СПОСОБ СОВМЕСТНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ХИТИН-ГЛЮКАНОВОГО КОМПЛЕКСА И ПОЛИМЕРОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГЛЮКОЗУ, МАННОЗУ И/ИЛИ ГАЛАКТОЗУ, ПУТЕМ ФЕРМЕНТАЦИИ ДРОЖЖЕЙ Pichia pastoris Российский патент 2015 года по МПК C12P19/04 C12P1/02 C08B37/08 C12N1/16 C12R1/84 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу микробиологического получения в больших количествах хитина и полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу, и их производных с применением дешевых исходных материалов. Поэтому описывается способ получения, основанный на культивации в биореакторе при высокой плотности клеток дрожжей Р.pastoris с применением глицеринового побочного продукта производства биодизеля в качестве предпочтительного источника углерода.

Указанные биополимеры широко применяются в переработке сельскохозяйственных пищевых продуктов, косметической, биомедицинской, текстильной промышленности, при очистке сточных вод, а также в других промышленных, производственных и медицинских областях.

Предшествующий уровень техники

Полимеры являются молекулами с высокой молекулярной массой, образованными путем полимеризации одной или нескольких структурных единиц, называемых мономерами. Полимеры, образованные углеводными мономерами (моносахаридами), называют полисахаридами. Более мелкие молекулы (олигосахариды) могут образовываться из последних путем химического или ферментативного частичного гидролиза.

Хитин является линейным полисахаридом, состоящим из остатков D-глюкозамина (GlcN) и N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc), соединенных β-(1-4) связями (см. схему, где (1) и (2) обозначают GlcN и GlcNAc соответственно). Молекулы хитина образуют межмолекулярные водородные связи, давая в результате три различные кристаллические формы, в зависимости от их взаимного расположения. α-Хитин, являющийся самой распространенной и стабильной формой, характеризуется антипараллельным расположением цепей, в то время как β-хитин образуется параллельными слоями. Самая редко встречающаяся форма - γ-хитин характеризуется наличием одной антипараллельной и двух параллельных цепей.

Водородные связи обусловливают низкую растворимость хитина как в воде, так и в большинстве органических растворителей. Растворы кислот или щелочей вызывают гидролиз полимеров и деацетилирование и, следовательно, не подходят для их растворения. Водородные связи также обусловливают кажущееся отсутствие температуры плавления, а также высокую жесткость полимера и низкую проницаемость материалов из хитина.

Физико-химические свойства хитина также тесно связаны с соотношением двух структурных мономеров. Когда молярная доля GlcN в полимере (называемая степенью деацетилирования, %DD) выше 50%, полимер называют хитозаном, основным производным хитина. Из-за более низкого содержания ацетильных групп хитозан растворим в слабых кислотах, имеет свойства полиэлектролита и более высокую реакционную способность. Хитозан обычно получают путем деацетилирования хитина.

Благодаря этим свойствам хитозан в настоящее время находит больше применений, чем хитин. Его высокая удельная связывающая способность применяется для удаления масел, тяжелых металлов, белков и мелких твердых частиц из сточных вод (Неппеп, 1996). То же свойство позволяет применять его в аффинной хроматографии (Synowiecki et al., 2003) и для снижения поглощения холестерина. Хитозан проходит через пищеварительный тракт человека и, связывая холестерин низкой плотности, ограничивает его поступление в кровоток (ICNHP, 1995; Неппеп, 1996).

В пищевой промышленности хитозан в основном применяют для покрытия яиц и фруктов (Неппеп, 1996; Kim et al., 2007), при этом он действует как барьер для диоксида углерода и патогенных микроорганизмов, увеличивая таким образом срок хранения пищевых продуктов. Он также применяется в качестве эмульгатора, консерванта и осветляющего средства для напитков (Kim, 2004; Synowiecki et al, 2003). Хитозан также применяют в косметических средствах, а именно в средствах для ухода за волосами, благодаря его высокой стабильности и низким электростатическим свойствам (Kim, 2004).

Биомедицинское применение хитозана стало еще более существенным благодаря биосовместимости и способности к биодеградации его производных, что позволяет применять его, помимо прочего, при лечении ран (Hamliyn et al., 2004; Tanabe et al., 2006; Singh et al., 2000), в качестве тканевого матрикса (Tangsadthakun et al., 2007), систем высвобождения лекарственных средств (Singh et al., 2000).

Основные области применения хитина включают его применение в качестве шовного материала (Hamliyn etal., 2004; Okada et al., 2000; Singh et al., 2000), в качестве антигена у животных, инфицированных бактериями или грибами (Singh et al., 2000) или как усилитель образования хитиназы в почвах, населенных организмами, имеющими хитин в своих клеточных стенках (Okada et al., 1999; Hallman et al., 1999). Он также применяется для производства воздухопроницаемых текстильных изделий, таких как носки (ICNHP, 1995).

В отличие от синтетических полимеров хитин и хитозан способны к биодеградации, что делает их применение благоприятным для окружающей среды.

Помимо хитозана, к производным хитина относятся полисахариды, в которых С6-гидроксильная группа остатка GlcNAc замещена другими радикалами, такими как, например, алкильная или карбоксильная группы. Внедрение этих новых радикалов повышает функциональность полимеров, делая возможным разработку новых применений, таких как новые волокна, гели и т.п.

Вслед за целлюлозой хитин является вторым самым распространенным природным биополимером. Его в основном обнаруживают в кутикуле и панцире организмов типов Arthropoda и Crustacea и в клеточной стенке дрожжей и грибов. В данных организмах хитин придает клеткам жесткость и механическую прочность и играет важную роль при мейозе (Keller et al., 1970; Momany et al., 1997). Присутствие хитина или любого из его производных до настоящего времени не было обнаружено у бактерий или у грибов Myxomycetes. Хитин, экстрагированный из ракообразных или членистоногих, является более жестким и имеет более высокую степень деацетилирования, чем хитин микроорганизмов.

Большую часть коммерчески доступных хитина и его производных получают из панцирей ракообразных, таких как крабы, креветки и омары. Процесс экстракции обычно включает три стадии: деминерализацию, удаление белков и липидов и отбеливание. Первую стадию проводят путем смешивания панцирей с кислотой (обычно НСl), в то время как удаление белков и липидов проводят в щелочной среде (NaOH или КОН) в присутствии этанола.

Удаление пигментов (особенно каротиноидов) достигается промыванием органическими растворителями, такими как ацетон, хлороформ или смеси этанола с эфирами.

Тем не менее, сезонный характер данного исходного материала и вариабельность состава панцирей в зависимости от вида и возраста животного делает этот способ довольно дорогим и имеющим низкую воспроизводимость. Жесткость наружных скелетов таких видов, как омары и крабы, также усложняет экстракцию и делает ее более дорогой. Более того, поскольку хитин, экстрагированный из панцирей ракообразных, имеет животное происхождение, его применение в фармацевтической и биомедицинской областях существенно ограничено инструкциями Федерального управления США по контролю качества продуктов питания, напитков и лекарственных препаратов (FDA-Food and drug administration). Кроме того, присутствие белков и загрязнителей, поглощенных животным, также осложняет очистку хитина. Из-за возможности аллергических реакций полимеры, экстрагированные из ракообразных, менее пригодны для биомедицинских применений.

В то время как хитин членистоногих и ракообразных агрегирован с белками и минералами панциря (в основном с солями кальция), в микроорганизмах он ассоциирован с другими полисахаридами клеточной стенки. Редуцирующие окончания его цепей соединены с нередуцирующими концами β-(1,3)-глюканов (полимеров глюкозы), которые соединены с β-(1,6)-глюканами, галактоманнанами (полимерами, образованными остатками галактозы и маннозы) и гликопротеинами. Состав клеточной стенки зависит от штамма, а также варьирует в зависимости от фазы роста организма.

Изменение условий ферментации, таких как состав и концентрация среды (т.е. доступность субстрата), температура или концентрация растворенного кислорода (Aguilar-Uscanga et al., 2003), может привести к изменению относительного содержания каждого из компонентов клеточной стенки.

Микробиологическое получение хитина позволяет примененять недорогие исходные материалы с практически неограниченной доступностью и непрерывную оптимизацию способа. Адаптация клеточной стенки к условиям окружающей среды может быть успешно использована для оптимизации способа. Действительно, ранее было продемонстрировано, что получение хитина с помощью ферментации может быть усовершенствовано путем добавления в среду конкретных ионов и предшественников для ферментативного синтеза хитина (Camargo et al., 1967; Keller et al., 1970). Как состав, так и свойства полимеров также более стабильны, чем у полимеров, полученных традиционным методом экстракции из ракообразных.

В настоящее время не существует оптимизированного протокола для получения хитина с применением микроорганизмов, за исключением случаев применения генетически измененных организмов (Hammer et al., 2006). Большую часть коммерчески доступного микробного хитина экстрагируют из Saccharomyces carlsbergensis, применяемого в пивоваренной промышленности, или Aspergillus niger, применяемого в производстве лимонной кислоты (Versali et al., 2003). В последнем случае хитин может составлять до 42% клеточной стенки микроорганизма. Тем не менее, погруженные культуры Aspergillus niger не достигают такой высокой плотности клеток, как плотность, достигаемая некоторыми дрожжами. С другой стороны, образование хитина видами рода Saccharomyces не превышает 8% сухой массы клетки. Также могут быть использованы отходы культуры некоторых съедобных грибов, таких как Agaricus bisporus и A. campestris (GB2259709), но в них содержание хитина не превышает 8% сухой массы организма.

Pichia pastoris являются голосумчатыми грибами (Hemiascomycetes), дрожжами рода сахаромицетов (Saccharomycetes), обычно применяемыми для экспрессии гетерологичных белков. Главное преимущество данного вида над другими микроорганизмами, применяемыми для получения хитина, является то, что он достигает высокой плотности клеток во время ферментации на широком спектре субстратов, включая глюкозу, метанол или неочищенный глицерин, сохраняя при этом высокое процентное содержание хитина в клеточной стенке. Более того, глицерин является дешевым побочным продуктом биодизельной промышленности, доступным в больших количествах и, как сообщается, эффективно применяемым для роста Р.pastoris (Qelik et at., 2008). Таким образом, применение глицеринового побочного продукта биодизельной промышленности для образования хитина и хитозана Р.pastoris может являться способом его валоризации. Более того, снижаются эксплуатационные затраты, так как нет необходимости применять для роста культуры высокие концентрации растворенного кислорода.

В настоящее время не имеется в наличии сообщений о применении Pichia pastoris для промышленного получения биополимеров, которые являются объектами настоящего изобретения.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение описывает применение дрожжей Pichia pastoris в качестве организмов-продуцентов полисахаридов клеточной стенки, таких как хитин, полимеры, содержащие глюкозу, маннозу и/или галактозу, или их производных с применением дешевых субстратов, таких как глицериновый побочный продукт биодизельной промышленности.

Организмы, применяемые для этой цели, могут являться штаммами Pichia pastoris дикого типа, их вариантами или мутантами, или штаммами, созданными с помощью генетической инженерии, либо конститутивными, либо утилизирующими метанол (УМШ) штаммами для экспрессии гетерологичных белков, например, для экспрессии ферментов, применяемых в последующем способе.

Выработка этих полисахаридов тесно связана с клеточным ростом микроорганизмов. Таким образом, способ был оптимизирован для достижения высокой скорости роста клеток и высокой плотности клеток с целью сделать получение хитина или хитозана из Р.pastoris экономически оправданным.

В этой связи настоящее изобретение описывает способ получения полисахаридов клеточной стенки, содержащих глюкозамин, глюкозу, галактозу и/или маннозу, путем аэробной ферментации Pichia pastoris с применением в качестве предпочтительного источника углерода глицеринового побочного продукта биодизельной промышленности. Альтернативные источники углерода включают чистый глицерин, метанол и глюкозу или их смеси.

Применение дешевого глицеринового побочного продукта в качестве основного источника углерода является важным преимуществом, так как это позволяет снизить стоимость получения по сравнению с другими высокочистыми и более дорогими субстратами. Объемная продуктивность способа может быть максимизирована путем применения способа ферментации, проводимого в непрерывном режиме и предпочтительно проводимого под давлением для увеличения емкости переноса кислорода, что позволяет достичь более высокой плотности клеток.

Во время ферментации Р.pastoris концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне выше 5% от насыщающей концентрации. Данный параметр контролируют путем добавления источника углерода, что может быть осуществлено непрерывно или полунепрерывно. Таким образом достигают высокой плотности клеток, избегают анаэробных условий и достигают максимальной метаболической активности.

Экстракция полисахаридов, полученных во время ферментации, может быть осуществлена любым описанным в литературе способом экстракции полимеров из клеточной стенки грибов или дрожжей (например, Synowiecki et al, 2.003). Химический способ, примененный в настоящем изобретении, помимо образования смеси полисахаридов, богатой хитином, обеспечивает получение различных фракций других полисахаридов, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу, которые могут быть применены в производстве сельскохозяйственных пищевых продуктов и биомедицине.

Процесс химической экстракции создает определенный риск деградации полимеров. По другому варианту может быть применен способ ферментативной экстракции с применением протеаз и лизоцима для деградации белкового материала и глюкана клеточной стенки соответственно. Хотя они являются менее загрязняющими методами, их недостаток состоит в относительно высокой стоимости.

Фигура 1 - Профиль сухой массы клеток Pichia pastoris во время ферментации с применением чистого глицерина (99%) или глицеринового побочного продукта (86%) биодизельной промышленности в качестве источников углерода.

Подробное описание изобретения

1. Получение полимеров

1.1. Микроорганизмы

Настоящее изобретение относится к получению хитина и полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу, а также их производных ферментацией штаммов Pichia pastoris дикого типа, их вариантов и мутантов.

1.2. Среда для ферментации - ферментация Pichia pastoris осуществляется в водной среде, содержащей источник углерода, источник азота и неорганические соли.

Источником углерода предпочтительно является богатая глицерином смесь, производимая биодизельной промышленностью. Также могут быть использованы чистый глицерин, метанол, глюкоза или их смеси. По другому варианту, P. pastoris способны расти на некоторых других соединениях, включая спирты, сахара, органические кислоты, жирные кислоты или аминокислоты в их мономерной, димерной или олигомерной формах.

Все данные субстраты могут являться чистыми веществами или, предпочтительно, происходить из отходов сельскохозяйственной промышленности или побочных продуктов, например, биодизельной промышленности. Используется источник азота, отличный от дрожжевого экстракта и пептона, предпочтительно аммиак, но могут быть использованы соли аммония или органические азотсодержащие соединения (например, мочевина).

Среда для ферментации также включает соли, содержащие ионы (например, Са²⁺, К⁺, Mg²⁺, SO4^2-, РО4^3-) и следовые количества металлов, таких как кобальт, медь, марганец и железо.

Описанная среда приводится исключительно для иллюстрации широкого разнообразия субстратов, которые могут применяться для роста P. pastoris, и не должна восприниматься как ограничительная.

1.3. Условия ферментации

Настоящее изобретение относится к любому способу или протоколу получения полисахаридов клеточной стенки, таких как хитин, полимеры, содержащие глюкозу, маннозу и/или галактозу, или их производные, с применением ферментации Pichia pastoris. В частности, настоящее изобретение описывает некоторые методологии, которые способствуют росту Р.pastoris с достижением высокой плотности клеток и высокого содержания хитина/голюкана в клеточной стенке микроорганизма.

Ферментацию осуществляют в водной среде при аэрации сжатым воздухом. Значение температуры контролируют от 10 до 60°C, предпочтительно от 20 до 40°C, и значение рН контролируют от 1,0 до 10,0, предпочтительно от 3,0 до 8,0, с помощью автоматической подачи щелочи (например, NaOH, КОН или NН₃). При применении аммиака или гидроксида аммония они также служат источниками азота.

Концентрация растворенного кислорода в ферментационном бульоне постепенно снижается по мере роста клеток. Данное снижение определяется специфичной для штамма скоростью роста. Недостатка кислорода избегают путем изменения скорости перемешивания, скорости потока воздуха, давления, температуры и/или скорости подачи источника углерода в соответствии с емкостью и рабочими размерами биореактора.

Для достижения высокой плотности клеток режим действия может быть непрерывным или полунепрерывным и может иметь начальную периодическую стадию.

Если способ начинается в режиме периодического культивирования, по достижении источником углерода ограничивающих скорость роста концентраций начинается подпитка ферментационного бульона и затем, предпочтительно, поддерживается экспоненциальная скорость подпитки до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода не достигнет критического порогового значения, определенного ранее на основе свойств реактора. Раствор для подпитки состоит из источника углерода и 2 объем. % солевого раствора. Если рН контролируют с помощью основания, отличного от аммиака, раствор для подпитки должен содержать источник азота в том же соотношении углерода и азота, что и в начальной культуральной среде (приблизительно 3:1).

Образование полисахаридов клеточной стенки ассоциировано с ростом. Таким образом, ферментация в полунепрерывном режиме прекращается по достижении культурой стационарной фазы роста. Если способ осуществляют в непрерывном режиме, скорость разбавления поддерживают близкой по значению к значению порога вымывания до тех пор, пока концентрация растворенного кислорода не падает до 0%.

Выработка хитина и хитозана может изменяться от 10 до 40 г/л и до 10 г/л соответственно. Данные значения изменяются в соответствии с достигнутой плотностью клеток, которая обычно составляет более 150 г/л. Содержание хитина/хитозана в биомассе может быть увеличено путем продления ферментации в условиях, благоприятствующих их образованию независимо от роста клеток. Такие условия включают повышение температуры (до 30°С), рН (от 5 до 8) или ионной силы во время стационарной фазы роста.

Имея отношение к получению хитина/хитозана, способ по настоящему изобретению также предполагает совместное получение полисахаридов клеточной стенки, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу, которые могут составлять до 45% сухой массы клеток.

2. Экстракция и очистка продуктов ферментации

Протоколы, которые могут быть применены для экстракции и очистки полисахаридов, описанных в настоящем изобретении, описаны далее.

Клетки отделяют от ферментационного бульона путем фильтрации, декантации или центрифугирования, причем последний способ является самым эффективным.

Клетки, отделенные предпочтительно центрифугированием, подвергают обработке раствором щелочи (рН выше 10,0) для удаления липидов, белков и нуклеиновых кислот. Белки и нуклеиновые кислоты деградируют при воздействии высоких концентраций сильного основания (NaOH или КОН), в то время как липиды удаляют воздействием органических растворителей (например, этанола, метанола, ацетона) или детергентов. Данные процедуры занимают от 30 минут до 3 часов в зависимости от температуры (65-90°С) и могут осуществляться последовательно или одновременно, что делает способ менее дорогим и повышает его производительность.

Полученный таким образом нерастворимый материал в основном состоит из неорганического материала, хитина и его производных и других нерастворимых полисахаридов, таких как глюканы и маннаны. Растворимые полисахариды, а именно сильно разветвленные β-глюканы и α-1,3-глюканы и галактоманнаны (полимеры, состоящие из остатков маннозы и галактозы), остаются в надосадочной жидкости.

После центрифугирования и промывки водой и этанолом (или другими органическими растворителями, такими как метанол, диэтиловый эфир или ацетон) хитин отделяют от других нерастворимых полисахаридов. Для этого осуществляют частичный гидролиз уксусной кислотой (или другой слабой кислотой) при температуре выше 75°С или разбавленной НС1 (или другой неорганической кислотой) при температуре 50°С. Данная процедура позволяет растворить некоторые разветвленные β-1,6-глюканы, которые не были экстрагированы ранее. Большую часть глюканов извлекают щелочной экстракцией с последующим центрифугированием для извлечения нерастворимой фракции, содержащей хитин.

Нерастворимый материал суспендируют в горячей сильной щелочи (NaOH) для растворения глюканов, растворимых в щелочи. Температура должна быть выше 20°С, но ниже 75°С для предотвращения деградации хитина.

Нерастворимый материал извлекают центрифугированием и тщательно промывают водой и этанолом (или другим органическим растворителем). Затем хитозан экстрагируют растворением в 2 объем.% уксусной кислоте и отделяют центрифугированием. Хитозан остается в надосадочной жидкости, в то время как осадок содержит хитин и другие нерастворимые полимеры. Хитозан осаждают доведением до рН 6,0 и извлекают центрифугированием.

Осадок, содержащий хитин и другие нерастворимые полимеры (хитин-глюкановый комплекс), растворяют в 5% растворе хлорида лития в диметилацетамиде (ДМАА) или в диметилсульфоксиде (ДМСО). Раствор выдерживают при постоянном перемешивании в течение не менее чем 12 часов для полного растворения полимеров. После центрифугирования для удаления нерастворившегося материала хитин-глюкановый комплекс осаждают добавлением воды. Раствор в ДМАА (или ДМСО) смешивают с водой несколько раз до прекращения образования осадка. Экстрагированный хитин-глюкановый комплекс тщательно промывают водой для полного удаления растворителя. Заключительная стадия состоит из высушивания при температуре до 60°С или лиофилизации.

По другому варианту могут быть применены более жесткие условия обработки сильной щелочью, что позволит достичь полного деацетилирования хитина с превращением в хитозан. Эти жесткие условия включают повышение температуры до 128°C, применение щелочи в концентрации 15 Н или увеличение времени реакции до 7 часов.

Описанные выше способы экстракции и очистки приводят в результате к образованию нескольких фракций других полимеров, помимо хитин-глюканового комплекса. Данные полимеры в основном являются полисахаридами, состоящими из остатков глюкозы, маннозы и/или галактозы.

Растворимые в щелочи глюканы клеточной стенки в основном содержат β-(1,3) и β-(1,6)-гликозидные связи. Их экстрагируют растворением в растворе щелочи с последующим извлечением путем осаждения в несмешивающихся растворителях или путем диализа, в результате чего получают примерно 4% растворимых в щелочи глюканов.

Примеры

Пример 1: Ферментация Pichia pastoris в глицерине

14,25 л среды для ферментации с составом, описанным в таблице 1, инокулировали 750 мл культуры Pichia pastoris DSMZ 70877. Ферментацию проводили в биореакторе для опытных партий (LP351, 50 L, BioEngineering, Швейцария) с контролируемыми температурой и pH (30°C и 5,0 соответственно). В течение всего времени эксперимента поддерживали скорость потока воздуха на уровне 30 л/мин и давление на уровне 0,10 бар. pH контролировали добавлением гидроксида аммония. Гидроксид аммония является также и источником азота. Начальная скорость перемешивания равнялась 300 оборотам в минуту.

После 30 ч ферментации концентрация растворенного кислорода (рО₂) упала до 50%. Начиная с данной временной точки, рО₂ поддерживали на уровне 20%, увеличивая скорость перемешивания вплоть до 1000 оборотов в минуту. Когда скорость перемешивания достигла 440 оборотов в минуту, в биореактор начали подачу раствора, содержащего глицерин (990 г/л), и 24 г/л минерального раствора, описанного в таблице 1. Скорость подачи была экспоненциальной и вычислялась в соответствии с предполагаемой скоростью роста клеток.

Таблица 1 Состав среды для ферментации Компонент Концентрация (г/л) CaSO₄·2H₂O 0,93 K₂SO₄ 18,20 МgSO₄·7Н₂O 14,90 КОН 4,13 Глицерин (99%) 40,00 Антивспениватель 0,40 Н₃РO₄ (85%) 26,70 мл Минеральный раствор* 4,35 мл (*состав минерального раствора: 6,0 г/л CuSO₄·5H₂O, 0,08 г/л Nal, 3,0 г/л MnSO₄·Н₂O, 0,2 г/л Na₂MoO₄·2H₂O, 0,02 г/л Н₃ВО₃, 0,5 г/л CoCl₂, 20,0 г/л ZnCl₂, 65,0 г/л FeSO₄·7H₂O, 0,2 г/л биотина, 5,0 мл/л H₂SO₄)

По достижении максимальной (1000 оборотов в минуту) скорости перемешивания (примерно 44 часа ферментации) pO₂ поддерживали на уровне 20% с помощью ограничения субстрата. Скорость добавления раствора для подпитки постоянно корректировали таким образом, чтобы pO₂ не падал ниже 20%.

Через 70 ч ферментации культура достигла стационарной стадии роста и эксперимент был закончен. Клетки отделяли центрифугированием ферментационного бульона (8000 оборотов в минуту, 45 минут) и лиофилизировали. Из каждого литра ферментационного бульона было получено 237 г клеток.

Пример 2: Получение хитин-глюканового комплекса ферментацией Pichia pastoris в глицериновом побочном продукте биодизельной промышленности

Протокол, описанный в примере 1, применяли для выращивания Pichia pastoris DSMZ 70877. Чистый глицерин заменили глицериновым побочным продуктом биодизельной промышленности, содержащим 86% глицерина. Скорости подачи раствора для подпитки были скорректированы с учетом нового состава субстрата. Изменение сухой массы клеток для обоих экспериментов представлено на фигуре 1.

По окончании ферментации было получено 224 г/л биомассы. Стационарная фаза роста была достигнута примерно на 6 ч раньше, чем при ферментации с чистым глицерином.

С применением способа экстракции, предложенного Synowiecki et at. (2003), получили 0,352 г хитин-глюканового комплекса, что соответствует 11,7% биомассы Р.pastoris. С учетом плотности клеток, достигнутой к концу ферментации, выход полимера был равен 8,99 кг/м³·день.

С применением ферментативного набора для анализа глюкана (K-YBG, Megazyme) определили содержание глюканов в биомассе равным 14%, в то время как экстрагированный хитин-глюкановый комплекс содержал 38,2% глюканов. Единственными мономерами сахаров, обнаруженными с помощью жидкостной хроматографии после кислотного гидролиза, были глюкоза и глюкозамин. Таким образом, экстрагированный хитин-глюкановый комплекс содержал 9% хитина, 1% влаги, 4% золы и 6% белков.

С учетом данных результатов был сделан вывод о том, что содержание хитина в биомассе, полученной по примеру 2, составило 3%.

Ссылки

Aguilar-Uscanga В, Francois J (2003) Lett AppI Microb, 37, 268-274.

Camargo E, Dietrich C, Sonnenborn D, Strominger J (1967) J Вiоl Chem, 242(13), 3121-3128.

Celik E, Ozbay N, Oktar N, Calik P (2008), Ind Eng Chem Res. 47(9), 2985-2990.

Freimund S, Janett S, Arrigoni E, Amado R (2005) European Food Research and Technology, 220(1), 101-105.

Hallmann J, Rodriguez-Kabana R, Kloepper J (1999) So// Biol Biochem, 31, 551-560.

Hamlyn F, Schmidt R (1994) Mycologist, 8(4), 147-152.

Hennen W (1996) Woodland Publishing Inc, Utah, EUA.

ICNHP (1995) International Commission on Natural Health Products, Georgia, EUA.

Keller F, Cabib E (1970) J Вiоl Chem, 246(1), 160-166.

Kirn S (2004) Department of Food Science, Louisiana State University, EUA.

Kirn S, No H, Prinyawiwatkul W (2007) J Food Sci, 72(1), 44-48.

MacMurrough I, Rose A (1967) Biochem J, 105, 189-203.

Momany M, Hamer J (1997) Cell Mot Cytoskel, 38, 373-384.

Singh D, Ray A (2000) Polymer Reviews, 40(1), 69-83.

Synowiecki J, AI-Khateeb N (2003) Crit Rev Food Sci Nutr, 43(2), 145-171.

Tanabe S, Okada M, Jikumaru Y, Yamane H, Kaku H, Shibuya N, Minami E (2006) Biosci Biotechnol Biochem, 70, 1599-1605.

Tangsadthakun С, Kanokpanont S, Sanchavanakit N, Pichyangkura R, Banaprasert T, Tabata Y, Damrongsakkul S (2007) J Biomater Sci Polymer Edn,(18)2, 147-163.

Vetter J (2007) Food Chemistry, 102(1), 6-9.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения хитин-глюканового комплекса и полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу. Способ включает ферментацию дрожжей Pichia pastoris DSMZ 70887 в культуральной среде, содержащей источник азота, отличный от дрожжевого экстракта или пептона, и источник углерода. В качестве источников углерода могут быть использованы чистый глицерин, чистый метанол, богатые глицерином или богатые метанолом смеси. При этом во время ферментации поддерживают pH в диапазоне 5,0 - 7,0 путем добавления щелочи, аммиака или соли аммония. Изобретение позволяет оптимизировать ферментацию Pichia pastoris для достижения высокой плотности клеток и высокого содержания хитина в клеточных стенках, а также полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу. 19 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

1. Способ получения
- хитин-глюканового комплекса, содержащего хитин и глюкан; и
- полимеров, содержащих глюкозу, маннозу и/или галактозу, причем способ включает следующие стадии:
- ферментацию Pichia pastoris DSMZ 70887 в культуральной среде, содержащей источник азота, отличный от дрожжевого экстракта или пептона, и дополнительно содержащей в качестве источника углерода:
а) спирт, сахар, органическую кислоту, жирную кислоту и/или аминокислоту в мономерной, димерной или олигомерной формах, или
б) пищевые или промышленные отходы или побочный продукт, производимый биодизельной промышленностью, содержащие по меньшей мере одно из соединений, выбранных из группы, содержащей спирт, сахар, органическую кислоту, жирную кислоту и/или аминокислоту,
- и добавление щелочи, аммиака или соли аммония для контроля pH во время ферментации, составляющего от pH 5,0 до pH 7,0.

2. Способ по п. 1, где источник углерода в культуральной среде представляет собой побочный продукт, производимый биодизельной промышленностью, содержащий по меньшей мере одно из соединений, выбранных из группы, содержащей спирт, сахар, органическую кислоту, жирную кислоту и/или аминокислоту.

3. Способ по п. 2, где побочный продукт, производимый биодизельной промышленностью, является богатым метанолом, богатым глицерином или смесью глицерина и метанола.

4. Способ по любому из пп. 2-3, где побочный продукт, производимый биодизельной промышленностью, является по меньшей мере 86% глицерином или 100% метанолом.

5. Способ по любому из пп. 2-3, где побочный продукт, производимый биодизельной промышленностью, является по меньшей мере 99% глицерином.

6. Способ по п. 1, где температура во время ферментации составляет от 20 до 40ºC.

7. Способ по п. 6, где температуру во время ферментации контролируют на уровне 30ºC.

8. Способ по п. 1, где pH во время ферментации контролируют на уровне pH 5,0.

9. Способ по п. 1, где полимеры, полученные во время ферментации, включают в дополнение к хитин-глюкановому комплексу полимер, который представляет собой растворимые полисахариды глюкозы, маннозы и/или галактозы.

10. Способ по п. 1, где полимеры, полученные во время ферментации, включают полисахариды глюкозы, маннозы и/или галактозы в количестве до 45% от сухой массы клеток.