СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЛИЯНИЯ НАНОДИСПЕРСНОЙ МЕДИ НА РОСТ ОПУХОЛЕЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2011 года по МПК G09B23/28 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для получения противоопухолевого действия чистой нанодисперсной меди в эксперименте.

Известны данные о физико-химических свойствах и биологической активности различных наночастиц металлов. Обсуждается неоднозначность вопроса об их токсичности и механизмах действия на биологические системы и их компоненты. В серии токсикологических исследований установлены параметры токсичности для наночастиц, в том числе различных наночастиц меди, при внутрибрюшинном и пероральном введении, а также их влияние на некоторые биохимические показатели. Кроме того, наночастицы в силу своих размеров обладают повышенной способностью к проникновению в клетки и встраиванию в различные метаболические цепи (см. Глущенко Н.Н. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов. // Автореф. дисс. д.б.н. Москва, 1988. 49 с.; Богословская и соавт. Изучение безопасности введения наночастиц меди с различными физико-химическими характеристиками в организм животных. // Вестник ОГУ. 2009. №21. С.124-127).

Известны способы использования нанотехнологий для молекулярной диагностики и таргетной терапии злокачественных новообразований, использования нанотехнологии в визуализационной диагностике и в лечении злокачественных новообразований. К эффективным противоопухолевым препаратам, содержащим металлы, относятся производные платины (цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин). Производные платины (Pt) способны повреждать ДНК, формируя Pt-ДНК аддукты, которые блокируют репликацию, транскрипцию и, как результат, клеточную пролиферацию (см. Beretta G.L., Righetti S.C., Lombardi L. et al. Electron microscopy analysis of early localization of cisplatin in ovariancarcinoma cells. Ultrastruct Pathol. 2002. 26. P.331-334). Две основные проблемы, возникающие при терапии этими препаратами, - токсический эффект (нефротоксичность, ототоксичность, нейротоксичность) и развитие лекарственной резистентности, успешно решаются путем инкапсулирования производных Pt в липосомальные наноструктуры (см. Каплун А.П., Ле Бонг Шон и соавт. Липососмы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ. // Вопросы медицинской химии. 1999. №1. С.89-94; Кулик Г.И., Пивнюк В.М. и соавт. Липосомальные препараты: путь к преодолению лекарственной устойчивости к цисплатину. Онкология. 2009. Т.11. №1. С.76-80).

Медь, так же как и платина, обладает способностью образовывать комплексы с фосфатными, пиримидиновыми и пуриновыми основаниями ДНК, нарушая процессы репликации. Кроме этого, свободная фракция меди (Cu²⁺) катализирует реакции перекисного окисления липидов и участвует в генерации мембрано- и генотоксичных свободных радикалов (свободнорадикальное повреждение ДНК) (Кудрин А.В., Громова О.М. Микроэлименты в иммунологии и онкологии. М.: ГОЭТАР-Медиа, 2007. 554 с.).

Известен способ лечения первичного рака печени, рака почки (в культуре клеток) и метастазов соединениями меди с лигандами, в качестве которых используют алкилирующие агенты - мелфалан или тегафур. Этот способ выбран нами в качестве прототипа (Patent title: Copper melphalan and copper tegafur as anti-tumor agents, GA US, 20090105206, 04.23.2009, AA61K31555FI, 514184). Исследование показало, что лечение данными комплексами дает более высокий противоопухолевый, антипролиферативный, антиангиогенный и иммуномодулирующий эффект, чем собственно мелфалан и тегафур. Установлено, что медь стабилизирует данные агенты и снимает резистентность к ним клеток. Избирательно повреждая ткани опухоли и существенно не влияя на здоровые ткани, этот препарат не вызывает свойственных мелфалану и тегафуру побочных эффектов.

Однако данные об исследовании влияния чистой нанодисперсной меди на рост опухолей in vivo в литературе отсутствуют.

Целью изобретения является определение противоопухолевой активности нанодисперсной меди на модели солидной перевиваемой опухоли крыс - саркомы 45.

Поставленная цель достигается тем, что порошок наночастиц (НЧ) меди, с диаметром частиц 40-100 нм, форма частиц близкая к сферической, суспендируют непосредственно перед введением в физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл, полученную взвесь вводят крысам-самцам с перевиваемой саркомой 45, разделенным на три группы, в первой группе суспензию НЧ меди вводят локально в опухоль в количестве 1,25 мг/кг, во второй группе суспензию НЧ меди вводят внутрибрюшинно в количестве 1,25 мг/кг, в третьей группе, являющейся контрольной, вводят физиологический раствор внутрибрюшинно, в количестве 0,3 мл на крысу. Взвесь порошка меди или физиологический раствор в контрольной группе вводят на 9-е, 10-е, 12-е и 13-е сутки перевивки опухоли, затем после пятидневного перерыва на 19-е, 20-е, 22-е и 23-е сутки перевивки, суммарная доза наночастиц меди в обеих экспериментальных группах составляет 10 мг/кг. На момент начала введения препаратов объем опухоли у всех животных достигал 0,65-1,0 см³ (в среднем 0,91 см³), забой животных производили на 29-е сутки после перевивки опухоли (через 5 дней после окончания введения НЧ), критериями оценки влияния НЧ меди на рост саркомы 45 являются: масса опухоли (М), объем опухоли (V); индекс эффективности (ИЭ), процент торможения роста опухоли (Т%), морфологические изменения в опухолевой ткани. Внутриопухолевое введение НЧ меди крысам с С-45 приводит к полной в 50% случаев или частичной в 25% случаев регрессии опухоли, внутрибрюшинное введение НЧ меди животным с С-45 приводит к полной регрессии опухоли в 50% случаев и в 50% случаев к появлению морфологических признаков частичной регрессии, в контрольной группе рост опухоли наблюдается у всех животных.

Изобретение «Способ определения влияния нанодисперсной меди на рост опухолей в эксперименте» является новым, так как оно не известно из уровня медицины при исследовании влияния наночастиц меди на рост перевиваемых опухолей.

Новизна изобретения заключается в том, что впервые был получен противоопухолевый эффект в эксперименте на перевиваемой опухоли крысы С-45 при внутриопухолевом и внутрибрюшинном введении наночастиц меди.

Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении при проведении экспериментальных исследований в онкологии при применении наночастиц меди с противоопухолевым эффектом в научно-исследовательских онкологических институтах.

«Способ определения влияния нанодисперсной меди на рост опухолей в эксперименте» выполняется следующим образом.

Порошок наночастиц (НЧ) меди (диаметр частиц 40-100 нм, форма частиц, близкая к сферической) суспендировали в физиологическом растворе, полученную взвесь вводили крысам локально в опухоль либо внутрибрюшинно. Однократная доза вводимого препарата составила - 1,25 мг/кг животного, суммарная - 10 мг/кг (доза восьмикратного введения).

Эксперимент проводился на нелинейных крысах-самцах весом 180-220 г с перевиваемой саркомой 45 (штамм получен из опухолевого банка НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН). Для индукции саркомы 45 взвесь опухолевых клеток (по 1×10⁶ клеток) в объеме 0,5 мл вводили крысам подкожно в область спины. После перевивки опухоли животные были разделены на три группы. Первая группа получала суспензию НЧ меди локально в опухоль, в количестве 1,25 мг/кг. Вторая группа получала суспензию НЧ меди внутрибрюшинно, в количестве 1,25 мг/кг. Третья группа служила контролем и получала физиологический раствор внутрибрюшинно, в количестве 0,3 мл на крысу. Порошок НЧ меди суспендировали в физиологическом растворе непосредственно перед введением, в концентрации 1 мг/мл. Доза вводимого препарата не превышает максимально переносимой дозы для данного металла (см. Федоров Ю.И. и соавт. К вопросу о возможности применения высокодисперсных порошков металлов для введения в организм животных. // Доклады Академии наук СССР. 1979. Т.248. №5. С.1277-1280; Глущенко Н.Н. и соавт. Физико-химические закономерности действия высокодисперсного порошка железа. // Материалы симпозиума «Применение биомагнитных носителей в медицине» (Москва, 19-20 ноября 2002 г.). М., 2002. С.86-94).

Взвесь порошка меди или физиологический раствор вводились на 9-е, 10-е, 12-е и 13-е сутки перевивки опухоли, затем после пятидневного перерыва наночастицы меди (или физиологический раствор) вводили на 19-е, 20-е, 22-е и 23-е сутки перевивки. На момент начала введения препаратов объем опухоли у всех животных достигал 0,65-1,0 см³ (в среднем 0,91 см³). Забой животных производили на 29-е сутки после перевивки опухоли (через 5 дней после окончания введения НЧ).

Критериями оценки влияния НЧ меди на рост саркомы 45 служили масса опухоли (М), объем опухоли (V); индекс эффективности (ИЭ); процент торможения роста опухоли (Т%); морфологические изменения в опухолевой ткани.

Объем опухоли рассчитывали по формуле Шрека: V=(а×b×с)×π/6, где а, b, с - линейные размеры опухоли (см), V - объем опухоли (см³) (см. Эммануэль Н.Н. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М.: Наука, 1977. 416 с.).

Индекс эффективности рассчитывали как отношение среднего значения массы опухоли в контроле к среднему значению массы опухоли в опыте: ИЭ=М_к/М_о.

Процент торможения роста опухоли оценивали по среднему объему или средней массе опухоли (Tv%, Tm%) в опытных группах по сравнению с контролем:

Tv%=[(Vк-Vo)/Vк]×100%, где Vк и Vo - средний объем (см³) опухоли в контрольной и опытной группах в конце эксперимента.

Tm%=[(Мк-Мо)/Мк]×100%, где Мк и Мо - средняя масса (г) опухоли в контрольной и опытной группах в конце эксперимента (см. Ларионов Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей. М.: Медгиз, 1962. С.30).

А) Влияние внутриопухолевого введения НЧ меди на рост саркомы 45.

Внутриопухолевое введение НЧ меди крысам с С-45 привело к полной - 50% случаев, или частичной - 25% случаев, регрессии опухоли. Как видно из таблицы, у животных контрольной группы данные показатели имели следующие значения: V ср. - 5,96 см³, М ср. - 7,54 г. В то же время средние значения объема и веса опухоли на момент забоя животных в группе с внутриопухолевым введением НЧ меди составили: V ср. - 2,63 см³, М ср. - 2,53 г. При этом у крыс с максимальной регрессией опухоли V ср. равнялся 0,43 см³, М ср. - 0,073 г, а у животных с частичной регрессией соответственно V ср.=3,24 см³, М ср.=3,0 г. Процент торможения роста опухоли в целом по группе составил: по массе опухолевого узла (Tm%) - 66,5%, по объему опухоли (Tv%) - 55,9%. Индекс эффективности воздействия НЧ меди составил 2,98. Морфологические исследования препаратов, полученных от животных с полным рассасыванием опухоли, показали, что во всех полях зрения наблюдается замещение соединительной тканью рассосавшейся опухоли, со значительной ее инфильтрацией лимфоидными, плазмоцитарными и макрофагальными элементами. В тех случаях, когда отмечалась частичная регрессия опухоли, на препаратах в большинстве полей зрения (2/3) наблюдали редко расположенные опухолевые клетки (С-45), часть их была дистрофически изменена, а большая часть подвергалась некрозу (видны обширные участки некроза). В отдельных группах опухолевых клеток, до 3-5 в поле зрения, обнаруживались фигуры митоза, в том числе атипичные. При этом даже в опухолевых препаратах, полученных от животных с продолжающимся ростом С-45, у которых в большинстве полей зрения наблюдались фигуры митоза, местами (1/4 полей зрения) отмечались участки редко расположенных дистрофически измененных опухолевых клеток и очаги их некроза.

На препаратах опухолей животных из контрольной группы во всех полях зрения наблюдался рост опухоли, с плотным расположением клеток и с множественными фигурами митоза (до 10-12 в поле зрения), в том числе атипичными.

Б) Влияние внутрибрюшинного введения НЧ меди на рост саркомы 45.

Внутрибрюшинное введение НЧ меди животным с С-45 привело к полной регрессии опухоли в 50% случаев и в 50% случаев к частичной регрессии. В таблице приведены результаты оценки воздействия НЧ меди на рост опухоли. Из представленных данных видно, что средний объем опухоли составил - 2,2 см³, средняя масса - 4,57 г (в том числе при полной регрессии V cp.=0,01 см³, М ср.=0,072 г). Процент торможения роста опухоли составил: по массе опухоли (Tm%) - 46,4%, по объему опухоли (Tv%) - 63,1. Индекс эффективности составил 1,86. В случаях полного рассасывания опухоли морфологическая картина была идентична картине, полученной при внутриопухолевом введении НЧ меди. При морфологическом исследовании препаратов, полученных от животных с частичной регрессией опухоли, лишь в 1/2 полей зрения наблюдали рост опухоли с митотическими фигурами деления, остальные участки были представлены дистрофически измененной или некротизированной опухолью. Внимание обращало то, что даже в участках роста, с наличием фигур митоза, большинство опухолевых клеток располагались редко, часть их была дистрофически изменена. Кроме того, наблюдалась активация клеток иммунной системы, инфильтрирующих (местами значительно) соединительно-тканную кайму периферических участков опухоли.

  Влияние наночастиц меди на рост солидной перевиваемой опухоли крыс саркомы 45 Группа животных Масса опухоли (г) M±m Объем опухоли (см³) M±m Tm, % Tv, % ИЭ Контрольная группа n=10 7,54±0,59 5,96±0,77 - - - Внутриопухолевое введение НЧ меди n=8 2,53±0,93 2,63±0,74 66,5 55,9 2,98 Р=0,0004 Р=0,006 Внутрибрюшинное введение НЧ меди n=8 4,57±1,73 2,2±0,66 46,4 63,1 1,86 Р=0,09 Р=0,0019

Технико-экономическая эффективность "Способа определения влияния нанодисперсной меди на рост опухолей в эксперименте" заключается в том, что внутриопухолевое и внутрибрюшинное введение наночастиц меди крысам с С-45 приводит к полной в 50% случаев или частичной в 25% случаев регрессии опухоли при незначительном различии результатов в зависимости от метода введения. Процент торможения роста опухоли в целом по группе составил: по массе опухолевого узла (ТМ%) - 66,5%, по объему опухоли в целом по группе (ТУ%) - 55,9%. Индекс эффективности воздействия Н.Ч. меди составил 2.98. Морфологические исследования препаратов, полученных от животных с полным рассасыванием опухоли, показали, что во всех полях зрения наблюдается замещение соединительной тканью рассосавшейся опухоли, со значительной ее инфильтрацией лимфоидными, плазмоцитарными и мекрофагальными элементами. Влияние воздействия НЧ меди на рост опухоли: средний объем опухоли составил - 2,2 см, средняя масса - 4.57. Процент торможения роста опухоли составил: по массе опухоли (ТМ%) 46,4%, по объему опухоли (ТУ%) 63,1. Индекс эффективности составил 1.86.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии. Для определения влияния нанодисперсной меди на рост опухолей в эксперименте вводят суспензию наночастиц меди, в концентрации 1 мг/мл, в физиологическом растворе восьмикратно в разовой дозе 1,25 мг/кг, суммарная доза 10 мг/кг крысам-самцам с перевиваемой саркомой 45, разделенным на три группы. В первой группе введение осуществляют локально в опухоль, во второй группе - внутрибрюшинно, в третьей - контрольной - группе вводят физиологический раствор в количестве 0,3 мл на крысу. Введение осуществляют на 9-е, 10-е, 12-е, 13-е, 19-е, 20-е, 22-е и 23-е сутки перевивки; забой животных производят на 29-е сутки после перевивки опухоли. Определяют влияние нанодисперсной меди на рост опухолей по следующим критериям - масса опухоли, объем опухоли, индекс эффективности, процент торможения роста опухоли, морфологические изменения в опухолевой ткани. Способ позволяет определить влияние нанодисперсной меди на рост перевиваемой саркомы - 45. 1 табл.

Способ определения влияния нанодисперсной меди на рост опухолей в эксперименте, включающий введение суспензии наночастиц меди, в концентрации 1 мг/мл, в физиологическом растворе восьмикратно в разовой дозе 1,25 мг/кг, суммарная доза 10 мг/кг крысам-самцам с перевиваемой саркомой 45, разделенным на 3 группы: в первой группе введение осуществляют локально в опухоль, во второй группе -внутрибрюшинно, в третьей - контрольной группе, вводят физиологический раствор в количестве 0,3 мл на крысу, причем введение осуществляют на 9-е, 10-е, 12-е, 13-е, 19-е, 20-е, 22-е и 23-е сутки перевивки; забой животных производят на 29-е сутки после перевивки опухоли; и определяют влияние нанодисперсной меди на рост опухолей по следующим критериям: масса опухоли, объем опухоли, индекс эффективности, процент торможения роста опухоли, морфологические изменения в опухолевой ткани.