СПОСОБ ТОРМОЖЕНИЯ РОСТА ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2015 года по МПК G09B23/28 B82B1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии и может быть использовано для оценки противоопухолевого действия наночастиц (НЧ) металлов и в экспериментальной противоопухолевой терапии.

Большое внимание в области создания новых противоопухолевых средств уделяется исследованию агентов на основе переходных металлов. Интерес к группе d-металлов определяется не только их способностью подавлять рост клеток, но и участием в разнообразных физиологических функциях, поскольку большинство элементов этой группы являются эссенциальными [Chen D., Milacic V., Frezza M., Dou Q.P. Metal complexes, their cellular targets and potential for cancer therapy // Curr Pharm Des. 2009. V. 15, N 7, P. 777-791; Garbutcheon-Singh K.B., Grant M.P., Harper B.W., Krause-Heuer A.M., Manohar M., Orkey N., Aldrich-Wright J.R. Transition Metal Based Anticancer Drugs // Current Topics in Medicinal Chemistry. 2011. V. 11, N 5, P. 521-542].

Развитие нанотехнологий и внедрение их в медицину приобрело большое значение для онкологии. Использование различных наноконструкций d-металлов в качестве самостоятельных противоопухолевых средств может быть перспективным, поскольку в ультрадисперсной форме они проявляют выраженную биологическую активность, обладают пролонгированным действием и меньшей токсичностью по сравнению с солями [Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов // Химическая физика. 2002. Т.21 (4). С.79-85; Frezza M, Hindo S, Chen D, Davenport A, Schmitt S, Tomco D, Dou QP. Novel metals and metal complexes as platforms for cancer therapy // Curr Pharm Des. 2010 Jun; 16 (16). P. 1813-25].

В противоопухолевой терапии функционализированные различными лигандами наночастицы металлов, в частности антителами, различными пептидами, ДНК и/или РНК, используются для таргетной терапии опухолей [Mi Kyung Yu, Jinho Park, Sangyong Jo. Targeting Strategies for Multifunctional Nanoparticles in Cancer Imaging and Therapy // Theranostics. 2012. V. 2, N 1, P. 3-44]. Показана эффективность лечения рака печени с помощью нацеливания магнитных наночастиц, содержащих 5-фторурацил [Wang J.M., Xiao B.L., Zheng J.W., Chen H.B., Zou S.Q. Effect of targeted magnetic nanoparticles containing 5-FU on expression of bcl-2, bax and caspase 3 in nude mice with transplanted human liver cancer // World J. Gastroenterol. 2007. N 13. P. 3171-3175]. Металлические наночастицы также используются в качестве контейнеров для доставки лекарственных средств к тканям-мишеням и проведения гипертермии, фотодинамической и радиотерапии [Conde J., Doria G., Baptista P. Noble Metal Nanoparticles Applications in Cancer // J. of Drug Delivery. 2012. V. 2012, Article ID 751075, 12 p.].

В качестве самостоятельных лекарственных средств наночастицы переходных металлов пока не нашли применения в онкологии. Имеются лишь отдельные исследования по использованию наночастиц металлов в ветеринарии. Например, установлено, что введение нанодисперсионного железа нормализует показатели крови коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, которых авторы предлагают использовать в качестве биологической модели для исследования различных форм лейкоза человека [Павлов Г.В., Годвин Окпаттах А.К., Пчелин В.М., Павлова В.Г. Влияние нанодисперсионного железа при лейкозе животных // Нанотехнологии и информационные технологии - технологии XXI века: Материалы Международной научно-практической конференции (Москва, 24-26 мая 2006 г.). М., 2006. С. 117-118].

Поскольку наночастицы металлов проявляют ярко выраженную биологическую активность, в том числе бактериостатическое и бактерицидное действия, лекарственные формы на их основе уже используются для лечения трофических язв, ожогов, гнойных ран и угревой сыпи. Наночастицы железа как в виде водной суспензии при подкожном введении, так и в виде мази при нанесении на раны обладают ярко выраженным ранозаживляющим эффектом. На основе нанопорошков железа были получены и апробированы препараты для ускоренного заживления ран и лечения ожогов, которые позволяют ускорить до 1,5 раз процесс заживления, причем после лечения не остается рубцов [Байтукалов Т.А. Физико-химические особенности ранозаживляющих свойств наночастиц железа и магния в составе различных полимеров: Автореф. дис … к.х.н. М., 2006]. В то же время, использование наночастиц несет не только несомненные преимущества, но и потенциальную опасность вредного воздействия на здоровье человека и природные экосистемы [Колесниченко А.В., Тимофеев М.А., Протопопова М.В. Токсичность наноматериалов - 15 лет исследований // Российские нанотехнологии. 2008. Т. 3. №3-4. С. 54-61].

Таким образом, исследование биологической активности, в том числе, противоопухолевой, нанокластеров переходных металлов и разработка противоопухолевых препаратов на их основе является актуальной задачей.

Известен «Способ определения влияния нанодисперсной меди на рост опухолей в эксперименте» [патент RU 2417453, опубл. 27.04.2011, Бюл. №12]. Показано, что введение крысам с перевиваемой саркомой 45 наночастиц меди приводит к полной регрессии опухоли в 50% случаев и к появлению признаков частичной регрессии у большей части остальных животных. Однако в данной работе не исследовано влияние введения наночастиц меди на уровень эндогенной интоксикации у животных-опухоленосителей и нет сведений об исследовании противоопухолевой активности наночастиц железа.

Известен также способ использования наночастиц меди, железа или цинка, приводящий к гибели опухолевых клеток линейных и свежевыделенных культур [патент RU 2392668, опубл. 20.06.2010, Бюл. №17]. В данном способе культуру клеток линии миеломы Х563 или клеток костномозгового пунктата больных множественной миеломой инкубируют с указанными наночастицами в течение 30-45 мин при 37°C, кроме того, ткань рака легкого культивируют с теми же наночастицами в диффузионных камерах, подшитых в брюшную полость крыс, в течение 6 дней. Однако, на наш взгляд, данный способ не позволяет оценить влияния наночастиц указанных металлов на рост опухоли в организме-опухоленосителе и определить потенциальную токсичность данного воздействия на организм.

Известно влияние наночастиц карбоната лития на рост экспериментальной гепатокарциномы 29 [Н.П. Богатова, Ю.И. Бородин, В.В. Макарова, А.А. Пожидаева, Л.Н. Рачковская, В.И. Коненков. Влияние наноразмерных частиц карбоната лития на интактную мышечную ткань и опухолевый рост. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2014. Том 157. №1, стр. 102-107]. Авторами показано, что ведение наночастиц карбоната лития по периферии опухолевого роста вызывает некроз опухолевых клеток, деструкцию сосудистого русла и инфильтрацию иммунокомпетентными клетками области опухолевого роста. Однако в данной работе авторы не приводят сведений о влиянии наночастиц карбоната лития на уровень эндогенной интоксикации и на динамику роста опухоли у животных-опухоленосителей. Таким образом, данные о самостоятельной противоопухолевой активности наночастиц железа в опытах in vivo в литературе отсутствуют.

Техническим результатом представленного изобретения является достижение противоопухолевого действия у крыс с перевиваемой лимфосаркомой Плисса путем введения животным наночастиц железа без повышения токсичности их воздействия на организм.

Данный технический результат достигается за счет того, что с 6 суток после перевивки лимфосаркомы Плисса осуществляют восьмикратное введение суспензии наночастиц железа: на 6, 7, 9, 10, 14, 15, 16 и 17 сутки в разовой дозе 1,25 мг/кг массы животного (суммарная доза 10 мг/кг).

В качестве экспериментальной модели использовали крыс, которым была перевита лимфосаркома Плисса (ЛСП), характеризующаяся быстрым агрессивным ростом с тенденцией к инвазии в окружающие ткани, прорастанием забрюшинной клетчатки, гематогенным метастазированием и некротизацией, а также сниженной чувствительностью к цитостатикам. Штамм ЛСП получен из банка опухолевых штаммов Российского Онкологического Центра РАМН.

Для индукции ЛСП нелинейным крысам-самцам массой 260-300 г осуществляли инъекцию 0,7 мл 50% взвеси опухолевых клеток в физиологическом растворе подкожно в область нижней части спины.

Порошок наночастиц железа суспендируют непосредственно перед введением в физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл, полученную взвесь вводят крысам-самцам с перевиваемой лимфосаркомой Плисса, разделенным на три группы, в первой группе суспензию НЧ железа вводят локально в опухоль в количестве 1,25 мг/кг, во второй группе суспензию НЧ железа вводят внутрибрюшинно в количестве 1,25 мг/кг, в третьей группе, являющейся контрольной, вводят физиологический раствор внутрибрюшинно, в количестве 0,3 мл на крысу. С 6 суток после перевивки (когда объем опухоли в среднем достигает 0,4±0,05 см³) начинают восьмикратное введение суспензии наночастиц железа (на 6, 7, 9, 10, 16, 17, 19 и 20 сутки) после перевивки опухоли, суммарная доза наночастиц железа в обеих экспериментальных группах составляет 10 мг/кг. В контрольной группе животным с лимфосаркомой Плисса в те же сроки внутрибрюшинно вводился физиологический раствор.

Использовали нанопорошки железа, полученные из крупнодисперсных порошков с помощью плазменной технологии, основанной на испарении сырья (крупнодисперсного порошка или прутка) в плазменном потоке с температурой 5000-6000 К и конденсации пара до ультрадисперсных частиц требуемого размера (дисперсность частиц 30-50 нм), форма частиц близка к сферической. Исследование структуры наночастиц и их раствора в 0,9% NaCl, проведенное с помощью метода спектроскопии рентгеновского поглощения на основе анализа тонкой структуры спектров рентгеновского поглощения в области края поглощения (XANES - X-ray absorption near edge spectroscopy), показало, что в исследуемом растворе наночастицы представляли собой металлическое железо.

Критериями оценки влияния наночастиц (НЧ) железа на рост ЛСП служили масса опухоли (М), объем опухоли (V), индекс эффективности (ИЭ), процент торможения роста опухоли (Т%), морфологические изменения в опухолевой ткани. Объем опухоли рассчитывали по формуле Шрека для эллипсоида: V=(α×b×c)×π/6, где a, b, c - линейные размеры опухоли (см), V - объем опухоли (см³). В конце эксперимента производили взвешивание опухолей. Индекс эффективности рассчитывали как отношение среднего значения массы опухоли в контроле к среднему значению массы опухоли в опыте: ИЭ=Мк/Мо. Процент торможения роста опухоли оценивали по среднему объему и по средней массе опухоли (Tv%, Tm%) в опытных группах по сравнению с контролем: Tv%=[(Vк-Vo)/Vк]×100%, где Vк и Vo - средний объем (см³) опухоли в контрольной и опытной группе в конце эксперимента; Tm%=[(Мк-Мо)/Мк]×100%, где Мк и Мо - средняя масса (г) опухоли в контрольной и опытной группе в конце эксперимента.

У контрольных животных (животные с ЛСП без введения наночастиц) средний объем опухоли составил 78,5 см³, масса - 83,71 г.

У животных, которым было осуществлено 8-кратное внутриопухолевое введение наночастиц железа в дозе 1,25 мг/кг массы животного (суммарная доза 10 мг/кг), наблюдалась полная регрессия опухоли в 60% случаев, а при внутрибрюшинном введении - в 50% случаев. При этом из 22 животных с ЛСП, которым вводилась суспензия нанопорошка железа, у 12 животных (по 6 с внутриопухолевым и внутрибрюшинным способах введения) объем и масса опухоли на момент забоя были равны нулю, при внутриопухолевом введении у 2 животных составили в среднем 0,16 см³ и 0,03 г соответственно (снижение размеров опухоли относительно средних значений контрольной группы на 99,8% по объему и на 99,96% по массе, что также относится к полной регрессии) и у 2-х животных - 14 см³ и 27 г (снижение размеров опухоли относительно средних значений контрольной группы на 82,2% по объему и на 67,7% по массе) и лишь при внутрибрюшинном введении наночастиц у 6 животных был зафиксирован рост опухоли (средний объем 83,5 см³, средняя масса 120,2 г). Таким образом, суммарно введение наночастиц железа привело к полной регрессии опухоли в 63,6% случаев, торможению роста в 9,1% и росту опухоли в 27,3%. Процент торможения роста опухоли в целом по группе составил: по объему опухоли (Tv%) - 66,3%, по массе опухолевого узла (Tm%) - 64,2%. Индекс эффективности воздействия наночастиц железа был равен 2,79 (таблица 1).

Для суждения о выраженности эндогенной интоксикации в обеих группах животных (опухолевый рост без введения и с введением наночастиц железа) изучены уровень молекул средней массы (МСМ₂₅₄ и МСМ₂₈₀), общая концентрация альбумина (ОКА) и эффективная концентрации альбумина (ЭКА) и рассчитаны связывающая способность альбумина (ЭКА/ОКА×100%), индекс токсичности (ОКА/ЭКА-1) и коэффициент интоксикации (МСМ₂₅₄/ЭКА×1000). Индекс токсичности отражает функциональное состояние молекулы альбумина (сорбционную способность), зависящее от конформационных изменений его молекулы, и характеризует в значительной степени вклад недостаточности функций печени в развитие эндогенной интоксикации. Коэффициент интоксикации отражает баланс между накоплением и связыванием токсических лигандов.

Как видно из таблицы 2, для животных с лимфосаркомой Плисса было характерно резкое снижение эффективной концентрации альбумина до 12,76±1,47 г/л, в то время как у интактных животных среднее значение данного показателя составляет 30,75±2,75 г/л. Это свидетельствует о загруженности альбумина продуктами интоксикации, образующимися при опухолевом росте. Наблюдается также и накопление в крови фракции молекул средней массы, определяемых при 254 нм, по концентрации которых принято судить о выраженности эндогенной интоксикации. Введение животным наночастиц железа оказывало выраженный нормализующий эффект на эти показатели. Уровень эффективной концентрации и связывающая способность альбумина у животных с полной регрессией опухоли, вызванной введением наночастиц железа, были увеличены на 73,9% и 129,9% соответственно по сравнению с опухолевыми животными, которым наночастицы не вводились. Содержание МСМ₂₅₄ у животных с регрессией было ниже на 20,3%, чем в контрольной группе животных-опухоленосителей. При этом следует отметить, что даже у животных с продолженным ростом после введения наночастиц железа показатели, отражающие способность альбумина осуществлять связывание токсических продуктов, были значительно выше, чем в контрольной группе: уровень ЭКА - на 61%, ССА - на 156,5%, хотя содержание МСМ₂₅₄ оказалось на том же уровне, что и у животных-опухоленосителей, которым наночастицы не вводились. Однако уровень МСМ₂₅₄ у животных с ростом опухоли после введения наночастиц железа был статистически значимо выше (на 25%, p=0,014231), чем у животных с полной регрессией опухолевого узла. Уровень среднемолекулярных пептидов (МСМ₂₈₀) у животных с регрессией опухоли не отличался от значений в контрольной группе, но был значимо ниже (на 21,2%, p=0,009442), чем у животных с продолженным ростом после введения наночастиц железа.

Введение наночастиц железа привело к снижению индекса токсичности в 9,8 раз и коэффициента интоксикации на 58,2% у животных с полной регрессией опухоли по сравнению с контрольной группой. У животных, у которых введение наночастиц железа не сопровождалось регрессией опухоли, индекс токсичности снизился в 18 раз, коэффициент интоксикации - на 52%.

Таким образом, применение данного способа позволяет путем введения наночастиц железа крысам с лимфосаркомой Плисса достичь полной регрессии опухоли у 60% животных при внутриопухолевом введении и у 50% животных при внутрибрюшинном введении (при этом индекс эффективности по всем животным составляет 2,79). Это одновременно сопровождается значительным снижением эндогенной интоксикации, характерной для опухолевого процесса, у животных опытной группы вне зависимости от способа введения наночастиц и степени регрессии опухоли. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Авторами в доступных источниках информации не было обнаружено сведений об известности предлагаемого способа. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».

Изобретение может быть использовано в здравоохранении при проведении экспериментальных исследований в области наноонкологии. Таким образом, изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для оценки противоопухолевого действия наночастиц (НЧ) металлов. Для этого с 6-х суток после перевивки лимфосаркомы Плисса крысам-самцам осуществляют восьмикратное внутрибрюшинное или локально в опухоль введение суспензии наночастиц железа на физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл. Введение проводят на 6, 7, 9, 10, 14, 15, 16 и 17 сутки в разовой дозе 1,25 мг/кг массы животного. Способ позволяет достичь противоопухолевого действия НЧ без повышения токсичности их воздействия на организм. 2 табл.

Способ торможения роста лимфосаркомы Плисса в эксперименте, включающий воздействие на опухоль наночастиц железа, отличающийся тем, что с 6-х суток после перевивки лимфосаркомы Плисса крысам-самцам осуществляют восьмикратное внутрибрюшинное или локально в опухоль введение суспензии наночастиц железа на физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл: на 6, 7, 9, 10, 14, 15, 16 и 17 сутки в разовой дозе 1,25 мг/кг массы животного.