевой соли коменовой кислоты на фоне глутаматной цитотоксичности способствует значительному увеличению выживаемости нейронов мозжечка в культуре. При этом максимальный эффект устойчивости нейронов к токсическому воздействию глутамата в культурах достигается при добавлении кальциевой соли коменовой кислоты в существенно более низкой концентрации (на два порядка) в сравнении с коменовой кислотой.

Влияние комената кальция на ростовые процессы спинальных ганглиев в условиях окислительного стресса

Как известно, одним из ведущих факторов гибели нервных клеток при тяжелом гипоксическом воздействии является окислительный стресс. Хронический окислительный стресс приводит к повреждению всех классов биомолекул. Постепенное накопление окислительных повреждений в ДНК и ошибок репарации приводит к аномальной активации клеточного цикла в нейронах и к последующей их гибели [Попова М.С., Степаничев М.Ю. Индукция клеточного цикла, амилоид-бетта и свободные радикалы в механизме развития нейродегенеративных процессов в мозге // Нейрохимия. 2008. Т. 25. №3]. В этой связи особенно актуальным является исследование влияния комената кальция на ростовые процессы нейронов спинальных ганглиев в условиях окислительного стресса. Нейротрофическое действие комената кальция изучали на модели культивируемых спинальных ганглиев эмбрионов цыплят в сравнении с коменовой кислотой. Спинальные ганглии эмбрионов цыплят культивировали по общепринятым методикам [Козлова М.В., Шурыгин А.Я., Сидоренко И.П., Каленчук В.У. Влияние препарата «Бализ-2» на рост культуры симпатических ганглиев крыс различных линий // Нейрофизиология. 1988. Т. 20. С. 550-557; Чалисова H.И., Мелькишев В.Ф., Акоев Г.Н. и др. Стимулирующее влияние пролактина на рост нейритов чувствительных нейронов в органотипической культуре // Цитология. 1991. Т. 33. С. 29-31; Ikeda K., Kinoshta M., Iwasaki G. et al. Neurotrophic effect of angiotensin II, vasopressin and oxytocin on the ventral spinal cord of the rat embryo // Intern. J. Neurosci. 1989. V. 48. P. 19-23]. Для культивирования нейронов использовали питательную среду следующего состава: сыворотка эмбриональная телячья - 30%; среда Игла (DMEM) - 55%; раствор Хэнкса - 12%; раствор глюкозы (40%) - 2%; раствор L-глутамина (0,2 M) - 1%. Оксидативный стресс получали через 24 часа от начала культивирования спинальных ганглиев добавлением в питательную среду перекиси водорода в концентрации 10 мМ на 30 мин. Через 30 мин питательную среду с перекисью водорода удаляли, культуры помещали в свежую питательную среду и в опытные культуры добавляли раствор комената кальция и коменовую кислоту в конечной концентрации в культуре 0,1, 0,01, 0,001 мМ. Количественный учет показателей роста нейритов спинальных ганглиев эмбрионов цыплят производили через 48 часов от начала культивирования на инвертированном микроскопе Invertoscopes ID 03 путем прижизненной микроскопии в фазовом контрасте. Согласно описанным ранее методикам были определены следующие параметры в относительных единицах:

- максимальная величина зоны роста (МВЗР), равная расстоянию от края эксплантата до кончика самого длинного нейрита;

- относительная величина зоны роста (ОВЗР), равная отношению МВЗР к диаметру эксплантата;

- количество нейритов в пучке (КНП), которое определялось подсчитыванием количества отростков на отрезке 200 мкм на расстоянии 250 мкм от края ганглия;

- плотность пучка нейритов (ППН), определяемая по числу нейритов в зоне роста на отрезке 200 мкм на расстоянии 250 мкм от края эксплантата и

градуированная по шкале: менее 10 пучков - 1; 10-30 - 2; 30-50 - 3; более 50 - 4;

- интенсивность зоны роста (ИЗР), определяемая как произведение МВЗР на ППН.

Статистический анализ результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследований представлены в таблицах 4, 5.

Таблица 4 - Влияние комената кальция на ростовые процессы спинальных ганглиев эмбрионов цыплят Показатели нейритного роста Группы культур контроль Перекись водорода Перекись водорода, коменат кальция 1 2 3 4 5 0,1 мМ 0,01 мМ 0,001 мМ МВЗР 1185,49±42,19 882,75±31,94** 982,13±66,53 1160,28±73,93^■■■ 1033,71±53,80^■ ОВЗР 3,28±0,06 3,07±0,05* 3,13±0,09 3,44±0,10^■■ 3,14±0,10 КНП 34,07±1,24 22,92±1,46** 28,50±3,15 33,12±2,59^■■■ 30,71±2,53^■■ ППН 2,77±0,08 2,17±0,08** 2,б3±0,20 2,76±0,13^■■■ 2,64±0,13^■■ ИЗР 3353,16±190,87 2005,80±125,98** 2746,69±387,85 3375,40±343,99^■■■ 2760,43±219,96^■■ Примечание: 1. * - p<0,01; ** - p<0,001 перекись в сравнении с группой «контроль»; 2. ^■ - p<0,05; ^■■ - p<0,01; ^■■■ - p<0,001 - коменат кальция в сравнении с группой «перекись».

Анализ показателей роста нейритов в культуре спинальных ганглиев эмбрионов цыплят (табл. 4) показывает, что окислительный стресс, вызванный добавлением в культуру перекиси водорода (группа 2), значительно и статистически достоверно угнетает нейритный рост спинальных ганглиев.

Применение комената кальция на фоне окислительного стресса в концентрациях 0,01 и 0,001 мМ (группы 4, 5), способствует восстановлению нейритного роста спинальных ганглиев в культуре. При этом все показатели ростовых процессов (МВЗР, КИП, ППН, ОВЗР, ИЗР) значительно превышают таковые в группе культур, обработанных перекисью водорода (гр. 2, p<0,001).

Наиболее выраженный нейротрофический эффект комената кальция на ростовые процессы спинальных ганглиев в условиях окислительного стресса отмечается при применении его в концентрации 0,01 мМ (группа 4, p<0,001). В этой группе культур показатели нейритного роста практически не отличаются от показателей в контрольной группе (группа 1). Несколько менее выраженный, но статистически значимый, нейротрофический эффект оказал коменат кальция в концентрации 0,001 мМ (группа 5, p<0,001). Повышение ростовых процессов в сравнении с культурой, обработанной перекисью водорода отмечалось и при применении комената кальция в концентрации 0,1 мМ, однако эти изменения статистически не достоверны.

Исследование нейротрофических свойств коменовой кислоты (табл. 5) в условиях окислительного стресса показал, что коменовая кислота также как и коменат кальция способствует восстановлению ростовых процессов в культуре спинальных ганглиев, обработанных перекисью водорода (группы 3, 4). Причем, при применении ее в концентрации 0, 01 мМ (группа 4) нейритный рост восстанавливается до контрольного уровня (группа 1). Повышение показателей ростовых процессов МВЗР, КПП, ППН, ИЗР, отмечается и в группе культур с внесением 0,1 мМ коменовой кислоты, однако эти данные статистически недостоверны. Применение же коменовой кислоты в

концентрации 0,001 мМ не оказывает влияния на рост культур, обработанных перекисью водорода.

Таблица 5 - Влияние коменовой кислоты на ростовые процессы спинальных ганглиев эмбрионов цыплят Показатели нейритного роста Группы культур контроль Перекись водорода Перекись водорода, коменовая кислота 1 2 3 4 5 0, 1 мМ 0,01 мМ 0,001 мМ МВЗР 1195,04±52,77 959,82±35,40** 1122,55±90,65 1156,50±68,25^■ 969,84±57,02 ОВЗР 3,24±0,06 3,05±0,03* 3,18±0,08 3,20±0,09 3,04±0,07 кнп 24,68±1,54 17,65±1,18** 22,05±3,08 28,55±2,63^■■■ 21,68±2,18 ппн 2,27±0,09 1,93±0,07* 2,09±0,17 2,50±0,17^■■ 2,12±0,13 ИЗР 2902,62±204,93 1960,13±129,44** 2613,45±384,94 3063,60±309,60^■■ 2208,96±226,60 Примечание: 1. * - p<0,01; ** - p<0,001 перекись в сравнении с группой «контроль»; 2. ^■ - p<0,05; ^■■ - p<0,01; ^■■■ - p<0,001 - коменовая кислота в сравнении с группой «перекись».

Таким образом, установлено, что применение комената кальция в концентрациях 0,01 и 0,001 мМ (табл. 4, гр. 4, 5) статистически значимо защищает нейроны спинальных ганглиев эмбрионов цыплят от окислительного воздействия перекиси водорода. В то время как статистически достоверный

антиоксидантный протекторный эффект коменовой кислоты проявляется только в одной, более высокой концентрации 0,01 мМ (табл. 5, гр. 4).

Токсичность кальциевой соли коменовой кислоты мы оценивали по показателям свободнорадикального окисления и перекисного окисления липидов в мозге экспериментальных животных (табл. 2), а также по контрольным культурам нейронов мозжечка с добавлением исследуемых доз вышеназванных солей (табл. 3). Результаты исследований показали, что кальциевая соль коменовой кислоты в изучаемых нами дозах не токсична.

Как указывалось выше, основной целью нейропротекции при ишемии/ гипоксии является предотвращение распространения необратимого ишемического повреждения. Нейропротекция представляет собой сумму всех средств воздействия, направленных на защиту нейронов от повреждающих факторов [Muresanu D.F. Neuroprotection and neuroplasticity - a holistic approach and perspectives // Journal of Neurologikal Sciens. 2007. Vol. 257. P. 38-43]. Известно также, что для проведения доклинических испытаний препаратов предназначенных для лечении заболеваний с дегенеративными расстройствами исследования выполняют на культивируемых клетках и модельных животных [Andersen Julie К. Oxidative stress in neurodegeneration: cause or consequence? // Nature Reviews Neuroscience. 2004. V. 5. S18-S25].

Нами исследовано влияние кальциевой соли коменовой кислоты (комената кальция) в различных концентрациях на окислительные процессы в модельной системе ЦФЛ и в головном мозге стрессированных животных (иммобилизационное стрессовое воздействие), на устойчивость культивируемых нейронов мозжечка к глутаматной цитотоксичности, на ростовые процессы спинальных ганглиев в условиях окислительного стресса. Исследования проводились в сравнении с коменовой кислотой (табл. №№1, 3, 4, 5). Результаты исследований антиоксидантных свойств комената кальция in vitro в модельной системе ЦФЛ показали, что коменат кальция значительно снижает уровень свободных радикалов в модельной системе ЦФЛ. При этом его антиокислительные свойства практически не отличаются от таковых коменовой кислоты. При исследовании влияния комената кальция на окислительные процессы в головном мозге стрессированных животных, in vivo, (табл. 2) было установлено, что до стрессовое применение комената кальция в дозах 1, 2, 4 мг/кг перорально натощак препятствует развитию окислительных процессов в головном мозге мышей. Максимальный, статистически значимый антиокислительный эффект комената кальция отмечается при применении его в дозе 2 мг/кг.

Установлено также, что применение комената кальция в концентрациях 10^-3 М - 10^-7 М (табл. 3) в культуре нейронов мозжечка на фоне глутаматной цитотоксичности значительно и статистически достоверно повышает выживаемость нейронов. Наиболее высокая и практически одинаковая выживаемость нейронов отмечается в группах культур после воздействии комената кальция в концентрации 10^-5 и 10^-6 М (группы 2.4 и 2.5; p<0,001). При этом максимальный нейропротекторный эффект кальциевой соли коменовой кислоты в условиях глутаматной цитотоксичности проявляется в существенно более низкой (на два порядка) концентрации в сравнении с коменовой кислотой. Коменат кальция оказывает также выраженное нейротрофическое действие в условиях окислительного стресса. Так, установлено, что коменат кальция в концентрациях 0,01 и 0,001 мМ (табл. 4, гр. 4, 5) статистически значимо защищает нейроны спинальных ганглиев эмбрионов цыплят от окислительного воздействия перекиси водорода. Наиболее выраженное нейротрофическое действие коменат кальция оказывает в концентрации 0,01 мМ (табл. 5, гр. 4). При этом наблюдается восстановление всех показателей нейритного роста до контрольного уровня. Следует отметить, что статистически достоверный нейротрофический эффект коменовой кислоты проявляется только в одной (0,01 мМ) концентрации, в то время как коменат кальция достоверно усиливает нейритный рост спинальных ганглиев и в концентрации на порядок ниже (0,001 мМ).

Кроме этого, полученные нами данные свидетельствуют о том, что кальциевая соль коменовой кислоты в предлагаемых нами дозах не обладает токсичностью.

Применение комената кальция как антиоксидантного, стресс- и нейропротекторного средства расширяет спектр высокоэффективных лекарственных средств с антиоксидантными, стресс- и нейропротекторными свойствами для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением головного мозга.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и фармакологии и касается применения кальциевой соли коменовой кислоты для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением мозга, один раз ежедневно перорально натощак в течение 3-х суток. Технический результат: при реализации заявленного назначения коменат кальция помимо антиоксидантного стресспротекторного действия оказывал также выраженное нейротрофическое действие, при этом наблюдалось восстановление нейритного роста до контрольного уровня, коменат кальция не обладает токсичностью. Средство обладает повышенной эффективностью. 5 табл.

Применение кальциевой соли коменовой кислоты для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением мозга, один раз ежедневно перорально натощак в течение 3-х суток.